关键词： 肿瘤   血管内皮   血管内皮生长因子受体   单抗   基因工程抗体  

摘要： 临床肿瘤治疗失败的主要原因之一是肿瘤发生侵袭和转移,怎样才能阻断肿瘤的转移已成为肿瘤治疗的基础和临床研究的热点课题之一。近几十年来,大量研究结果证实肿瘤的增殖、侵袭和转移与肿瘤的血管新生(angiogenesis)密切相关,这一发现极大的促进了该领域的研究开展。近些年来,随着血管新生相关机制研究的深入,使得通过抑制肿瘤血管新生来抑制肿瘤生长的理念得到越来越多基础和临床研究的证明。 VEGF被认为是在血管生成过程中起中枢调节作用的因子,它通过促进血管新生从而促进肿瘤生长和转移。现已发现的VEGF受体包括VEGFR-1、-2、-3和NRP-1、NRP-2,其中VEGFR-2(Kinase insertdomain-containing receptor,KDR)作为血管内皮细胞生长因子主要受体之一,在内皮细胞增殖、迁移、分化、微管形成、血管通透性增加中发挥重要作用。KDR属酪氨酸蛋白激酶第Ⅲ亚型,它的胞外区包括7个免疫球蛋白样结构域,其中区域Ⅱ和区域Ⅲ对与VEGF的相互作用贡献较大。缺失区域Ⅲ会引起KDR与VEGF结合的亲和力下降1000倍,因此说明区域Ⅲ尽管未必直接参与结合配体,但在VEGF/KDR相互作用中发挥关键作用。 我们将含有KDR胞外Ⅲ区基因质粒(含有碱性磷酸酶(phoA)启动子和引导肽stⅡ的分泌型表达载体pAYZ),在大肠杆菌16C9中获得了高效分泌可溶性表达。采用三角瓶摇瓶培养。表达产物经抗E-tag亲和层析纯化,获得纯度90%以上的KDR胞外Ⅲ区融合蛋白。 随后,基于上述表达出的KDR胞外Ⅲ区融合蛋白,按照常规制备杂交瘤的方法,我们制备出一株能稳定分泌抗KDR胞外Ⅲ区单克隆抗体的杂交瘤细胞株YcomlD3。体外生物活性研究表明,该单克隆抗体不仅可与可溶性KDR胞外Ⅲ区蛋白抗原以及细胞表面表达的KDR结合,还可竞争性抑制VEGF65与可溶性KDR胞外Ⅲ区蛋白抗原的结合,具有潜在的抗肿瘤血管新生临床应用价值。 为克服鼠源性单抗自身固有的一些缺陷,我们借助基因重组的方法,构建出其相对应的Fab样基因工程抗体,即通过采用通用简并性引物,成功克隆了抗KDR单克隆抗体YcomlD3轻、重链可变区基因,尔后,将VL、VH基因分别克隆到含有人IgG1 CL和CH1的中间载体pB11和pB12上,然后再通过酶切将获得的VL+CL和VH+CH1基因重组到载体pA19,构建成抗KDR Fab样抗体片段表达载体pAYZKDRFab,并在大肠杆菌中获得了表达。ELISA实验表明该基因工程抗体保留了亲本单克隆抗体的特异性结合活性,并可竞争性抑制VEGF65与可溶性KDR胞外Ⅲ区蛋白抗原的结合,具有潜在的抗肿瘤血管新生临床应用价值。

