关键词： 仔猪   ETEC   K88ac-ST1-LTB   基因工程疫苗   免疫接种  

摘要： 新生仔猪大肠杆菌性腹泻(Diarrhea in Neonatal Swine Caused by ***)俗称仔猪黄痢,是由特定血清型产肠毒素性大肠埃希氏菌(Enterotoxigenetic ***,ETEC)感染所引起的初生仔猪的一种急性、致死性传染病。主要发生于一周龄以内的仔猪,尤以1-3日龄最为多见,临床以腹泻、排黄色稀便为主要特征,发病率和死亡率均很高。在仔猪腹泻病病原中,约有40%的病例由ETEC引起,而在我国则约为35%。 ETEC的毒力因子主要包括黏附素(adhesin)和肠毒素(enterotoxin,Ent)。许多学者先后证实,多数ETEC菌株带有K88、K99、987P和F41等黏附素,并产生ST/LT或ST和LT。具有K88菌毛的菌株通常产生ST和LT,而具有K99、987P、F41等菌毛和不具有菌毛的菌株通常只产生ST。 本研究应用分子生物学技术,针对新生仔猪大肠杆菌性腹泻病原的主要致病因子K88ac、ST1、LTB克隆和连接,并于原核载体中得以表达。表达的K88ac-ST1-LTB融合蛋白能被K88ac抗体、ST1和LTB单克隆抗体识别,并使免疫小鼠和仔猪抵抗强毒C83902株的攻击。 用重组PCR技术对ETEC C83902株ST1基因的抗原编码区进行了定点突变,然后将突变后的三个ST1突变基因进行了连接,并克隆至中间载体质粒pUC19中,构建成重组质粒pXST3。 用重组PCR技术对ETEC C83902株K88ac基因和LTB基因的抗原编码区分别克隆至中间载体质粒pBluescriptII和表达载体pET-28b中,构建成重组质粒pXK88和pXLT。 在构建了上述三个中间质粒之后,经酶切、连接、克隆,构建了 重组表达质粒pXK88acST3LT5。将其转化至工程菌株BL21(DE3)构建了重组菌株GE-3,其表达的融合蛋白经检测能够被K88ac抗体、ST1和LTB单克隆抗体识别。 用乳糖替代IPTG对重组菌株GE-3进行诱导对比试验和诱导条件试验,证明乳糖可以替代IPTG诱导该重组菌株表达。 用重组菌株GE-3乳糖诱导表达的菌液制备疫苗2批,分别用小鼠和猪进行了安全性试验和免疫攻毒试验,结果,2批疫苗均安全、有效。

