关键词： 猪肺炎支原体   猪圆环病毒2型   腺病毒   基因工程疫苗   联合疫苗  

摘要： 猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是引起猪支原体肺炎(Mycoplasma pneumonia of swine,MPS)的主要病原体。猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)的主要病原。Mhp和PCV2不仅会引起猪的原发性感染,更重要的是对感染猪的免疫系统造成伤害,致使Mhp、PCV2经常会与其他病原并发或继发感染,从而使预防和控制猪呼吸道传染病的难度增加。我国防控Mhp和PCV2感染的主要手段是进行疫苗接种。为了减少疫苗接种次数,降低因疫苗接种引起的应激等因素对养猪业生产的影响,接种联合疫苗已经成为动物疫苗行业发展的趋势。目前,可同时预防Mhp和PCV2两种病原体的二联疫苗已有产品获批上市,但大多是以全菌体灭活的Mhp和杆状病毒表达的PCV2 Cap蛋白以一定的比例混合后制备而成,关于Mhp和PCV2基因工程亚单位和活载体二联疫苗产品仍未见上市。目前,人腺病毒载体系统因其具有安全性好、滴度高以及诱导体液、黏膜和细胞免疫反应强烈等优点,已广泛应用于新型疫苗的研发中。基于此,本研究将实验室前期经原核及杆状病毒表达系统证实具有免疫原性的Mhp P97R1、P46、P42蛋白与PCV2 Cap蛋白克隆到复制缺陷型人5型腺病毒载体上,并将包装出的重组腺病毒r Adv-P97R1、r Adv-P46、r Adv-P42、r Adv-Cap按比例混合后作为活载体疫苗混合免疫BALB/c小鼠,以探讨其诱导机体产生免疫应答的效应,为研制基于腺病毒载体的Mhp和PCV2二联疫苗奠定基础。首先,为了便于后续实验的检测,通过原核表达系统表达了重组PCV2 Cap蛋白,免疫新西兰大白兔制备了抗Cap蛋白的兔多克隆抗体。其次,本研究构建了携带有Mhp P97R1、P46、P42基因和PCV2 Cap基因及携带有绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的重组腺病毒骨架载体Adv-P97R1、Adv-P46、Adv-P42、Adv-Cap和Adv-EGFP,分别转染HEK293细胞后进行绿色荧光蛋白表达的观察,进一步对重组腺病毒感染后的HEK293细胞进行RT-PCR、Western Blot等实验的鉴定,证实了P97R1、P46、P42和Cap蛋白的表达。在此基础上,对获得的重组腺病毒r Adv-P97R1、r Adv-P46、r Adv-P42、r Adv-Cap,对其进行扩增及纯化。分别将稀释至1.67×10 TCID的r Adv-P97R1、r Adv-P46、r Adv-P42与5×10TCID的r Adv-Cap等体积混合后经皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,间接ELISA和脾淋巴细胞增殖实验表明,与PBS组、野生型腺病毒r Adv-wild组以及商业疫苗组相比,重组腺病毒组免疫后能诱导机体产生特异性的Ig G抗体(p<0.0001)。同时,与对照组相比,抗P46与抗P42的Ig G1总体呈下降趋势,抗P97R1与抗Cap的Ig G1则呈稳定不变趋势。混合注射r Adv-Mhp和r Adv-PCV2的抗P97R1的Ig G2a呈上升后下降并维持平稳值直至免疫周期结束;其余实验组的抗P97R1和抗P46的Ig G2a维持基本不变的水平直至免疫周期结束;抗P42的Ig G2a第21 d和第35 d时出现短暂的下降,但后期呈现上升趋势。脾淋巴细胞在被相应刺激原刺激后能产生显著的增殖效果(p<0.0001)。由以上结果可知,此重组腺病毒免疫小鼠后能够引发小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫效应。本研究为最终研制基于腺病毒载体的Mhp和PCV2二联基因工程疫苗产品奠定基础。