关键词： CD22   人源化基因工程抗体   巴斯德毕赤氏酵母   昆虫杆状病毒   蛋白表达  

摘要： 1997年，美国FDA批准了有史以来第一个癌症治疗的裸抗体——“美罗华”嵌合抗体(Rituxan)。尽管美罗华对非霍奇金淋巴瘤(NHL)有效而且毒性可以控制，但并不是对所有的病人都有疗效，甚至所有有治疗反应的病人最后都会复发，然而美罗华激励研究者去寻找新的靶点。CD22是众多靶点中的一个，表达于正常和癌变的B细胞表面。以CD22为靶点的治疗不会影响任何不表达CD22的组织，也不会抑制新的B细胞生成。 NHL的治疗方法有放射治疗、外科治疗、生物治疗等。免疫导向治疗作为生物治疗的一种，在淋巴瘤治疗中将发挥重要作用。研究结果表明，多价微型抗体由于抗原结合位点数目的增加而有效地提高了其亲和性，所形成的抗原-抗体复合物更为稳定，更适宜于免疫导向治疗。 本实验的主要目的是探索表达抗CD22人源化基因工程多价微型抗体的方法，以期获得表达目的抗体的基因工程菌株和重组病毒株。 本实验首先通过PCR分别扩增出目的基因Fc-500、CH3-1300、Fc-1600，再通过亚克隆构建分泌表达质粒pPIC9-CH3和pPIC9-Fc，电转化到巴斯德毕赤氏酵母GS115中，通过同源重组，将目的基因整合到GS115基因组中进行表达。研究表达产物，证明获得可以表达抗CD22人源化基因工程多价微型抗体的菌株GS115-CH3、GS115-Fc。将这两株酵母菌传代4次后，通过PCR检测，证明这两株菌都具有较高的稳定性。 另外，构建表达质粒pAcSG2-CH3和pAcSG2-Fc，将pAcSG2-CH3质粒转染Sf9细胞，通过空斑纯化重组杆状病毒Sf9-CH3，病毒滴度为4.5×10pfu／ml，并进行相应的检测。结果表明，获得了在昆虫杆状病毒稳定表达抗CD22人源化基因工程多价微型抗体的重组病毒株。

关键词： 猪口蹄疫   鸡蛋   粉状   仔猪断奶   基因工程疫苗   鼻病毒   口蹄疫病毒   养禽场   养鸡场   猪日增重  

关键词： 植物耐逆性   高羊茅   高冰草   小麦/高冰草体细胞杂种山融3号   高羊茅耐盐转基因育种   NHX基因   过氧化物酶基因   农杆菌介导转化   氧化胁迫   过氧化物酶变化  