关键词： 阿尔茨海默病   β-淀粉样蛋白   免疫治疗   基因工程疫苗  

摘要： 阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种多见于老年人的中枢神经系统退行性疾病，主要临床表现为认知功能障碍和记忆损害。随年龄增加，AD的发病率不断上升。它的主要病理改变为患者脑内出现β-淀粉样蛋白(β-amyloidpeptide，Aβ)沉积形成的老年斑，神经纤维缠结及神经元丢失。从报道首例AD病例到现在已近100年，AD的病因及其病理机制仍不十分明确，目前存在多种学说和假设，其中以Aβ毒性学说为大多数学者所接受。该学说认为Aβ生成、聚合、沉积，继而形成老年斑，同时伴随神经元损害，是AD病理机制的中心环节。近年的研究对该学说有了进一步补充，认为Aβ寡聚体的形成也是AD致病的主要原因。围绕Aβ致病学说展开的以β-淀粉样蛋白为靶的免疫治疗是近年AD治疗的热点。 1999年Schenk等人首次报道用化学合成的Aβ<,42>肽疫苗皮下接种AD转基因鼠，产生了特异性的抗Aβ<,42>抗体，阻止和减少了淀粉样斑块的形成。随后多个独立实验室先后发现采用主动免疫或被动免疫的方法均可以减少或清除AD转基因鼠脑内的淀粉样斑块沉积并且改善了动物的记忆功能和认知能力。2001年，Elan公司率先进行了抗老年性痴呆疫苗AN1792(主要成分为Aβ<,42>和佐剂QS-21)的Ⅰ期临床试验，取得了良好的效果。但在Ⅱ期临床试验中，约6﹪的患者接种后出现了脑脊髓膜炎的症状，试验被迫中止。随后的尸检发现患者脑组织中存在T细胞和巨噬细胞浸润。通过大量随访和实验，多数研究者们认为Aβ<,42>肽C末端的T细胞表位激发了Th1反应，从而诱发炎症反应可能是Aβ<,42>肽疫苗免疫产生副作用的主要原因。选择含有尽量少的引发细胞免疫的T细胞抗原决定簇，保留引发体液免疫的B细胞抗原决定簇的Aβ肽亚单位疫苗已成为大多数研究者的共识。随后多家实验室采用化学合成或基因工程的方法制备出不同的Aβ亚单位片段加入不同类型佐剂免疫动物后，发现具有和Aβ<,42>肽疫苗同样的免疫效果，同时避免了不良反应。本课题组自2001年开始AD系列疫苗的研究以来，先后合成和构建了MAP-Aβ<,1-15>肽疫苗，s4×Aβ<,1-15> DNA疫苗，GSN×Aβ<,1-15>和His6-4×Aβ<,1-15>融合蛋白疫苗等，在动物实验上均诱导出了较高的特异性抗体，减少了老年斑的沉积，改善了模型鼠的学习记忆功能。 目的： 本课题在前期研究的基础上，拟去除前期构建的PQE-4×Aβ<,1-15>载体目的基因前方不相关的基因片段，得到理论上更安全的疫苗。在设计上去除了Aβ的T细胞抗原决定簇，保留了B细胞抗原决定簇避免了Aβ的毒性片段，同时采用柔性肽连接多个抗原片段，选择较理想的纯化标签和载体，用基因工程的方法制备新的四价Aβ亚单位蛋白疫苗，为开发出更安全、廉价、效果理想的具有自主知识产权的治疗AD的疫苗奠定基础。 材料和方法： 1.重组原核表达载体PQE30a-2×Aβ<,1-15>的构建及鉴定 本室前期通过基因合成和PCR技术扩增，得到六个甘氨酸连接的Aβ<,1-15>二价B细胞抗原表位基因片段，再用GSGGSG linker串联这两个Aβ<,1-15>二价基因片段，命名为4×Aβ<,1-15>，克隆入PcDNA3.1载体，构建成功了PcDNA3.1-s4×Aβ<,1-15>真核表达载体。本实验在此基础上，以PcDNA3.1-S4×Aβ<,1-15>质粒为模板，由于Aβ<,1-15>片段四次串联重复，在引物设计时引物与模板的匹配不能完全一致，故考虑先扩增两个Aβ<,1-15>二价基因片段减少非特异性扩增。设计上、下游引物时分别引入BamHI和SacI酶切位点，经PCR扩增出目的基因片段1-2×Aβ<,1-15>。将目的片段纯化后酶切克隆入原核表达载体PQE30a中，转化感受态细菌后挑取阳性菌落扩大培养，提取质粒并酶切鉴定，根据电泳情况初步确定阳性克隆，命名为PQE30a-2×Aβ<,1-15>，将菌液送上海生物工程公司测序，进一步鉴定。 2.重组质粒PQE30a--4×Aβ<,1-15>的构建及鉴定 根据测序正确的PQE30a-2×Aβ<,1-15>质粒为模板扩增另外两个Aβ<,1-15>片段，较之以PcDNA3.1-s4

