关键词： 马铃薯   逆向转运蛋白基因   耐盐基因   基因工程育种  

摘要： 土壤盐渍化已成为危害农作物生长、土壤荒漠化和自然生态环境恶化的主要原因之一。由于许多农作物是非耐盐的甜土植物，缺乏有效的耐盐机制，致使它们在盐渍化土壤上不能正常生长，甚至死亡。因此，培育具有经济价值的耐盐作物新品种，使其在盐渍化土壤上生长或在改良后的盐渍化土壤上生长，是有效利用广袤盐荒地的最佳途径。\n 随着植物耐盐机理深入探知，特别是耐盐相关基因的分离和功能的认知以及基因工程育种技术的成熟，开辟了培育耐盐植物品种的新途径，陆续获得了一些靠传统方法而不能获得的耐盐植物新品种(品系)，在盐渍化土壤的利用上发挥着作用。植物细胞对盐胁迫的适应性主要是通过在细胞质中积累有机溶质、离子在液泡内区隔化和将过多的Na+通过质膜向细胞外排放等几方面的作用来实现的，其中Na+的外排和区隔化是通过质膜或液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白来完成的，特别是Na+的区隔化可将进入细胞的无机离子吸收并储存在液泡中，使液泡更好地发挥其渗透调节功能，而成熟的高等植物细胞中液泡又占完全膨胀细胞总体积的95％。所以，Na+的区隔化是植物在盐环境下生存的必要保障，是较有机物质积累对植物耐盐所起作用更为有效的方式。\n 本研究的主要目的是从拟南芥中克隆液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(AtNHX1)，与组成型启动子CaMV35S或逆境诱导型启动子rd29A融合，构建成不同启动子驱动AtNHX1基因的植物表达载体。通过农杆菌介导，将CaMV35S启动子驱动的AtNHX1基因转入洋葱表皮细胞和模式植物烟草中，以确证AtNHX1基因的功能。然后将携带目的基因的两种表达载体转入马铃薯中，从而提高其耐盐性。目前，取得的研究结果有：1、以NaCl胁迫处理的拟南芥幼苗叶片为材料，用TRIzol一步法RNA提取试剂盒抽提总RNA，通过RT-PCR方法和DNA序列测定，证实获得了拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白基因(AtNHX1)的cDNA克隆。该cDNA全长1617bp，包括538个氨基酸编码区和1个终止密码，具有多个物种Na+/H+逆向转运蛋白基因的高度保守序列——氨氯砒嗪脒(amiloride)的结合位点(LFFIYLLPPI)和Asp137。序列同源性分析结果显示，该cDNA片段与原序列的同源性高达99.75％，与同科芸薹属油菜的同源性为89％，但与不同科植物的同源性较低，仅为60％～70％，表明该基因在进化上存在多样性，但它们都具有氨氯砒嗪脒结合位点，对Na+具有高度专一性，对植物的耐盐性起着重要作用。\n 2、将rd29A基因的启动子与GFP基因融合，构建成植物表达载体，并以CaMV35S启动子驱动GFP基因的表达载体为对照，用基因枪介导转化置于4种类型培养基上的洋葱表皮细胞。对其进行不同温度下的培养，16h后观察GFP基因的瞬时表达水平。结果表明，rd29A启动子同CaMV35S启动子一样，具有启动子的各种作用元件，能够驱动它所调控的目的基因——GFP基因的表达。且在不同培养基上，该启动子驱动的GFP基因的表达量均高于CaMV35S启动子驱动的GFP基因的表达量，并对高盐和脱水逆境的响应较温度显著。说明该启动子可以在抗逆基因工程中用于目的靶基因表达的调控。\n 3、对pBI121载体GUS基因后的终止子序列(SacI-EcoRI)通过PCR扩增法进行了酶切位点的添加，即在SacI后添加了XhoI、在EcoRI前添加了KpnI。序列分析发现，两个酶切位点的添加是成功的，但扩增的终止子序列与原序列的同源性间有差异，即有四个碱基发生了变异，特别是第17个碱基位点出现了缺失。利用绿色荧光蛋白(GFP)对改造载体进行了终止子活性的检测，结果发现，它与携带.GFP的pBI121载体一样，GFP基因能正常表达，说明pBI121载体的终止子序列的改造是成功的。利用改造后的载体(pBI121-GZ)构建了CaMV35S和rd29A启动子驱动AtNHX1基因的植物表达载体。\n 4、对AtNHX1基因的终止密码(TGA)通过PCR扩增法进行了删除，序列分析发现，终止密码的删除是成功的，且扩增产物与原序列间的一致性为100％。将该基因的C端与GFP基因连接(启动子为CaMV35S)，通过PCR和酶切检测证实，两个基因连接成功。利用基因枪介导法将其转入洋葱表皮细胞中，结果发现，AtNHX1+GFP融合基因和GFP基因均能在洋葱表皮细胞中表达。AtNHX1基因的表达产物被定位在细胞的液泡膜上，且该基因对盐逆境具有明显的抗性。\n 5、将CaMV35S驱动的AtNHX1基因表达载体通过农杆菌介导法转入烟草中，经过200mg/LKan筛选，获得了Kan抗性植株，再进行0.6％NaCl筛选，获得抗盐转化植株。进一步对转化植株进行PCR、PCR-Southern、So