关键词： 肺炎链球菌   肺炎链球菌溶血素   全人源基因工程抗体   中和作用  

摘要： 肺炎链球菌能引起中耳炎、肺炎、脑膜炎、心内膜炎和败血症。据WHO统计全球每年约100万婴幼儿死于肺炎链球菌感染,其中我国约占3万。近年肺炎链球菌耐药性日益严重,且引起肺炎的病原体复杂多样难以快速鉴别诊断,从而导致用药不当或用药延迟,诸多因素导致肺炎链球菌感染成为婴幼儿死亡的重要原因。肺炎链球菌溶血素(Pneumolysin O,PLY)在肺炎链球菌的致病过程中发挥了重要作用:它能破坏气管上皮和血脑屏障的完整性,细菌得以进入血液、入侵大脑;激活NLRP3炎症小体,刺激多种细胞分泌炎性细胞因子,引发细胞因子风暴。在7价、10价、13价PCVs的基础上研制的新型蛋白结合疫苗含有PLY类毒素,动物实验、1期和2期临床试验结果表明新型疫苗具有良好的免疫原性和安全性。由于含PLY类毒素的蛋白质结合疫苗应用于临床还将有很长一段时间,研发全人源抗PLY中和性抗体辅助治疗肺炎链球菌重症感染者对于降低病死率、保护年轻家庭具有重大现实意义。我们前期获得的抗SLY全人源单克隆抗体可以有效阻断r PLY的溶血活性,本研究利用该抗体的可变区序列构建基因工程抗体,通过细胞试验和动物试验验证其对r PLY的中和作用。主要研究方法和结果如下:***及其不同结构域蛋白的原核表达将肺炎链球菌D39株的ply基因及编码PLY D1-3和PLY D4的基因片段克隆到p ET28a质粒的Xho I-Bam H I位点之间,成功构建了重组质粒p ET28a-ply、p ET28a-ply d1-3和p ET28a-ply d4。将重组质粒导入*** BL21(DE3)中,重组菌在16℃经1 m M IPTG诱导18 h,菌体经超声破碎后检测发现r PLY、r PLY D1-3、r PLY D4三种重组蛋白均可溶性表达。表达产物经Ni-NTA亲和柱纯化,SDS-PAGE及溶血试验,结果显示各重组蛋白的分子量与理论值相符,纯度在90%以上;r PLY具有溶血活性。2.抗PLY全人源基因工程抗体的研制通过蛋白免疫印迹实验、酶联免疫吸附法和溶血阻断实验发现本实验室前期获得的三株抗SLY全人源单克隆抗体1-10F、2-2G、4-2G对r PLY有较高亲和力,也能阻断其溶血作用。克隆这三株杂交瘤细胞的抗体轻链和重链可变区基因到改造后的p CDNA3.4载体中,得到重组质粒p CDNA3.4-1-10F-V、p CDNA3.4-1-10F-V、p CDNA3.4-2-2G-V、p CDNA3.4-2-2G-V、p CDNA3.4-4-2G-V和p CDNA3.4-4-2G-V。分别将3株抗体轻链和重链的表达载体共转染HEK293F细胞,7天后收集细胞培养液,利用Protein A亲和层析柱纯化得到基因工程抗体1-10F、2-2G和4-2G,经SDS-PAGE检测抗体分子量与理论值相符,纯度在98%以上。用ELISA法检测1-10F、2-2G和4-2G对r PLY的EC值分别为:41.61μM,15.52μM,48.40μM;K值分别是:1.99×10,3.99×10,9.31×10。2-2G的亲和力最高,1-10F和4-2G次之。蛋白免疫印迹显示这三株抗体识别的抗原表位存在于r PLY第1-3结构域,它们不结合第四结构域。3.基因工程抗体的体内、体外中和作用分别用红细胞和HEK293细胞测定三株全人源基因工程抗体的体外中和作用,结果表明500μg/m L 1-10F对2.7 n M r PLY(相当于1个溶血单位)溶血作用的阻断率达到了95%以上,对10.8 n M r PLY的阻断率达到了80%以上。其它两株抗体阻断效果稍差,250μg/m L 2-2G对2.7 n M r PLY的阻断率仅为45%,对10.8n M r PLY的阻断率为20%,且抗体剂量提高后阻断率并无明显提高。抗体4-2G的阻断效果界于两者之间,在500μg/m L浓度下对2.7 n M r PLY的阻断率达到了75%以上,对10.8 n M r PLY也可达到60%。对于HEK293细胞,750μg/m L1-10F可阻断1090 n M r PLY(相当于2 IC)70%的细胞毒性作用,其他2种抗体无明显阻断效果。体内中和作用采用预防性被动免疫试验评估抗体对r PLY导致的炎症反应和组织损伤的保护作用。给5周龄BALB/c小鼠皮下注射160μg基因工程抗体1-10F,对照组注射生理盐水,24 h后腹腔注射45μg r PLY,在攻毒后的1、3、5 h取血测定各组血清中IL-1β、TNF-α、IFN-γ和IL-8浓度,在最后一个时间点取各组小鼠的心脏、肺脏、肝脏、脾脏,经多聚甲醛固定后进行免疫组化和病理分析。结果显示:攻毒后对照组小鼠血清中IL-1β、TNF-α、IFN-γ和IL-8水平随时间延长逐渐