关键词： 红细胞   血型   单克隆抗体   基因工程抗体   噬菌体抗体库  

摘要： 1目的 人红细胞血型系统非常复杂,血型抗原的正确鉴别在保证输血安全、调查人种分布、建立稀有血型库及许多疾病的诊断、分型甚至治疗方面都有极其重要的作用。抗原的鉴别有赖于相应抗体的获得。而我国除ABO血型定型试剂外,其它临床及实验所用血型抗体几乎全部依赖进口,这极大地制约了血型学研究在我国的发展。本研究的目的即通过常规的杂交瘤技术及目前迅速发展的基因工程抗体技术制备针对各种血型抗原的单克隆抗体及基因工程抗体,以期获得效价高、特异性强并具有自主知识产权的血型抗体,为它们最终能大规模生产应用于临床及积极开展国际交流、互通有无打下坚实的基础。 2方法 根据实验目的,本课题内容共分三部分 2.1红细胞血型单克隆抗体的制备 分别用健康成人“O”血及胎儿脐血红细胞免疫BALB/c小鼠,经过3次免疫及一次加强免疫,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过血凝试验初筛,保留血凝效价达4+的细胞株扩大培养,获得的杂交瘤细胞上清分别用谱红细胞、原核表达的Kell-30c血型抗原多肽及Western blot进行抗体特异性鉴定,同时进行抗体类型、效价及抗原表位的检测,对部分单克隆细胞株通过腹水扩大培养,以进一步提高其效价。 2.2 ScFv-HPV16 E7双功能分子的制备 用实验第一部分获得的一株抗红细胞血型糖蛋白GPA/GPB的杂交瘤细胞株6D7C9进行RT-PCR,分别扩增其VH、VL基因,并用Linker将其拼接成6D7C9的ScFv基因,转化原核表达载体pBAD/gIIIA,获得的阳性克隆命名为:pBAD-ScFv,通过Western Blot分析及间接血凝试验检测ScFv的蛋白表达及血凝活性。将获得的pBAD-ScFv与已有的人乳头瘤病毒16型E7基因片段(HPV16-E7)通过一Linker经PCR拼接,转化,获得的双分子阳性克隆命名为:pBAD-ScFv-HPV16 E7,通过Western Blot分析及间接血凝试验检测表达产物的双特异功能,即其与HPV16 E7抗体和RBC同时结合,并通过血凝反应检测HPV16 E7抗体的能力。 2.3 Rh(D)抗原Fab抗体的制备 收集5份血清中抗Rh(D)效价在1:256-512之间的人淋巴细胞,提取RNA,用多对引物PCR分别扩增其VH、Vκ、Vλ基因,同时,分别从pComb3xTT和pComb3xλ噬粒中扩增CH1、C、C,通过重叠PCR,构建重链的Fd基因及完整的kappa、Lamda轻链,并进一步重叠PCR,获得Fab抗体片段。Fab经酶切、连接并电转化到噬菌体抗体表达载体pComb3xSS中,构建获得抗Rh(D)的Fab抗体库,经四轮Rh(-)/ Rh(+)红细胞阴/阳淘筛,获得的阳性克隆分别进行血凝试验、western blot分析及测序鉴定。 3结果 3.1红细胞血型单克隆抗体的制备 3.1.1 MNSs血型系统mAbs 获得的8种杂交瘤细胞株中,其中4株作用于GPA的M表位、1株作用于GPA的N表位;3株为同时抗GPA和GPB蛋白的GPA/GPB mAbs。杂交瘤细胞培养上清效价介于1×2–1×2之间,腹水mAbs效价在1×2–1×2之间。除1株mAb,1C1C9C4为IgM外,其他7株mAbs均为IgG。通过杂交瘤细胞培养上清与谱红细胞的反应格局,结合mAbs抗原表位检测,确定4株、1株mAbs可分别特异性结合于GPA的M、N表位;另3株mAbs,6D7C9、7C9H4和7C9G11,与“O”型血红细胞膜的Western blot结果显示,它们为抗GPA/GPB mAbs。 3.1.2 Ii血型mAbs 获得了3个抗i的mAbs:A10G5F9E2E7、A11G5F9E2C4和A10G2。杂交瘤细胞培养上清效价介于1×2–1×2之间,其中A10G5F9E2E7的腹水效价在1×2–1×2之间。三株mAbs均为IgG3型。通过杂交瘤细胞培养上清与谱红细胞(含胎儿i血型、成人I血型及成人稀有i血型)的反应格局,确定这3株mAbs特异性结合i抗原。 3.1.3 Kell血型系统的mAbs 获得3个抗Kell的mAbs:4H2A8、2F9F5和4D10G11,杂交瘤细胞培养上清效价介于1×2–1×2之间,抗体亚型检测均为IgG1。通过杂交瘤细胞培养上清与Kell蛋白原核表达多肽Kell-30c(kell蛋白C末断的30个氨基酸)的ELISA检测,确定这3株mAbs特异性结合Kell抗原。 3.2 ScFv-HPV16 E7双功能分子的制备 ScFv测序结果表明:VH隶属小鼠Ig重链第II亚组,而VL隶属小鼠Ig Kappa链IV亚组。Western blot分析显示:在相对分子质量33 000处有ScFv目的蛋白表达(与c-myc融合),血凝试验证明该表达产物有红细胞凝集活性。