关键词： 传染性支气管炎病毒   重组鸡痘病毒   γ干扰素   S1蛋白  

摘要： rFPV-IFNγS1是一株共表达传染性支气管炎病毒S1基因和鸡干扰素-γ基因的重组鸡痘病毒,将其接种SPF鸡3周后,用传染性支气管管炎病毒异源毒株攻击,考察重组疫苗对异源毒株攻击的保护作用。结果显示,疫苗接种后,免疫鸡血清中抗体很快产生,外周血中CD 4+和CD 8+T淋巴细胞与非免疫对照组相比都有显著差异。用LHB株IB病毒攻击后,免疫鸡的病理损伤明显轻于非免疫对照组,并且其排毒时间明显缩短,排毒量明显减少,攻毒后免疫组的发病率为30%(3/10),死亡率为10%(1/10),非免疫对照组的发病率为100%(10/10),死亡率为40%(4/10)。体重分析结果表明,攻毒前后免疫组与对照组相比,体重均没有显著变化,但攻毒后免疫组鸡体重增长的幅度要高于非免疫对照组。从以上结果可以说明,重组疫苗能在动物体内很好表达,对试验动物产生较好的保护作用,同时也减轻了重组疫苗对体重增长的抑制作用。

关键词： 亲和力成熟   基因工程抗体   突变  

摘要： 近年来,抗体因其高度的特异性在诊断和药物的靶向治疗上备受青睐,相关行业的发展也极为迅猛。在体内诊断和治疗上,基因工程抗体具有众多鼠源性单克隆抗体无可比拟的优势,但前者亲和力低是制约其实际应用的瓶颈问题,作者将就基因工程抗体亲和力成熟的策略及其应用进行综述。

关键词： 鸡传染性支气管炎病毒   基因工程疫苗   接触性传染病   结构蛋白   冠状病毒   病毒粒子   蛋白组成   S1蛋白   中和抗体  

摘要： 鸡传染性支气管炎(IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病,是严重危害养禽业的重要传染病之一.IBV为冠状病毒科(Coronavirdae),冠状病毒属(Coronavirus)的代表成员,病毒粒子有囊膜和纤突,基因组为一条单股正链RNA,具有27kb,分为10个开放阅读框架(ORF);基因组主要编码3种结构蛋白:纤突(S)蛋白、膜(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白,其中S蛋白由S1和S2两种糖蛋白组成,血凝抑制和大多数中和抗体由S1蛋白引起.

关键词： 炭疽芽孢杆菌   保护性抗原   免疫   基因工程疫苗  

摘要： 扩增了炭疽芽孢杆菌PA基因,构建了原核表达质粒pET-28a-PA,并对其进行了诱导表达,对表达产物免疫原性和免疫保护效果进行了研究。结果表明,PA基因的长度约为2 205 bp,PA蛋白的相对分子质量为83 ku;rPA蛋白具有良好的免疫原性,初免后10 d即可检测到特异性抗体,第3次免疫后抗体水平明显升高,可达1∶12 800;rPA蛋白刺激小鼠产生的特异性抗体亚型以IgG 1为主;rPA蛋白在体外对小鼠脾脏细胞有促进生长和增殖作用。rPA免疫组小鼠脾脏中CD4+细胞显著增加,免疫应答趋向T h2型反应,说明rPA介导的免疫反应以体液免疫为主。rPA具有一定的免疫保护作用,保护率达到50%。

