关键词： 猪2型圆环病毒   ORF2基因   杆状病毒   亚单位疫苗   DNA疫苗   免疫原性  

摘要： 猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)不仅可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)，而且还与猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、猪先天性振颤、母猪繁殖障碍、猪增生性和坏死性肺炎等疾病密切相关。自从20世纪90年代发现可致猪的疾病以来，PCV2病毒在世界各国迅速蔓延。目前PCV2在猪群中的感染率非常高，造成猪的生长缓慢，饲料报酬下降，同时侵害猪的免疫系统，导致猪的免疫机能下降，造成其它疾病的大暴发，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。我国也于2000年检测到了该病毒的存在，该病毒在我国猪群的感染率近乎50％，给我国的养猪业也造成了严重的打击。目前对于该病毒的防制主要是依靠疫苗，而由于该病毒在细胞上增殖滴度很低，发展传统的灭活疫苗和弱毒疫苗非常困难，因此，研制安全、高效、廉价的新型疫苗成为越来越多研究者关注的焦点，但目前对于PCV2的新型疫苗的研究进展一直比较缓慢。 本研究对PCV2新型疫苗设计进行了新的探索，构建了利用杆状病毒表达系统表达的ORF2蛋白亚单位疫苗，修饰的ORF2 DNA疫苗以及杆状病毒为载体的重组毒疫苗，并对构建的候选疫苗进行了免疫效力研究，主要研究内容如下： ***2亚单位疫苗的构建以及免疫原性研究 PCR扩增PCV2 ORF2全基因，并克隆到杆状病毒转移载体pFastBac中，构建转移载体pFast-ORF2，然后转化DH10Bac大肠杆菌，通过蓝白斑菌落及抗性筛选，获得重组穿梭载体***2，提取其基因组并转染sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒Ac-ORF2。通过间接免疫荧光和Western blotting分析证明插入的ORF2基因可在重组杆状病毒中进行有效表达，并证实该表达蛋白纯化后经磷钨酸负染后，电镜下可见形态与PCV2病毒粒子相似的病毒样颗粒(VLPs)，其中某些颗粒由于中心浓染而似空衣壳，其直为17nm。为了进一步研究病毒样颗粒的免疫原性，我们将此特性的ORF2蛋白制备成亚单位疫苗，按照10个细胞／mL，5×10个细胞／mL和10个细胞／mL三个不同的剂量免疫28日龄断奶仔猪。试验结果表明，在首疫后第4周，5×10个细胞／mL和10个细胞／mL两个剂量组免疫的部分仔猪体内已有ORF2抗体产生，在加强免疫后该两组的抗体水平继续升高，但两组间差异不显著，而10个细胞／mL免疫组在加强免疫之前和之后均检测不到ORF2抗体的存在。淋巴细胞增殖试验结果也同样证实该5×10个细胞／mL和10个细胞／mL免疫组的仔猪可以诱导较高的PCV2特异性的淋巴细胞增殖反应。表明杆状病毒表达的ORF2蛋白具有良好的免疫原性，是一种极具潜力的PCV2候选亚单位疫苗。 2．修饰的PCV2 DNA疫苗的构建以及免疫原性研究 研究证实将抗原靶向到不同的亚细胞器，能够影响此抗原的加工与提呈途径，进而改变此抗原诱导的免疫反应的类型。核定位的PCV2衣壳蛋白是否也会由于核内定位的模式而影响其抗原提呈，进而影响其免疫反应的诱导?因此本研究对ORF2基因进行修饰，使所表达的ORF2具有不同的定位模式，即核定位型的pc-ORF2，胞浆定位型的Cy-ORF2，分泌型的Sc-ORF2和膜结合型的M-ORF2。间接免疫荧光证实修饰后的ORF2蛋白能够表达，并且能够正确靶向到各亚细胞器。以小鼠为模型动物，探讨了4种修饰的ORF2 DNA疫苗的免疫效力，实验结果表明：4种构建的DNA疫苗均可以诱导一定程度的ORF2特异的体液免疫反应，但相对于核定位型(pc-ORF2)与胞浆定位型(Cy-ORF2)，分泌型ORF2(Sc-ORF2)和膜结合型ORF2(M-ORF2)免疫小鼠能够诱导显著高的中和抗体水平。而从细胞免疫水平来看，膜结合型ORF2(M-ORF2)免疫的小鼠诱导显著高水平的T淋巴细胞增殖活性及IFN-γ分泌水平，其次是核定位型ORF2(pc-ORF2)免疫的小鼠，而分泌型(Sc-ORF2)与胞浆定位型ORF2(Cy-ORF2)免疫的小鼠仅诱导低水平的T淋巴细胞增殖活性及IFN-γ分泌水平。因此，综合体液免疫水平和细胞免疫水平，膜结合型ORF2(M-ORF2)能够诱导较高的中和抗体水平和最高的细胞免疫水平，具有最佳的免疫效果，是一种具有良好发展前景的PCV2新型候选疫苗。 3．杆状病毒介导的表达PCV2 ORF2的重组毒疫苗的构建以及免疫原性的研究 杆状病毒不能感染哺乳动物细胞，但可以进入不同物种和组织来源的多种哺乳动物细胞，并在合适的哺乳动物启动子控制下表达外源基因。目前利用杆状病毒作为体内基因投送的载体已受到广泛的关注。但研究证实血清补体系统是杆状病毒体内基因转导过程中的主要抑制因素。因此，为了消除杆状病毒的补体敏感性，在本研究中利用水泡性口炎病毒G蛋白修饰杆状病毒。