摘要： 土壤盐碱化是一个世界性的问题，现在进行盐地开发的有效途径是培育新型的耐盐作物品系。草业可持续发展是我国经济实现可持续发展的重要保证，而抗旱、耐盐碱牧草育种则是我国草业发展的重大技术需求和提高农业产量的一项基本国策。高羊茅(tallfescue，Festuca arundinacea Schreb．)属于禾本科羊茅属(Festuca)，为多年生草本植物。高羊茅是一种多年生冷季型草，营养价值极高，具有耐瘠薄、抗锈病、适应性强等特性，作为牧草和草坪草都有广泛的应用。利用基因工程技术改良其耐逆性对保持草坪四季常绿，节约水资源，扩大建植区域，尤其是对改善我国西部地区的生态环境具有十分重要的意义。作为“国家十五重大科技专项—转基因植物研究与产业化专项课题”的资助项目之一，本研究建立了高羊茅组织培养再生体系、构建Na／H逆向转运蛋白基因遗传转化载体、建立了有效的农杆菌介导高羊茅转基因方法、对转基因植株完成了分子鉴定和遗传分析及后代的耐盐性测定，获得耐逆性增强的转基因T代株系，为牧草转基因新品种的培育奠定了基础。此外，本实验从耐盐植物高冰草及小麦／高冰草体细胞杂种耐盐小麦新品种山融3号中分别克隆了与耐逆相关的Na／H逆向转运蛋白基因和过氧化物酶基因，初步分析其在植物耐逆中的可能作用。 ***／H逆向转运蛋白基因AtNHX1对高羊茅耐盐的作用 盐碱地对于植物生长的影响主要是通过Na对细胞的毒害作用引起。本实验建立了8种高羊茅下胚轴组织培养再生体系，以其中4种Forager、BLASER、G1和Fine-Lawn的胚性愈伤组织为材料，将筛选基因nptⅡ和由烟草CaMV 35S和玉米Ubiquitin启动子驱动的拟南芥Na/H逆向运输蛋白基因导入这4个品种中，建立了农杆菌介导的高羊茅遗传转化体系并且获得了可遗传的高羊茅转基因后代。 T代PCR分析和基因组Southern杂交鉴定证实了AtNHX1基因已经整合到高羊茅基因组中，并以单拷贝或双拷贝形式存在。T-T代的PCR和Southern杂交证实转基因后代遗传了AtNHX1，RT-PCR分析表明外源基因AtNHX1在转基因后代中表达，并且不同株系的表达量有差异。通过耐盐生理指标分析转基因高羊茅后代的耐盐性，证明转基因高羊茅通过Na在液泡中的区隔化，降低了叶片细胞质中Na浓度，从而提高植株的耐盐性。通过上述实验，我们从转基因T株系中选出4个单拷贝插入、遗传稳定、耐盐性强的株系申请安全性环境释放，已经获得农业部批准(批准号：No．2006-T048)。本研究为高羊茅的基因工程育种与遗传改良奠定了基础。 2．单子叶耐盐植物Na／H逆向转运蛋白基因的全长cDNA克隆及与拟南芥该基因对植物耐盐性的比较研究 本实验从耐盐植物高冰草(Agropyron elongatum Host Nevski)中克隆了Na／H逆向转运蛋白基因的全长cDNA序列TeNHX1和TeNHX2，并且与其它植物进行了聚类分析。通过盐敏感酵母突变体(AXT3)互补实验比较了高冰草TeNHX1、TeNHX2、高羊茅FaNHX(本实验室克隆)和拟南芥AtNHX1对耐盐性的不同贡献。结果表明：TeNHX1、TeNHX2、FaNHX1的氨基酸序列与滨藜、水稻、大麦、小麦Na／H逆向转运蛋白具有较高的同源性，高冰草TeNHX1与小麦TaNHX及水稻OsNHX2较近缘，而高冰草TeNHX2与大麦HvNHX1及水稻OsNHX1的亲缘关系更近一些。在200 mM盐浓度下，FaNHX1和TeNHX1对酵母突变体的互补效果最好，其次是TeNHX2，而AtNHX1最差，这可能是由于非保守区序列上的差异造成了不同植物Na／H逆向转运蛋白活性不同。 对高冰草的RT-PCR分析表明：NHX基因的表达具有组织特异性，在盐处理下表达量有变化，这与其区隔化Na的功能一致。在没有盐诱导的条件下，根和叶中均有表达，说明在正常生长条件下NHX也具有维持细胞内离子平衡的作用，NHX在转录水平的调节可能是决定植物耐盐能力的重要因素。分别构建了这几个不同来源Na／H逆向转运蛋白基因的表达载体，对单／双子叶模式植物拟南芥／水稻进行遗传转化，为进一步通过过量表达分析基因功能奠定了基础。为不同植物NHX基因功能的比较研究及其在基因工程中应用以及评价不同学者对NHX基因功能的争议提供理论依据和实验基础。 3．小麦与高冰草体细胞杂种耐盐新品种山融3号耐逆相关过氧化物酶基因的克隆 利用不对称体细胞杂交技术可向小麦转移异源植物的耐盐基因。本实验室以普通小麦(Triticum aestivum L)济南177胚性悬浮细胞来源的原生质体为受体，野生耐盐近源植物高冰草(Agropyron elongatum Host Nevski)悬浮细胞系原生质体经紫外线照射后为供体，进行不对称体细胞杂交，在国际上首

