关键词： 猪细小病毒   基因组序列   PRV   引物   PPV   可饲疫苗  

摘要： 1病毒的分子检测技术1.1PCR检测技术Moliter等根据PPV基因组序列设计了一对引物,扩增VP2基因中158bp的片段,利用酶切和探针杂交证实了扩增产物的特异性,同时对四株PPV及CPV、PRV的扩增结果进一步证实了PCR反应的特异性,该方法至少可以检出100fg的PPV DNA。

关键词： 溶藻弧菌   单链抗体   原核表达   免疫原性   基因工程疫苗  

摘要： 目的构建溶藻弧菌抗独特型单链抗体(scFv)的原核表达载体,并对其表达的蛋白进行免疫原性鉴定。方法从分泌溶藻弧菌抗独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2F4)中已获得的该抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),通过基因重组构建scFv及原核表达载体pET32a-AL,转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达。表达后的重组蛋白利用动物免疫试验进行免疫原性鉴定。结果scFv基因序列全长747碱基对,编码249个氨基酸,符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有框架区(FRs)、抗原互补决定区(CDRs)及抗体特征性的半胱氨酸残基。ELISA测定和动物免疫试验显示抗独特性抗体的scFv具有与溶藻弧菌一样的免疫原性。结论成功构建了抗溶藻弧菌独特型抗体scFv原核表达载体并表达于包涵体中,表达的融合蛋白具有与溶藻弧菌一样的免疫原性,为溶藻弧菌抗独特型单链抗体scFv成为鱼用基因工程疫苗奠定了初步基础。

关键词： 产肠毒素性大肠杆菌   基因载体构建   原核表达   乳酸菌   基因工程疫苗  

摘要： 为了研制产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic ***，ETEC)基因工程疫苗，根据已发表的K<,88>ac和LT<,B>基因序列，分别设计并合成一对K<,88>ac引物和一对LT<,B>引物，利用PCR技术，从大肠杆菌C<,83902>中扩增出K<,88>ac基因和LTB基因，将扩增的DNA片段进行分离、纯化、限制性内切酶酶切、T<,4>DNA连接酶连接，获得重组质粒pQE30-K<,88>ac和pQE30-K<,88>ac-LT<,B>，并转化入XLl-Blue宿主菌，构建含有K<,88>ac和K<,88>ac-LT<,B>融合基因表达载体的重组菌株XL1-Blue(pQE30-K<,88>ac)和XLl-Blue(pQE30-K<,88>ac-LT<,B>)。经酶切鉴定和DNA序列分析证实，构建的重组质粒pQE30-K<,88>ac和pQE30-K<,88>ac-LT<,B>中含有K<,88>ac和K<,88>ac-LT<,B>融合基因，且基因序列和阅读框架均正确。将重组菌株XLl-Blue(pQE30.

关键词： 科技领域   大农业   作物种质资源   转基因抗虫棉   动物克隆技术   基因工程疫苗   三系杂交棉   成效显著  

摘要： 作物种质资源核心种质构建和创新，超级稻研究与推广成效显著，转基因抗虫棉及三系杂交棉取得进展。

关键词： 狂犬病   疫苗   抗体  

摘要： 由于狂犬病动物传染源广泛存在,控制难度较大,一旦发病目前尚无法医治,所以研制狂犬病的预防制品非常重要。本文就新型狂犬病疫苗及狂犬病病毒基因工程抗体的研究进展进行比较全面的综述。