关键词： 口蹄疫病毒   重组腺病毒   毕赤酵母   免疫佐剂   免疫特性  

摘要： 口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth diseasevirus，FMDV)引起的烈性传染病，主要感染偶蹄目动物。除动物死亡造成直接经济损失外，动物在患病期间肉和奶的生产停止导致该地区甚至该国家的畜产品进出口贸易停止，也造成巨大的经济损失。因此，世界各国都很重视本病的防制。 FMD弱毒疫苗和灭活疫苗等常规疫苗都具有良好的免疫原性，在预防和控制FMD的过程中发挥着重要作用，但由于病毒毒力返强、病毒灭活不彻底、活病毒逃逸疫苗加工厂等不安全因素。促使人们寻求一种更加安全有效的FMD疫苗。近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，FMD基因工程疫苗等多种新型的疫苗都在不断的研究开发中，并取得了很好的成绩，但存在的问题是价格昂贵和动物保护试验不尽如人意。因此，研究者试图从多方面增强FMD疫苗的免疫效果，其中用细胞因子作为分子免疫佐剂，已引起众多研究者的关注。研究表明，许多细胞因子具有明显的免疫佐剂效应，可增强机体对抗原的反应性或增强抗原的免疫原性。细胞因子在体内缓慢而持久地释放，不会对机体产生毒性作用。具有佐剂效应的细胞因子有干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ);淋巴因子(IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-10等);单核因子(IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等)及其它细胞因子。 本研究的目的是通过酵母表达系统和非复制型腺病毒载体系统表达口蹄疫病毒抗原基因及共表达抗原基因和免疫佐剂，研究免疫佐剂对重组蛋白和重组病毒的免疫增强作用，为口蹄疫基因工程疫苗的研究探索新的途径。研究主要从以下几个方面展开。 1．人工合成O型口蹄疫病毒VP1-2A基因，并克隆到pMDl8-T载体中，命名为pMD18-VP1-2A(上海Invitrogen公司完成)，以pMD18-VP1-2A为模板，设计一对引物，PCR扩增VP1基因，亚克隆到pET-32a(+)中，构建了表达载体pET-VP1，通过IPTG诱导表达，实现了融合蛋白VP1在大肠杆菌中的高效表达，表达融合蛋白为44kD左右，Western-blot试验表明，该重组蛋白具有免疫反应性。以纯化的重组VP1蛋白作为包被抗原，抗原最佳包被浓度确定为10.56μg／ml，能明显的区分口蹄疫病毒的阴阳性血清，建立了检测FMDV抗体的ELISA方法，为后期的研究打下基础。 2．人工合成O型口蹄疫病毒的多表位基因，并克隆到pMD18-T载体中，命名为pMD18-EG(上海Invitrogen公司完成)。另外，以含有人结核杆菌HSP70基因的质粒(pMD18-HSP70)为模板，设计引物PCR扩增HSP70基因。将目的基因克隆到酵母表达载体pPICZaA中，先后构建四个酵母表达载体pPICZaA-EG、pPICZaA-VP1、pPICZaA-EG-HSP70、pPICZaA-VP1-HSP70。通过电穿孔法将四个表达载体转化到酵母菌X-33中，用Zeocin平板筛选重组子，甲醇诱导表达，经SDS-PAGE电泳鉴定四个重组蛋白的大小分别约为23kD(rVP1)，20kD(rEG)，89kD(rEG-HSP70)，92kD(rVP1-HSP70)，免疫印迹分析后表明重组蛋白均具有免疫反应性。将四个重组蛋白以皮下接种的方式给小鼠进行3次免疫，同时设两组对照组小鼠，分别免疫PBS和常规灭活疫苗，然后通过测定IgG、IgGl、IgG2a、淋巴细胞增殖功能和IL-4、IFN-γ水平来衡量重组蛋白的免疫效果。结果表明重组蛋白既能诱导细胞免疫应答又能诱导体液免疫应答，rEG-HSP70产生的抗体与常规灭活苗相当，而细胞免疫水平从高到低依次为rEG-HSP70，rVP1-HSP70，灭活疫苗，rEG，rVP1。提示，HSP70作为分子佐剂在口蹄疫基因工程疫苗的研究中具有潜在的应用前景，为口蹄疫基因工程疫苗的研究提供一种新的思路。 3．重新设计引物扩增VPl和多表位基因，在多表位基因中加入通用型辅助性T淋巴细胞表位(PADRE)，并命名为EGS，分别将VP1和EGS基因克隆到腺病毒的穿梭载体pAdenoVator-CMV5-IRES-GFP中。得到的阳性穿梭质粒经PmeⅠ酶线性化后，利用电转化技术将线性化的质粒与腺病毒骨架载体pAdeno Vator△E1／E3共转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在大肠杆菌中进行同源重组。将筛选到的重组病毒质：粒经PacⅠ酶线性化后暴露出包装信号，通过脂质体Lipofectamine 2000转染293A细胞后得到重组病毒。利用报告基因GFP检测病毒滴度和感染效率，重组病毒rAd5-EGS和rAd5-VP1的滴度分别为10个TCID／ml和10个TCID／ml，重组病毒经过连续五代传代后效价稳定。通过PCR和w

关键词： 口蹄疫   基因工程疫苗   序列比较  

摘要： 口蹄疫(Foot and mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus, FMDV)引起的主要侵害猪、牛等偶蹄动物的高度接触传染性疾病。在FMDV七个血清型中,O型是发现最早并流行最广的型别之一。目前对其免疫控制的主要手段是灭活疫苗的接种,但有一定局限性,如成本高、接种量大及有散发活毒的危险。为此,我们钓取了O型FMDV流行株VP1的编码基因,并结合中国及周边国家病毒株序列的比较分析,在此基础上,设计、构建了两株牛O型口蹄疫表位肽基因工程疫苗,并对其免疫效果进行了检测。 结果表明:一FMDV流行株的VP1基因与猪O型FMDV病毒株O/HKN/3/75的氨基酸同源性高达98%;O型FMDV西藏株(泛亚)VP1蛋白的RGD基序和G-H环的空间位置与文献所报道的一致;构建的新疆株牛O型蛋白疫苗和西藏株牛O型蛋白疫苗与猪O型FMDV疫苗免疫的阳性血清存在交叉识别;西藏株牛O型蛋白疫苗可在豚鼠诱生出西藏株口蹄疫病毒的特异性抗体。 本研究为研制更为有效的牛O型口蹄疫基因工程疫苗提供了可参考的实验依据。