关键词： 口蹄疫病毒   序列分析   重组鸡痘病毒   重组核酸疫苗   免疫应答  

摘要： 本研究通过RT-PCR的方法获得了本室保存的O/LZ株FMDV的结构蛋白P1基因序列。并运用计算机技术和分子生物学软件,分别对FMDV结构蛋白的二级结构和B细胞抗原表位进行了预测和分析,为开发FMD新型疫苗提供了分子生物学材料和理论依据。 利用改造后的真核表达载体(pVIR)和重组鸡痘病毒表达载体(pUTAL),分别构建了两株共表达FMDV衣壳蛋白前体P1-2A基因、蛋白酶3C基因和猪白细胞介素18(sIL18)基因的重组疫苗:pVIR-P1-2A-IL18-3C和rFPV-P1-2A-IL18-3C。并通过RT-PCR、IFA等方法进行鉴定。 将构建的两株FMDV重组疫苗以单独或联合免疫的方式免疫小鼠,并对其诱导的体液和细胞免疫指标进行检测。结果表明,两株FMDV重组疫苗均能诱导小鼠产生特异性的体液及细胞免疫应答。其中,以重组鸡痘病毒首免,两次重组核酸疫苗加强免疫的方式进行的联合免疫效果更好。该结果为进一步的大动物免疫或者攻毒实验奠定了基础。

关键词： 伪狂犬病(PR)   繁殖与呼吸综合症(PRRS)   口蹄疫(FMD)   乙型脑炎(JE)   基因工程疫苗  

摘要： 在现行养猪生产中，猪伪狂犬病(PR)，猪口蹄疫(FMD)，猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)，猪乙脑(JE)是几种常见的流行病，也是猪群重要防疫的几种传染病，其危害在大规模化养殖中越来越大。 这四种病在日常的防疫中是必不可少的免疫预防疾病，如果能够同时预防好这四种疾病，在养猪生产中即可获得相当的成功，但由于各地的疫苗质量不一样，免疫效力也难以相同，特别是国外进口疫苗的冲击，其质量和效益对养猪生产带来很大的困惑。 由华中农大已经研制成熟的伪狂犬病毒基因工程疫苗在我国伪狂太病的预防和净化上起了重要的作用。另外，伪狂犬病毒也是一个十分优良的重组疫苗载体，由华中农大动物传染病研究室研制成功的以伪狂犬病毒为载体的二价基因工程疫苗为解决生产实际的问题提供了很好的手段，其理论上的成熟，以及在实际应用中的效果，都为当前养猪疾病预防和控制提供了新的方法。 本试验将分别以rPRV-JEV，rPRV-PRRSV和rPRV-FMDV三种重组疫苗免疫PRV，JEV，PRRSV，FMDV阴性的40-50日龄的三元仔猪，检测免疫猪只的抗体水平。 通过本试验，可以证明以PRV为载本的二价基因工程疫苗其免疫效力达到或优于同类单联苗，为实际生产中应用疫苗提供了选择依据。

关键词： 圆环病毒   疾病   梅里亚   基因工程疫苗   PMWS   采访实录   创新  

摘要： 猪圆环病毒病作为一种被确认的独立的疾病,其随着养猪业的规模化、集约化发展及确诊率的递增,逐渐为养猪从业者所认识。但相对于其它的猪病而言,该病在防疫措施及流行病学等方面,对中国的养猪工作者而言还相对陌生。为此,我刊于2007年4月对梅里亚公司的全球猪病技术总监Francois JOISEL先生、亚洲区家畜技术经理Henry TOO及中国家畜事业部余崇业经理就猪圆环病毒病(Porcine Circovirus Disease,PCVD)的大众较为关心的问题进行了采访,现整理如下,以飨读者!