关键词： 克伦特罗   单链抗体   噬菌体抗体库   动物促长剂   免疫分析法   基因工程抗体   动物免疫  

摘要： 克伦特罗(clenbuterol，CBL)是一种禁用的动物促长剂，但违禁使用现象仍较普遍，危害严重，有必要进一步对其加强监测。免疫分析法具有灵敏、简便、快速等特点，在食品安全监测中具有突出的优势。目前虽有利用CBL多克隆抗体及单克隆抗体建立的免疫分析方法，但其抗体制备需要进行动物免疫及昂贵的细胞培养设备，周期长，成本较高，限制了其在免疫分析中的应用。第三代抗体——基因工程抗体技术的出现，给快速低成本制备目的抗体提高了一条新的途径。为此，本论文开展抗CBL单链抗体制备、表达及特性研究，主要研究内容及结果如下：\n 1抗CBL噬菌体单链抗体库构建、特异性噬菌体抗体筛选及鉴定\n 从1×107抗CBL杂交瘤细胞系5D1中采用Trizol法提取总RNA，经紫外分光光度法测定含量为2μg/μL，A260nm/A280nm值约为2.12，纯度较好。以此RNA为模板，OligodT9为引物，进行反转录反应，合成cDNA第一链。以此cDNA第一链为模板，采用一套通用引物，PCR分别扩增抗体轻重链可变区VL、VH基因，结果分别扩增出320bp的VL基因片段及350bp的VH基因片段。以扩增出的VH、VL片段互为模板，采用一套含(Gly4Ser)3连接肽的接头引物，重叠延伸PCR法合成scFv单链抗体基因片段，并采用两条含BglⅠ及NotⅠ酶切位点的上下游引物对scFv进行二次PCR扩增，结果扩增出760bp的全长scFv基因片段。将scFv片段用BglⅠ及NotⅠ双酶切后，与载体pCANTAB5E连接，转化大肠杆菌TG1，产生约2.26×103个克隆，即抗体库的库容为2.26×103。从转化平板上挑取8个克隆进行PCR及酶切鉴定，结果表明有6个克隆含有插入片段，即重组率为75％。采用辅助噬菌体对转化菌进行超感染后，构建抗CBL噬菌体抗体库。以CBL-OVA为包被抗原，对抗体库进行一轮富集淘选，从富集后的生长平板上挑取32个克隆，PCR鉴定13个克隆含有插入片段。采用抗M13抗体对此13个噬菌体抗体克隆进行ELISA鉴定，结果全部克隆显示出抗原结合活性。而从富集前的平板上挑选的16个克隆，PCR鉴定有8个克隆含有插入片段，只有1个噬菌体抗体克隆显示出抗原结合活性。\n 2抗体CBL单链抗体可溶性表达及性质鉴定\n 从上面鉴定为阳性的克隆中提取质粒DNA，转化琥珀终止非抑制型大肠杆菌HB2151，IPTG诱导抗CBL单链抗体进行可溶性表达。采用渗透休克法提取了菌体细胞周质腔中的可溶性单链抗体，并对培养上清及周质腔提取物中表达的单链抗体进行SDS-PAGE，Western-Blotting及ELISA鉴定。SDS-PAGE结果显示，周质腔提取物在分子量29kD处明显出现一增粗条带，与单链抗体的预期分子量相符，表明可溶性单链抗体在菌体周质腔中有表达。而Western-Blotting的结果则发现培养上清及周质腔提取物均出现特异性条带，表明可溶性单链抗体在培养上清及周质腔中均有表达。间接ELISA分析也表明类似结果。培养上清的效价约为1:160，周质腔的效价约为1:1600。竞争ELISA分析结果表明，表达的可溶性单链抗体可被游离的CBL竞争性抑制，IC50值为0.78ng/mL，比亲本单抗(IC50值为1.34ng/mL)要低，表明在竞争ELISA分析中单链抗体可能比单克隆抗体要有更高的灵敏度。交叉反应测定结果表明，抗CBL单链抗体与CBL系列结构类似物不存在交叉反应，与亲本单克隆抗体结果一致，表明了此单链抗体具有与亲本单抗结构相同的抗原结合位点。以抗CBL单链抗体为免疫试剂，初步建立了CBL的竞争ELISA分析法。从标准曲线上可见，线性分析范围在0.14～10.2ng/mL，最低检测限为0.06ng/mL。对一系列标准添加物进行测定，结果表明在PBS中添加标准物，具有较好的准确率。\n 3抗CBL单链抗体生物信息学初步研究\n 采用ABI3730测序仪对抗CBL单链抗体的基因序列进行测定，并根据基因序列推导了其氨基酸序列。根据Kabat法则分别对VH、VL的FR区及CDR区进行了划分。在NCBI数据库中采用ProteinBLAST选项分别对VH、VL及全长scFv进行了序列同源性比对，结果发现VH序列与一转基因小鼠产生的VH序列(序列号：AAO19048.1)高度同源，同源性为86％，有14个氨基酸不同。其中，1个在CDR1区，4个在CDR2区，3个在CDR3区。VL序列与一抗PVYNIa蛋白单链抗体的VL序列(序列号：AAO43673.1)高度同源，同源性为91％，有9个氨基酸不同。其中，1个在CDR1区，2个在CDR3区。以scFv全长氨基酸序列作为比对模板，则发现与一抗isoketal-adduct半抗原的单