关键词： HER2/neu   P185c-erbB-2/neu基因工程抗体   紫杉醇   凋亡   耐药性  

摘要： HER2/neu受体是EGFR家族成员中的第2号,在许多上皮肿瘤中过度表达,尤其是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和鼻咽癌等。HER2/neu基因编码一个185KDa的跨膜蛋白,具有胞外区、跨膜区和胞内区三大结构域。EGF样配体触发HER2/neu二聚复合物的形成,受体激活后发生自生磷酸化,并激活PI3K/AKt途径和Ras/MAPK途径,进而诱发细胞的转型、恶性增殖并增强迁移潜能。 研究表明,约30%的乳腺癌患者有HER2/neu基因的扩增和过度表达,HER2/neu受体的过度表达与肿瘤的分级、大小、淋巴结转移有关。HER2过表达的乳腺癌恶性程度高、迁移性和侵润性强,这类患者对化疗药物不敏感,治疗后易复发,总的存活期和无病生存期短。目前治疗复发率高、转移性强的恶性乳腺癌主要是化学疗法,而化疗药物中首推紫杉醇,但针对p185高表达类的恶性乳腺癌却折扣了包括紫杉醇在内的化疗药物的疗效。因此,迫切需要发现更有效的治疗方案。由于HER2的表达水平直接与细胞癌化进程有关,这种极好的靶抗原促进人们去发现一种具有高度专一性的抗癌药物。鉴于HER2定位于肿瘤细胞表面,且它在正常组织中表达量极低,使得它成为一个容易为药物接近的靶分子。该研究组在以往的工作中已成功构建了抗p185单克隆抗体A21,并对它的可变区的基因序列进行了克隆和序列分析,该将单抗的轻链和重链连接在一起构建了单链抗体(scFv),再将其与人的抗体IgG的恒定区Fc片段连接,构建了scFv-Fc嵌合体,即p185基因工程抗体。随后对基因工程抗体进行了细胞增殖抑制作用的检测,初步证明该抗体具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。 本研究旨在探讨基因工程抗体与紫杉醇联用可增强p185高表达人的乳腺癌细胞BT474对紫杉醇的敏感性,并在此基础上探讨p185高表达人的乳腺癌细胞BT474对紫杉醇耐药性的分子机制。为临床诊断和治疗提供参考,以及为将基因工程抗体发展成为抗肿瘤药物提供理论依据。 采用MTS法检测细胞增殖的抑制作用,TUNEL法和Annexin V-FITC/PI法分别定性和定量地检测凋亡细胞。结果发现:基因工程抗体与紫杉醇联用组较基因工程抗体或紫杉醇单用组而言,对BT474增殖的抑制作用具有协同效应,并显著增强对细胞凋亡的诱导作用。采用IP和Westernblot分析HER2酪氨酸的磷酸化水平,Westernblot分析AKt、MAPK、NF-κB磷酸化水平。结果发现:紫杉醇组较基因工程抗体组或联用组而言,HER2酪氨酸、AKt(Ser473)、p44/p42MAPK(Thr202/Tyr204)、NF-κB p65亚基磷酸化水平相对较高。采用EMSA分析NF-κB与DNA的结合活性。结果发现:不同浓度、不同处理时间条件下的紫杉醇组较基因工程抗体组或联用组而言,NF-κB与DNA的结合活性均显著增强。采用FACS分析DNA含量和细胞周期分布,SAS(9.0)软件分析细胞S期百分比与增殖指数的关系。Westernblot分析CyclinD1、VEGF及MMP-9表达水平。结果发现:S期百分比与增殖指数呈典型正相关(r=0.963)。紫杉醇组较基因工程抗体组或联用组而言,S期百分比、CyclinD1、VEGF及MMP-9表达水平均相对较高