关键词： B7-H4   单克隆抗体   单核细胞   肿瘤   基因工程抗体  

摘要： B7-H4分子是新近发现的B7家族又一负性协同刺激分子。尽管其mRNA在淋巴和非淋巴组织中呈广泛性表达,但由于受到转录后水平的严格调控,B7-H4蛋白仅在正常组织中呈现微弱的表达。越来越多的研究发现,在肿瘤组织如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、肾癌和腺样囊性癌等的肿瘤细胞以及肿瘤相关巨噬细胞中异常高表达B7-H4分子。在B7-H4信号的作用下,肿瘤周围的CD3+T细胞数量显著减少,活化CTL的增殖受到明显抑制,机体抵抗肿瘤的免疫应答大为削弱。与此同时,B7-H4分子还能抑制肿瘤自身的凋亡,促进上皮细胞恶性转化,为肿瘤免疫逃逸提供了必要的条件。临床研究发现,肿瘤细胞B7-H4的表达与临床和病理学特征息息相关。高表达B7-H4的患者往往肿瘤恶性程度高,预后结果差。此外,在肿瘤患者血清中高水平可溶性B7-H4分子的存在,还为肿瘤患者的临床诊断,尤其是卵巢癌的早期发现,提供了新的检测指标和依据。为此,继负性协同刺激分子B7-H1,B7-H4成为研究肿瘤免疫逃逸和临床诊断治疗的新热点。 本研究旨在以高表达B7-H4的基因转染细胞为抗原,应用细胞融合技术,研制鼠抗人B7-H4单克隆抗体,为进一步探求B7-H4分子在肿瘤免疫逃逸中的生物学特性和意义提供有效的研究手段,进而为临床诊断、预后和治疗开拓新的道路。 一.鼠抗人B7-H4分子功能性单克隆抗体的研制及生物学特性的鉴定 【目的】研制鼠抗人B7-H4单克隆抗体,为探讨人B7-H4分子在免疫细胞上的表达特性及其介导的负性信号对人T淋巴细胞抑制作用的效应提供必备的研究手段。 【方法】以高表达人B7-H4分子的基因转染细胞株293T/B7-H4为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,并以该基因转染细胞293T/B7-H4作为阳性筛选细胞,以转空质粒的对照细胞293T/Mock作为阴性对照细胞。经间接免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选和多次克隆化培养,获得能特异分泌鼠抗人B7-H4分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用细胞核染色体计数、Ig亚型快速定性试纸法、竞争结合抑制以及Western blot等实验对获得的杂交瘤细胞株及单克隆抗体进行生物学特性的鉴定;用间接免疫荧光法初步分析单抗对正常人外周血淋巴细胞表面B7-H4蛋白的识别作用以及单核-树突状细胞诱导过程中B7-H4分子表达的变化。向293T/B7-H4与T细胞的混合反应体系中加入单抗3C8,用3H-TdR掺入法检测单抗对B7-H4信号抑制活化T细胞增殖的阻断效应。 【结果】成功获得了1株持续、稳定分泌鼠抗人B7-H4单克隆抗体的杂交瘤细胞株3C8,细胞核型分析显示,杂交瘤细胞株的染色体数目在100条以上,超过小鼠B细胞和SP2/0细胞的染色体数,为两者融合体细胞;快速定性试纸分析显示,这株单抗轻链为κ链,重链为IgG1亚类;Western blot分析结果显示单抗3C8能与B7-H4分子特异性结合,形成阳性条带;单抗识别的抗原表位分析结果表明,单抗3C8与商品化抗体H74识别的抗原表位较为接近,而与科室已有的一株鼠抗人B7-H4单抗1G7的抗原识别表位完全不同。流式细胞仪检测结果表明,单抗3C8能检测到健康人外周血CD14+单核细胞上B7-H4的表达,而在CD4+、CD8+、CD19+和CD56+淋巴细胞上则均未检测到B7-H4分子。此外,在单核-树突状细胞的诱导过程中,IL-4能下调B7-H4的表达,而LPS刺激imDC后则能上调表达B7-H4,GM-CSF对B7-H4表达的影响不明显。3H-TdR结果显示,单抗3C8能有效地阻断B7-H4信号对活化T细胞增殖的抑制效应。 【结论】成功获得了1株持续、稳定分泌鼠抗人B7-H4阻断型单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其不同的抗原表位为进一步研制可溶性B7-H4分子ELISA试剂盒奠定了良好的基础。同时,健康人外周血CD14+单核细胞上B7-H4表达的变化以及单抗3C8对B7-H4信号地阻断作用,为进一步研究机体免疫自稳和免疫调节开拓了道路。 二.B7-H4分子在肿瘤细胞中表达特性的初步研究 【目的】探寻肿瘤细胞和肿瘤微环境中B7-H4分子的表达特性,为进一步研究B7-H4与肿瘤免疫逃逸及其相互关系开拓新的途径。 【方法】采用间接免疫荧光标记法和流式细胞术分析不同来源人肿瘤细胞株以及肿瘤患者胸、腹水中CD14+单核细胞膜表面B7-H4分子的表达;采用细胞免疫组化分析B7-H4分子在肿瘤(肺癌)细胞株中的分布;Western blot鉴定肿瘤和肿瘤微环境中B7-H4蛋白的表达形式和糖基化修饰水平;同时运用RT-PCR技术检测B7-H4分