关键词： 问号钩端螺旋体   属特异性抗原   外膜蛋白   重组表达   分子定位   免疫应答   保护抗原   基因工程疫苗  

摘要： 问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)(简称钩体)感染引起的钩端螺旋体病(Leptospirosis)是全世界范围内广泛流行的自然疫源性人兽共患病，尤其多见于水稻种植地区，因而我国是钩体病的主要疫区之一。问号钩体自然宿主众多，并可在宿主肾脏长期生存、繁殖并随尿液排出，污染土壤和水源，人类通过接触疫土和疫水而感染，故钩体病是各国洪涝灾害时重点防疫和监控的传染病之一。\n 接种疫苗是预防和控制钩体病流行最有效的措施。但钩体血清群众多，各群间交叉保护作用较弱或无，不同地区优势钩体血清群、型可有明显差异，故目前国内外均采用当地流行的主要钩体血清群、型来制备多价全菌死疫苗。多价钩体全菌死疫苗副作用较大，且对其未包含的其它钩体血清群感染保护作用极其有限。由我国学者研制的国际上首个钩体组分疫苗——多价外膜疫苗，虽有免疫效果好、副作用小等优点，但仍无对不同钩体血清群的交叉免疫保护力。因此，寻找钩体属特异性保护抗原，进而研制出对不同血清群有广泛免疫交叉保护作用的通用型钩体基因工程疫苗，对预防和控制钩体病具有重要意义。\n Shang、Haake和Cullen等先后分别从问号钩体基因组DNA中克隆了全长819 bp、编码272个氨基酸的lipL32基因、全长1068 bp、编码355个氨基酸脂蛋白的lipL41基因，全长1014bp、编码337个氨基酸的ompl1基因和全长561bp、编码186个氨基酸的lipL21基因并认为上述基因存在于所有问号钩体菌株中。我们以往的研究结果证实，我国15群15型致病性问号钩体参考标准株基因组DNA中均可扩增出上述全长基因片段，但分别存在lipL32/1和lipL32/2、lipL41/1和lipL41/2、ompl1/1、ompl1/2和ompl1/3基因型。其中lipL32/1和lipL41/1基因型包含了我国所有主要流行的钩端螺旋体血清群，如黄疸出血群、流感伤寒群、赛罗群、波摩那群、七日热群、秋季群和犬群等，而含有ompL1/3基因型的钩体血清群引起人类钩体病极为罕见，因此不作为此次研究的对象。\n 由于保存不当，lipL41/2原核表达系统丢失，为了确保实验的完整性，本研究重新构建了lipL41/2原核表达系统，其它原核表达系统由浙江大学病原生物教研室提供。IPTG诱导rLipL21、rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLip41/2、rOmpL1/1和rOmpL1/2表达，采用Ni-NTA亲和层析法，提取了四种钩体外膜蛋白主要基因型重组表达产物。SDS-PAGE检测重组蛋白的表达和纯化结果。采用盐变法提取了我国15群15型问号钩体参考标准株及非致病的双曲钩体Patoc Ⅰ株的外膜蛋白。以相应兔抗血清为一抗，采用Western Blot检测上述4种外膜蛋白自然表达情况及其免疫反应性。建立了基于rLipL21、rLipL32s、rLipL41s、rOmpL1s的ELJSAs，检测钩体病人血清中相应特异性抗体水平及其类型。采用胶体金免疫电镜技术，对上述蛋白进行膜定位。研究发现rLipL21、rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLipL41/2、rOmpL1/1和rOmpL1/2表达量分别约占细菌总蛋白的10％、40％和35％、15％和10％、30％和15％，各重组蛋白SDS-PAGE提纯后均仅见单一的蛋白条带。重组蛋白兔抗血清在同一基因不同基因型表达产物之间有广泛的交叉免疫反应性。各血清群钩体外膜中均可检出上述四种外膜蛋白，但LipL21仅存在于问号钩体中。LipL21、LdpL32、LipL41、OmpL1均为钩体属特异性表面抗原，可作为通用性钩体疫苗及检测试剂盒的候选抗原。不同稀释度的156例钩体病人血清标本中，rLApL21特异性IgM阳性率分别为69.9％(109/156，血清标本1：50稀释)和63.5％(99/156，血清标本1：100稀释)，特异性IgG阳性率为均为99.4％(155/156)。rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLipL41/2、rOmpL1/1和rOmpL1/2特异性IgM阳性率分别为91.3％～92.9％、90.4％～92.2％、84.6％～87.8％、78.2％～83.3％、67.9％～79.5％和75.0％～75.6％；特异性IgG阳性率分别为99.4％～99.4％、97.4％～98.1％、69.2％～81.4、75.0％～80.1％、71.8％～79.5、75.0％～76.