关键词： 猪圆环病毒2型   猪细小病毒   伪狂犬病病毒   ORF2基因   VP2基因   核酸疫苗   三价基因工程疫苗   重组病毒   免疫原性  

摘要： 猪圆环病毒病、猪细小病毒病与伪狂犬病是危害全球养猪业的三种重要传染病，分别由猪圆环病毒2型(porcine Circovius Type 2，PCV2)、猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)和伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)引起。目前这三种传染病在猪场并发或继发感染现象较为普遍，给养猪业造成了巨大的经济损失，因此，为了预防和控制这些疾病，安全、高效的疫苗是首要的解决途径。 伪狂犬病毒是一个重要的活病毒载体，具有不感染人、基因组容量大、重组病毒遗传稳定等特点，外源基因可稳定地插入其DNA。因此以伪狂犬病毒基因缺失株为表达载体，将其它病原的保护性抗原基因插入到PRV基因缺失疫苗株中，构建二价或多价基因工程疫苗，可以起到对多种疾病的预防作用。本文分别对PCV2和PPV核酸疫苗及PCV2-PPV-PRV三价基因工程疫苗进行了研究，其主要研究内容如下： ***2基因和VP2基因在哺乳动物细胞中的表达 将PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因酶切分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1+中，筛选重组质粒，分别命名为pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2。然后再将pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2采用脂质体法转染IBRS-2细胞，36小时后收集转染的细胞处理后，经Western blotting检测，结果显示pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2质粒转染的IBRS-2细胞分别在29kD和64kD处出现特异性反应带;而同步转染的pcDNA3.1(+)对照却未出现特异性带，从而表明重组的核酸质粒pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2构建成功，并在哺乳动物细胞中获得表达。 ***2基因和VP2基因核酸疫苗对小鼠的免疫原性及其安全性试验 将猪圆环病毒2型ORF2基因疫苗和猪细小病毒VP2基因疫苗分别肌注免疫Balb／c小鼠两次，于首免后第14天和第56天采血，作间接ELISA抗体检测试验;检测结果显示重组的核酸疫苗都能诱导小鼠机体分别产生抗PCV和抗PPV特异性抗体。于首免后第56天，采用淋巴细胞增殖试验(MTT法)，和流式细胞仪(FACS)法对小鼠的细胞免疫进行检测。淋巴细胞增殖试验(MTT法)结果显示构建的pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2免疫组小鼠的脾淋巴细胞经刀豆素A(ConA)刺激后，其淋巴细胞转化率(刺激指数)分别为1.57和1.68，明显高于PBS空白对照组(刺激指数为1)和pcDNA-3.1(+)组(刺激指数为1.04)，但是低于PPV活疫苗组(刺激指数为1.76)和PCV2活疫苗组(刺激指数为1.69);而T细胞亚类数量的检测结果显示pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2免疫的各试验组小鼠的外周血T淋巴细胞亚类CD8的数量显著增加，而CD4的数量却减少。这些结果表明pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2核酸疫苗均能诱导小鼠产生细胞免疫和体液免疫应答。 提取小鼠各组织器官染色体基因组进行PCR扩增，对基因疫苗的安全性进行检测，结果显示未能从免疫小鼠各组织的基因组扩增出ORF2基因和VP2基因片段，表明ORF2和VP2基因未整合到小鼠染色体上，说明pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2核酸疫苗是安全的。 3．表达PCV2 ORF2和PPV VP2基因的重组伪狂犬病病毒的构建 将PCV2的ORF2基因和PPV的VP2基因酶切依次插入到PRV gI基因缺失通用转移载体***的多克隆位点中，构建转移质粒***2。然后再将该质粒与PRV基因缺失株SA215基因组共转染ST细胞，通过同源重组，构建了融合表达PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因的重组伪狂犬病毒株，命名为SA215(D)。经荧光检测和PCR、Southern转印杂交鉴定，结果表明SA215(D)构建成功;并通过SDS-PAGE电泳和Western免疫印迹检测表明PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因在重组病毒内获得表达，产生大小约120kD的融合蛋白，而融合蛋白中的PCV2 ORF2基因、PPV VP2基因蛋白都仍然保持了原有的免疫原性。此外，SA215(D)株在Vero、IBRS-2、ST和CEF细胞中的增殖滴度与亲本株SA215相比无显著差异，表明外源基因的插入不影响病毒增殖。 4．重组伪狂犬病病毒SA215(D)的形态学和遗传稳定性研究 将PRV基因缺失株和获得的重组病毒SA215(D)的ST细胞培养物进行扫描电镜观察，均能观察到PRV典型的病毒粒子存在，两者形态上无大的差异，表明外源基因的插入不影响病毒的形态。另外，重组病毒SA215(D)在Vero细胞上连续传7代后，分别用VP2基因和ORF2基因的扩增引物进行PCR鉴定，结果均能扩增到O