关键词： 动物病毒   PCR   中华人民共和国   伟嘉集团   科技成果   科研成果   伪狂犬病基因缺失疫苗   高致病性   鳗弧菌   基因工程疫苗   影响力   化石人类   能人  

摘要： 古人云:"强中更有强中手,能人背后有能人。"2007年的中国动保行业,危机四起,疫病重重。在这动荡时期,科研成果与企业战略双管齐下共同驱使着中国动保行业的未来。这个时期一切都变得黯然,只有成功的人与推动中国动保行业的事迹才值得我们学习与借鉴。

关键词： 口蹄疫病毒   基因工程疫苗   VP1   大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位   抗体水平  

摘要： 1、三种猪O型口蹄疫抗体检测试剂盒的比较 应用两种ELISA试剂盒(赛迪公司FMDV O型抗体检测阻断ELISA试剂盒，兰州所FMDV O型抗体检测液相阻断ELISA试剂盒)和一种正向间接血凝试剂盒(兰州所生产的FMDV O型正向间接血凝抗原试剂盒)对125份口蹄疫免疫猪血清进行了抗体水平测定，并对三种试剂盒测定结果的符合程度、及其各自的重复性进行了分析。试验结果表明三种试剂盒测得的抗体水平之间有较好的一致性，且三种试剂盒各自的检测结果重复性良好。这一工作为FMDV基因工程疫苗动物免疫试验的免疫学检测确定了一种可靠的方法。 2、O型口蹄疫病毒代表性VP1基因的人工合成、表达及重组蛋白的免疫原性研究 通过对GeneBank近十年内收录的O型口蹄疫病毒VP1基因序列的同源性比较分析，根据与我国口蹄疫防制工作有密切相关性的一个基因群的基因序列设计并合成了有群内抗原代表性的结构蛋白VP1全基因片段。将合成的序列克隆到原核表达载体pET-28a(+)中、构建了VP1的表达质粒pETVP1。SDS-PAGE和Western-blot分析表明该质粒的BL21(DE3)LysS转化菌在IPTG诱导下可特异性表达VP1蛋白，该重组蛋白以包涵体的形式存在、分子量约30KD，且能与口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清发生特异性反应。动物接种实验表明重组蛋白能诱导小白鼠产生特异抗FMDV抗体。 3、O型FMDV VP1基因与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)基因的融合表达及表达产物的免疫原性研究 以质粒pMDTLT为模板、用PCR的方法扩增出LTB基因，然后将其插入到pETVP1质粒中VP1基因的上游、构建了含有融合基因LTBVP1的表达质粒pETLTBVP1，转化宿主菌BL21(DE3)LysS后进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE显示、重组蛋白以包涵体的形式表达、分子量约39KD;经Western-blot分析表明重组蛋白能与FMDV阳性血清及兔抗霍乱毒素(CT)血清反应，说明融合蛋白保持了LTB和VP1各自的免疫学活性。动物实验表明：该融合蛋白能诱导小鼠产生较强的免疫应答反应，其水平比试验中选用的普通商品口蹄疫苗所诱导的抗体水平还要高。 4、LTB对VP1蛋白粘膜免疫效应增强作用的研究 本实验将前面2个实验中的VP1、LTBVP1重组蛋白纯化后分别通过滴鼻、灌胃、灌肠等粘膜途径接种小鼠;最后采用正向接间血凝检测小鼠血清抗体水平，结果表明：单纯的VP1重组蛋白通过粘膜途径多次接种后能诱导出较弱的免疫反应，而LTBVP1融合蛋白二免后既能诱导小鼠产生较高水平FMDV特异性抗体。说明LTB可增强VP1蛋白通过粘膜途径所诱导的免疫反应。