关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒   ORF5   ORF6   异源二聚体   DNA疫苗   重组伪狂犬病毒   免疫效力和免疫保护  

摘要： 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病。PRRS自1987年首次报道发现于美国以来，现已遍及世界各主要养猪国家与地区，并已成为危害养猪业最严重的传染病之一。同其它病毒病的防制一样，免疫接种仍是预防与控制PRRS的主要措施。目前用于预防PRRS的主要商用疫苗是传统的常规弱毒疫苗和灭活疫苗，但由于存在弱毒疫苗散毒和灭活疫苗免疫效果不理想等原因，使得这两种疫苗的使用都存在着一定的争议。因此，研制更安全、高效、廉价的新型疫苗成为越来越多研究者关注的焦点，但目前的试验性疫苗普遍存在诱发保护性免疫不高的问题，使得对于PRRSV的新型疫苗的研究进展一直比较缓慢。 鉴于此，本研究对PRRSV新型疫苗设计进行了新的探索，构建了以西门利克森林病毒(SFV)为复制子的“自杀性”DNA疫苗和伪狂犬病毒(PRV)为载体的重组PRV-PRRSV新型基因工程疫苗，并对构建的候选疫苗进行了免疫效力和免疫保护研究，主要研究内容如下： 1、天然ORF5基因的修饰 ORF5基因编码的囊膜糖蛋白GP5是PRRSV的主要免疫原性蛋白，也是目前研制PRRSV新型疫苗的主要靶蛋白。但单独基于天然ORF5基因构建的一些试验性疫苗普遍存在诱发中和抗体缓慢和不高的问题。为了获得用于研制PRRSV新型疫苗的良好靶基因，将通用型辅助性T淋巴细胞表位(PADRE)插入ORF5基因的中和表位和覆盖表位间，获得修饰后的ORF5基因ORF5m，以期达到充分暴露中和抗体表位，诱发更强的免疫应答的目的。进一步以DNA疫苗的形式进行了ORF5m的体外表达和免疫原性研究。Wsetern blot证实ORF5m能够表达25～26 kDa的GP5m蛋白，并能够较好地与PRRSV的高免猪血清发生特异性结合，间接免疫荧光试验(IFA)表明GP5m蛋白与天然的GP5蛋白同样定位于细胞质中。小鼠免疫试验结果表明：修饰后的DNA疫苗pCI-ORF5m诱导的中和抗体、抗GP5蛋白ELISA抗体和淋巴细胞增殖反应均明显优于未经修饰的DNA疫苗pCI-ORF5，表明修饰型ORF5m基因具有更好的免疫原性，可作为PRRSV新型疫苗开发的候选靶基因。 2、GP5／M异源二聚体的形成及其对GP5蛋白亚细胞定位和诱发免疫反应的影响 由ORF5基因编码的GP5蛋白与ORF6基因编码的M蛋白在成熟的病毒粒子和感染的细胞内可以形成异源二聚体GP5／M。为了探讨GP5蛋白和M蛋白体外共表达特性及对免疫反应的影响，分别构建了PRRSV ORF5、ORF6单基因真核表达质粒pCI-ORF5、pCI-ORF6和双基因共表达的真核表达质粒pCI-ORF5／ORF6。转染BHK-21细胞，Westem blot检测证实共表达的GP5和M蛋白能够形成异源二聚体，并且这种异源二聚体的形成能促进GP5蛋白从内质网向高尔基体转运。将构建的真核表达质粒免疫小鼠后，发现共表达GP5和M蛋白的DNA疫苗pCI-ORF5／ORF6免疫小鼠于首免后4周开始产生可检测特异性中和抗体，到首免后8周达到最高，而pCI-ORF5和pCI-ORF6免疫组只有部分小鼠产生了可检测特异性中和抗体。并且pCI-ORF5／ORF6免疫组产生的特异性淋巴细胞增殖反应也最高。而且，GP5和M蛋白共表达免疫小鼠所产生的特异性抗GP5蛋白的ELISA抗体水平也显著增强。进一步进行仔猪免疫试验证实，pCI-ORF5／ORF6免疫仔猪于首免后10周中和抗体全部阳转(≥1∶8)，而单独表达GP5蛋白的pCI-ORF5免疫仔猪至试验结束时未检测到特异性中和抗体的产生。研究表明GP5／M异源二聚体的形成可能与GP5蛋白的翻译后修饰、转运、定位相关，并可促进免疫动物产生特异性的免疫应答。 3、PRRSV DNA疫苗的构建和免疫效果 以小鼠为模型动物，探讨了ORF5m和ORF6双基因共表达的常规DNA疫苗pCI-ORF5m／ORF6和“自杀性”DNA疫苗pSFV-ORF5m／ORF6的免疫效力。结果，所有DNA疫苗免疫小鼠均于首免后4周产生了可检测的特异性中和抗体，于首免后8周达到最高。共表达修饰型ORF5m和ORF6基因较共表达天然ORF5和ORF6基因的DNA疫苗能够诱发更高的中和抗体，而“自杀性”DNA疫苗又较常规DNA疫苗诱发更强的淋巴细胞增殖水平。结果表明ORF5m和ORF6双基因共表达的“自杀性”DNA疫苗pSFV-ORF5m／ORF6能够诱发最高的中和抗体和细胞免疫应答，是一种具有良好发展前景的PRRSV新型候选疫苗。 4、伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒(rPRV-PRRSV)重组基因工程疫苗 构建了以致弱的伪狂犬病毒(PRV)为载体表达PRRSV两种主要膜相关蛋白(GP5和