关键词： 毕赤酵母   基因工程抗体   发酵   纯化   抗人角蛋白Fab  

摘要： 抗体药物已成为当今生物技术药物的支柱产业,截至2006年,FDA已批准26个体内用抗体药物,其中治疗剂21个。抗体药物在全球的年销售额从1997年的3.10亿美元上升到2005年的150亿美元;其在生物制药产业中所占份额也从2000年的1/5上升到2005年的1/3。目前,抗体药物已进入基因工程抗体时代,在全球已报道的10万多种抗体中,基因工程抗体有1000多种。基因工程抗体的快速发展,对于人类重大疾病的诊断、预防与治疗提供了新方法、新途径。但是阻碍基因工程抗体产业化发展的瓶颈是其表达和纯化。目前用于制备基因工程抗体的表达系统主要有原核表达系统(包括分泌表达系统和包涵体表达复性系统)和真核表达系统。其中毕赤酵母表达系统不但具有许多真核表达系统的优点(如翻译后修饰等),而且比其他真核表达系统具有操作简便成本低廉的优点,因此广泛应用于基因工程抗体的表达。本文以毕赤酵母表达的抗人角蛋白Fab抗体片段为目标产品,旨在建立毕赤酵母表达基因工程抗体高效发酵及纯化工艺。 相应研究分为三部分:1).酵母表达条件优化。在摇瓶中,采用正交试验研究甘油添加量、温度、pH三因素三水平对培养阶段酵母生长的影响;研究诱导时机、甲醇添加量、温度、pH四因素四水平对诱导表达阶段蛋白表达的影响。在摇瓶阶段取得较高的细胞密度和蛋白表达量。2).分批-补料发酵工艺优化。在5L发酵罐规模,分别研究不同甘油补加速率对培养阶段酵母生长的影响;研究不同甲醇补加速率对诱导表达阶段蛋白表达的影响;研究不同硫酸铵补加浓度对酵母生长和蛋白表达的影响。通过5L发酵罐放大培养获取较高的细胞密度和蛋白表达量。3).建立和优化分离纯化工艺。采用生物信息学预测蛋白性质,利用蛋白之间的性质差别,选择合适的层析方法,优化层析过程参数,获取高纯度、高回收率、生物功能良好的基因工程抗体。 本课题确定了以下发酵和纯化工艺:1).酵母表达条件:确定1%甘油添加量,29℃,pH6.5为最佳的培养条件,培养结束后4小时开始诱导表达,以1%甲醇添加量,29℃,pH6.25为最佳的诱导表达条件,在摇瓶中细胞密度达OD600=15.3,活性95%,抗体表达量达9mg/L,为发酵罐放大培养奠定了基础。2).分批-补料工艺:确定溶解氧含量(dissolved oxygen, DO)的拐点上升作为最佳的补料时机。以9ml/(L/h)流速补加甘油同时补加硫酸铵至终浓度0.5g/L;以6ml/(L/h)流速补加甲醇同时补加硫酸铵至终浓度1g/L蛋白表达量可以达到较高的,发酵结束时OD600≥250,活性90%,Fab表达量达150mg/L。与摇瓶相比细胞密度提高17倍,Fab表达量提高16倍。3).分离纯化工艺:首先,根据本中心实际以及生物信息学分析确定的蛋白质间疏水性差别确立疏水层析分离。在四种疏水介质中选择疏水性差别最大的介质PPG-600M。其次,确定纯化分离参数:平衡缓冲液为20mM PB+1M(NH4)2SO4,pH7.2;洗脱缓冲液为20mM PB+1M(NH4)2SO4,pH7.2;洗脱方法为30%(2CVs)洗脱液梯度洗脱-60%(2CVs)洗脱液梯度洗脱-100%(2CVs)洗脱液梯度洗脱;再生溶液为6M尿素;柱床高度12.5cm;平衡和再生流速为10ml/min,洗脱流速为5ml/min。经上述分离纯化工艺获得的抗人角蛋白Fab抗体片段纯度≥90%、回收率≥85%,生物功能良好。同时在5L规模证明该工艺具有进一步放大的潜能。 根据以上结果,我们确定了毕赤酵母表达抗人角蛋白Fab抗体片段的最佳培养与诱导表达条件,确定了甘油、甲醇、硫酸铵的补加策略,优化了酵母分批-补料发酵工艺。5L罐发酵结束后,细胞密度和蛋白表达量较摇瓶阶段提高17倍和16倍。成功分离纯化抗人角蛋白Fab抗体片段,解决了该基因工程抗体药物研发的关键问题。初步建立了毕赤酵母表达基因工程抗体高效发酵及纯化工艺。

关键词： C2B8   非霍奇金氏淋巴瘤   CD20   四价基因工程抗体   解离率(off-rate)   CDC   ADCC   凋亡   半衰期(T1/2)  

摘要： Rituximab(C2B8单抗)是美国FDA批准上市的第一个治疗非霍奇金氏淋巴瘤的基因工程抗体，尽管该药在临床治疗中显示出良好的疗效，但仍有48％的患者对该抗体治疗无理想反应，其重要原因是C288与CD20抗原的亲和力较低，因此不能有效杀伤低表达CD20分子的B淋巴瘤细胞。在本研究中，我们设计、构建并表达了2种新型四价结构的C2B8基因工程抗体，由于该抗体具有较低的解离速率(off-rate)，因而能够在体外杀伤低表达CD20分子的B淋巴瘤细胞，具有较C2B8更强的抗肿瘤作用。 本课题通过竞争抑制实验、补体介导的细胞毒实验(CDC)、抗体依赖细胞介导的细胞杀伤实验(ADCC)以及凋亡实验对四价抗体和C2B8抗体的体外生物学功能进行比较分析，同时还探讨了抗体与Clq、Fc受体的结合、抗体在CD20细胞上的解离率、CD20细胞在体外人全血环境中的清除情况以及抗体在动物体内的半衰期(T)。研究结果显示，在体内具有稳定结构的四价抗体因为解离率明显降低而产生了显著强于C2B8的CDC作用，从而能够杀伤低表达CD20分子的肿瘤细胞。通过体外全血中清除低表达CD20肿瘤细胞的实验，进一步证实四价C2B8抗体可通过CDC和ADCC机制发挥作用。本研究可能为低表达CD20B淋巴瘤的治疗提供新型抗体药物。