关键词： 基因工程抗体   嵌合抗体   CDR移植抗体  

摘要： 临床治疗中人抗鼠抗体反应的出现使鼠源性单克隆抗体的应用受到了极大的限制。为降低其免疫原性,人们利用基因工程技术对鼠源抗体进行改造,以减少其鼠源成分。简要概述了目前研究比较多的几种基因工程抗体及其临床应用。

关键词： 单克隆抗体   基因工程抗体   分子进化   噬菌体展示技术   核糖体展示技术   区室化方法  

摘要： 单克隆抗体（monoclonal antibodies,Mab）是指只针对一个抗原表位的结构与各种特性完全相同的高纯度抗体。Mab的制备方法经历了从杂交瘤抗体到转基因动物抗体到基因工程抗体的过程。首先是基于杂交瘤抗体具有鼠源性，应用到人体会产生人抗鼠抗体反应（human anti-mouse antibody，HAMA），而产生了转基因动物Mab。

关键词： 噬菌体抗体库   单链抗体   食管癌   基因工程抗体  

摘要： 目的构建全人源化食管癌噬菌体单链抗体库,从中筛选Eca-109细胞特异性单链抗体。方法取食管癌病人癌肿周围淋巴结作为B细胞的来源,提取总RNA,用RT-PCR的方法获得抗体可变区基因cDNA文库。首先分别网格筛选确定扩增VH和VL基因片段的引物对,以cDNA为模板扩增VH和VL基因片段,再以它们为模板分别扩增VH-linker与VL-linker,用SOE-PCR技术将后者组装成scFv,再引入酶切位点SfiI和NotI。将scFv基因克隆入噬菌粒载体pCANTAB-5E后电转入EcoliTG1,经抗体表达的辅助噬菌体M13KO7超感染,构建单链抗体库。PCR鉴定阳性重组菌EcoliTG1中scFv的插入率,1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定SfiI和NotI双酶切质粒的结果。从该抗体库中筛选特异性识别Eca109细胞的单链抗体,将阳性克隆菌转化EcoliHB2151进行可溶性表达。抗体亲和层析纯化后经SDS-PAGE、West-ern blot鉴定,通过ELISA法、免疫组化法、免疫细胞化学鉴定其与人食管癌细胞的结合的特异性。结果食管癌周围淋巴结总RNA的提取琼脂糖电泳结果中可见清晰的28S、18S条带;VH基因的大小约为450bp,VL基因为350bp,组装后的scFv基因约为850bp。用pUC18标准质粒测定转化效率达到108cfu.μg-1。scFv的阳性插入率为91.7%(22/24)。在筛选过程中,食管癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第4轮为第1轮的141倍;SDS-PAGE与Western blot结果显示抗体分子量为30ku左右,在Ecoli HB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。免疫组织化学结果提示可溶性抗体仅食管癌组织着色,而肝癌、胃癌组织不染色。免疫细胞化学结果表明此可溶性抗体可使食管癌细胞Eca109染色。细胞ELISA测定结果显示可溶性抗体具有较高的特异性,能与Eca109细胞结合,而不与胃癌BGC-823和NHEEC结合。结论从食管癌病人癌肿周围淋巴结成功地构建人源食管癌噬菌体单链抗体库,并从中筛选到食管癌特异性抗体。

关键词： 农作物   育种   基因工程  

摘要： 以文献调研结果为依据,概述了基因工程的基本概念与基本模式,外源DNA导入的方式与表达的条件;应用基因工程培育优质、高产、抗病、抗虫、抗除草剂与抗逆性强农作物品种的进展;预测并展望了基因工程在实现农业现代化目标中的作用、开发应用重点与前景。