关键词： D抗原   Rh(D)抗体   人源Fab抗体库   基因工程抗体  

摘要： D抗原是所有血型系统中除A,B抗原之外最有效力的红细胞表面抗原,其对应的抗体为Rh(D)抗体,Rh(D)抗体具有很重要的临床意义。对于输血患者,会引起急性溶血性输血反应;对于D阳性胎儿,母体产生的Rh(D)抗体,能通过胎盘进入胎儿体内,引发新生儿溶血病(HDN)。可见研制Rh(D)抗体具有重要的临床应用价值。不过,由于小鼠的免疫系统不能识别单独的D抗原,无法采用传统的杂交瘤技术制备Rh单抗。 本研究通过RT-PCR的方法,成功地从RH血型阴性血清Rh(D)抗体阳性患者的外周血淋巴细胞中扩增出人的Fab基因片断,将其克隆入噬菌粒载体pComb3中,电穿孔转化感受态大肠杆菌XL1-Blue,加入辅助噬菌体VCSM13超感染,构建了库容量为7.4×10～6的人源性Fab段噬菌体抗体库。 利用Rh(-)RBC、Rh(+)RBC两种红细胞对构建好的噬菌体抗体库分别进行五轮“吸附-洗脱-扩增”的阴阳差异筛选,进行Rh(D)抗体的淘筛富集。获得1株表达Rh(D)抗体的阳性克隆,利用血凝试验和western-blot进行鉴定,结果表明克隆正确。经测序比对,VH属VH3-23亚群家族,Vκ属VκⅢ亚群Ⅸ家族。 本研究通过克隆Fab基因构建了大库容量的人源性Fab段噬菌体抗体库,并通过淘筛法获得1株表达Rh(D)抗体的阳性克隆。为我国研制Rh(D)人源全分子IgG基因工程抗体和防治新生儿溶血病及溶血性输血反应的奠定了基础。