关键词： 单链抗体   基因工程抗体   抗体亲和性   重链可变区   连接肽   融合蛋白   免疫原性   重组蛋白   轻链可变区   肿瘤诊断  

摘要： 单链抗体(ScFv)是将抗体重链可变区和轻链可变区通过一段连接肽连接而成的重组蛋白,也是目前报道最多的基因工程抗体。ScFv具有分子质量小,免疫原性低,无Fc端,不易与具有Fc受体的靶细胞结合,对肿瘤组织的穿透力强,可以与其他效应分子连接成抗肿瘤融合蛋白等特点。

关键词： 猪繁殖与呼吸综合征   PRRS疫苗   防制策略   基因工程疫苗   科研人员   养猪业   经济损失   疫病净化   早期断奶   消毒隔离  

摘要： 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)自1987年在美国出现以来,世界各国的养猪业均不同程度遭受该病的危害,尤以集约化养猪业发达的国家损失最为惨重.虽然兽医科研人员和养猪业者进行多方面的努力,但至今该病仍然是造成养猪业经济损失的重要疾病之一,尽管采取了包括种源控制、疫病净化、消毒隔离和早期断奶等多种防制措施,仍不能禁绝该病的发生与蔓延.

关键词： 兽用疫苗   禽网状内皮组织增生症病毒   重组活载体疫苗   传染性法氏囊病病毒   传染性支气管炎病毒   马立克氏病病毒   新城疫病毒   基因工程疫苗   鸡痘病毒   狂犬病病毒  

摘要： 1基因工程疫苗 1.1 重组活载体疫苗 病毒活载体疫苗的研究较多．如用鸡痘病毒作为载体，表达成功的保护性抗原基因就有新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、马立克氏病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、狂犬病病毒．传染性支气管炎病毒、艾美尔球虫等。2005年12月24日．农业部在北京宣布．我国已成功研制出禽流感——新城疫重组二联活疫苗，并正式批准生产。

关键词： 伊氏锥虫   微管结合蛋白p15   基因工程   疫苗  

摘要： 伊氏锥虫病，是由伊氏锥虫(Trypanosomaevansi)寄生在马属动物、牛、骆驼等家畜血液内引起的一种血液原虫病，对畜牧业造成较大危害。由于锥虫抗原变异的原因，近年来疫苗研究转向用锥虫不变成分作为潜在对象，由于膜下微管结合蛋白p15在锥虫研究中表明具有很好的免疫原性，且已证明用微管结合蛋白p15天然蛋白和重组蛋白作为疫苗，在布氏锥虫(Trypanosomabrucei)上获得了很高的保护率。\n 锥虫膜下微管结合蛋白p15在种间具有保守性，本研究根据报道的布氏锥虫微管结合蛋白p15(Tb-MAPp15)基因及其3\'非翻译区保守序列设计引物，采用PCR法从伊氏锥虫云南水牛株基因组DNA中首次扩增得到伊氏锥虫微管结合蛋白p15(Te-MAPp15)基因。成功构建重组原核表达载体和真核表达载体，并制备亚单位疫苗和核酸疫苗。\n 分别用制备的重组亚单位疫苗，核酸疫苗以及核酸疫苗-重组亚单位疫苗联合使用免疫小鼠。免疫后攻虫，进行抗体水平、NO浓度及疫苗保护效果检测，重组蛋白抗体水平和NO浓度最高，虽然核酸疫苗-重组亚单位疫苗联合使用免疫产生的抗体水平和NO浓度低于重组蛋白疫苗免疫组，但后者免疫小鼠存活时间最长，可能是由于核酸疫苗首先激发机体的细胞免疫，然后蛋白激发体液免疫，更利于机体清除虫体，表明后者可能是锥虫免疫防治的一个新方法。