关键词： 肝炎病毒   表面抗原   工程抗体  

摘要： 本文对人源抗乙型肝炎病毒表面抗原的基因工程IgG全抗体的载体构建、表达及鉴定进行了探讨。本研究采用磷酸钙介导法，将质粒pAC-HBs-Fc与线性杆状病毒DNA共转染昆虫细胞sf9，产生重组杆状病毒，采用蚀斑法纯化重组杆状病毒并进行滴定，其滴度为9×10<'5>pfu/ml。用FITC-抗人Fab抗体和FITC-抗人Fc抗体检测转染细胞，均观察到阳性荧光反应，未转染的正常sf9细胞呈阴性反应，表明人源抗-HBsAg的IgG在昆虫细胞中能完整表达；以HBsAg包被ELISA板孔，采用间接法检测培养的上清，结果呈阳性反应，且与HCv抗原、HIV抗原、狂犬病病毒抗原、麻疹病毒抗原和腮腺炎病毒抗原无交叉反应，说明该重组IgG抗体对HBsAg特异性良好。表达产物采用蛋白G亲和层析柱进行纯化，其纯度达97.1％，纯化后的人IgG抗体对重组HBsAg的ELISA试验，证明其具有很好的抗原抗体反应性。测定纯化IgG抗体的蛋白含量，推算人源抗-***的IgG抗体在sf9细胞上清中的表达量为0.45mg/L。CHO表达的HBsAg和血源HBsAg能竞争性抑制该重组IgG抗体与***表达的HBsAg反应，其抑制率分别为55.9％和81.9％。纯化的抗体在β-巯基乙醇还原情况下，进行SDS-PA(讵电泳，可清晰观察到IgG解链后的轻链和重链带，Western-blot分析证明该重组抗体为人源IgG抗体。

关键词： 全国动物卫生风险评估专家委员会   肉类   猪蓝耳病病毒   中国农业科学院   消息树   能繁母猪保险   性控技术   基因工程疫苗   生猪产业   小反刍兽疫   奶牛   猪肉产品   检测中心   免疫蛋白  

摘要： 农业部成立全国动物卫生风险评估专家委员会本刊讯近日,农业部在京成立全国动物卫生风险评估专家委员会。该委员会汇集了来自国家有关部门、高等院校、科研单位、农业系统和社会有关方面的众多资深专家,将依法开展动物卫生风险评估和兽医管理决

关键词： 戊型肝炎病毒   基因工程疫苗   Virus   致病因子   国际会议   消化道   HEV   基因组  

摘要： 戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV）经消化道途径传播，是戊型肝炎（Hepatitis E，HE）的致病因子。戊肝最早是1980年在印度发现的。1983年HEV首次被分离到。被病毒的基因组一直到1991年才得以测序。并在1989年东京国际会议上正式命名。

关键词： 血吸虫病   基因工程疫苗   人畜共患寄生虫病   疫情监测   化学治疗   健康教育   综合防治   传染源  

摘要： 1 血吸虫病概述血吸虫病是危害最严重的人畜共患寄生虫病之一.据 WHO(1996)统计,血吸虫病流行于全球74个国家和地区,有6亿人受到威胁,2亿人感染,2千万人患病,每年有上10万人死于该病.

关键词： 基因工程疫苗   研制成功   猪口蹄疫   复旦大学生命科学院   商业化生产   自主知识产权   国际领先水平   高技术产业化   科研人员  

摘要： 据报道，复旦大学生命科学院郑兆鑫教授等科研人员经过22年的艰苦探索、反复试验，研制成功具有自主知识产权的猪口蹄疫O型基因工程疫苗，并于日前在上海通过成果鉴定。评审专家一致认为，该项技术成果居国际领先水平，是国内外首先研制成功的可应用于商业化生产的猪口蹄疫O型基因工程疫苗，并获得农业部颁发的“一类新兽药注册证书”。该项目已列入国家发改委领导的2005年度现代农业国家高技术产业化专项项目，2006年已入生产。

关键词： 抗角蛋白基因工程抗体   银屑病   动物模型   角质形成细胞  

摘要： 目的观察基因工程抗角蛋白抗体对豚鼠银屑病样模型的治疗作用及对角质形成细胞增殖的影响。方法建立豚鼠银屑病模型,将通过基因工程技术获得的抗角蛋白抗体Fab段以肌注方式给药,从组织病理水平评价抗体对豚鼠银屑病模型的治疗效果;将抗体与角质形成细胞共培养,MTT法观察其对角质形成细胞增殖能力的影响。结果抗角蛋白抗体Fab段可以促进豚鼠银屑病模型的恢复,抑制角质形成细胞的过度增殖。结论提示抗角蛋白基因工程抗体具有促进豚鼠银屑病样模型恢复的作用,对银屑病可能具有一定的治疗作用。

关键词： 基因工程疫苗   应用   畜禽   世界卫生组织   全球范围   天花   牛  

摘要： 自200多年前，英国医生詹纳（Jenner）通过牛痘成功预防天花以来，疫苗的发展经过了古典疫苗，传统疫苗时期，并逐渐向基因工程疫苗迈进的历程。80年代世界卫生组织宣布已经在全球范围内消灭了天花，这是人类第一个用疫苗消灭的疾病。