关键词： 肝癌   单链抗体   表达   基因工程抗体   肝细胞肝癌   环氧合酶-2   血管生成   RNA干扰   环氧合酶抑制剂  

摘要： 利用细胞融合技术成功制备的杂交瘤单克隆抗体(mAb)在疾病的预防和诊治等方面显示出了重要作用,但因为鼠源性抗体在人体应用时容易诱发HAMA,产生不良反应。抗体库技术为制备高亲和性的人源抗体提供了有力工具。该技术无需免疫即可制备全人源性抗体,可有效避HAMA。我实验室利用噬菌体抗体库技术,构建了全人源肝癌单链抗体噬菌体库,并筛选到了一株肝癌特异性单链抗体。 目的 构建单链抗体的原核表达系统,实现蛋白的高效表达,并鉴定其与肝癌组织结合的特异性及亲和力,为其下一步应用研究打下基础。 方法 1全人源肝癌单链抗体载体构建和原核非融合表达及复性,与肝癌细胞特异性结合鉴定。 以肝癌单链抗体噬菌体载体pDAN5/ScFv-D25为模板,利用重叠延伸PCR,将VL和VH基因以(Gly4ser)3 linker连接成单链,将PCR产物连接入T载体并测序,将目的片段酶切插入表达载体pET28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE电泳检测表达情况。对包涵体进行溶解、变性、复性、纯化,得到可溶性目的蛋白,应用细胞ELISA检测与肝癌细胞结合的特异性及亲合能力。 2全人源肝癌单链抗体(D25)在大肠杆菌中的分泌表达及与人体肝癌组织特异性结合鉴定;酶切pGEM/D5载体,酶切片段插入表达载体pET32a+的酶切位点中,转化E. coli BL21trxB,蛋白表达, SDS-PAGE电泳检测表达情况。应用细胞ELISA检测与肝癌细胞结合的特异性及结合能力。 利用63例肝癌组织芯片、5例正常肝组织及3例胰腺癌组织,免疫组化方法检测D25与人体肝癌组织特异性结合情况。 结果 1构建了D25原核表达载体,经IPTG诱导,成功获得了表达,表达蛋白相对分子质量32KD左右。目的蛋白表达量占菌体总蛋白的26%,包涵体经过复性纯化后,细胞ELISA鉴定能与SMMC-7721细胞特异性结合,亲和常数为:3.6×107 L/mol。 2构建了pET32/d25单链抗体载体,转化E. coli BL21trxB诱导表达后,成功获得目的蛋白与TrxB蛋白融合可溶性表达,表达产物主要存在于周质腔中。SDS-PAGE电泳检测结果表明:融合蛋白分子量为42KD左右。ELISA检测,表达产物与SMMC-7721细胞有很好的结合活性,利用组织芯片行免疫组化结果显示其与5例正常肝组织及3例胰腺癌组织无结合,而与人肝癌细胞结合阳性反应率68.3%(43/63),与前两组比较差异显著。 结论 通过噬菌体抗体库筛选得到的肝癌特异性单链抗体可以通过原核表达系统,实现蛋白的高效表达;肝癌特异性单链抗体能与肝癌SMCC-7721细胞系及人肝癌组织特异性结合,并且有较强的亲和力,为今后进行免疫学检测和开发肿瘤靶向治疗提供了研究手段。 在亚洲、非洲地区,在患恶性肿瘤病人中,肝细胞肝癌(HCC)是导致患者死亡的主要原因,尽管目前对肝癌可以采取手术切除、动脉插管化疗、放疗及局部治疗等方法,但效果欠佳,人们一直在寻找一种有效治疗肝癌的途径,抑制肝癌血管生成是治疗肿瘤的新策略。 目的 肿瘤新生血管形成在肿瘤发生发展过程中起着重要作用。本实验主要探讨COX-2在肝癌及其诱导血管形成过程中的作用机制及途径。 方法 1.构建COX-2小干扰RNA(siRNA)表达质粒,设计有小发夹结构的2条COX-2 siRNA对应模板DNA序列,煺火处理后克隆至pSIREN-Shuttle质粒,构建重组质粒pSIREN/COX-2 siRNA,同样方法构建阴性对照质粒pSIREN/negative siRNA。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,酶切鉴定,再将pSIREN/COX-2 siRNA和pSIREN/negative siRNA转染HuH-7细胞系,构建稳定转染细胞系,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Westernblot检测COX-2表达。采用PGE2试剂盒检查细胞培养液PGE2的变化情况。 2.利用基因芯片技术观察COX-2特异性抑制剂SC-58635应用后HuH-7细胞系所表达的与血管形成相关的22条基因的变化情况。根据基因芯片法抽提细胞mRNA,进行反转录cDNA探针,与GEArray Q Series Human CancerPathway Finder Gene Array芯片进行杂交,并对结果进行分析。 3.分别利用选择性COX-2抑制剂(SC-58635)和COX-2siRNA抑制HuH-7细胞系COX-2的表达,收集抑制前后HuH-7细胞培养液,研究以上培养液在体外对人脐静脉血管内皮细胞增殖能力、迁移能力及细胞小管形成能力的影响,以及在体内对血管生成的影响。 结果 1.酶切电泳证实,重组质粒pSIREN/COX-2 siRNA和pSIREN/negative si