关键词： 鸡   传染性喉气管炎   基因工程疫苗   火鸡疱疹病毒   细菌人工染色体   基因重组  

摘要： 传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis，ILT)是由传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus，ILTV)引起的一种鸡的急性呼吸道疾病，给养禽业造成巨大的经济损失。由于目前生产上常用的ILT弱毒疫苗不仅仍然存留部分毒力，而且在易感鸡群中传播会造成毒力返强，因此，迫切需要研发更加安全、有效的ILT疫苗。火鸡疱疹病毒(Herpesvirus ofturkey,HVT)与马立克氏病毒(Marek''s Disease Virus，MDV)在抗原性上具有相关性，HVT FC126毒株是预防鸡马立克氏病(Marek''s Disease，MD)的常用疫苗毒株。HVT的基因组较大，含有多个复制非必需区，可作为基因工程疫苗的病毒载体。本研究将以HVT FC126疫苗毒株为载体，构建表达ILTV主要保护性抗原的重组病毒，用于研发ILT新型基因工程疫苗。　　本研究首先构建HVT FC126毒株的细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome，BAC)。以pBeloBAC11质粒为载体，利用绿色荧光蛋白基因作为筛选基因，构建了两端含有HVT FC126毒株US2区同源臂的转移载体pBAC-EGFP。将pBAC-EGFP与HVT基因组共转染次代鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast，CEF)，通过观察绿色荧光成功筛选到重组病毒rHVT-BAC。提取rHVT-BAC感染细胞的总DNA，电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，经氯霉素抗性筛选获得阳性转化子;采用PCR和酶切方法进一步鉴定，将含有HVT基因组的BAC质粒阳性克隆命名为pHVT-BAC。以pHVT-BAC转染次代CEF，成功拯救出具有感染性的重组病毒rHVT-BAC。　　以感染性HVT FC126毒株的细菌人工染色体(rHVT-BAC)为载体，通过Red/ET同源重组技术构建了分别表达ILTV gB、gD、gI、UL32基因的重组病毒，分别命名为rHVT-BAC-gB、rHVT-BAC-gD、rHVT-BAC-gI、rHVT-BAC-UL32。首先通过PCR扩增获得两端带有50bp同源臂的含卡那抗性筛选基因和IUV保护性抗原基因的打靶片段，然后将打靶片段分别电转化至含pHVT-BAC和pKD46的DH10B感受态细胞，在Red/ET同源重组酶作用下，打靶片段基因成功替换EGFP基因。通过FRT/FLP系统敲除卡那霉素筛选基因。将含gB、gD、gI、UL32基因的重组BAC DNA分别转染CEF，成功拯救出重组病毒rHVT-BAC-gB、rHVT-BAC-gD、rHVT-BAC-gI、rHVT-BAC-UL32。间接免疫荧光试验(IFA)表明，gB、gD、gI、UL32蛋白均成功表达。　　综上所述，本研究以HVT FC126疫苗毒株的细菌人工染色体为载体，利用Red/ET同源重组系统分别构建了表达ILTV gB、gD、gI、UL32基因的重组病毒，为ILT新型基因工程疫苗的研发奠定了基础。

关键词： 尼帕病毒   DNA疫苗   非复制型痘苗病毒载体疫苗   亚单位疫苗   体液免疫   细胞免疫  

摘要： 背景尼帕病毒(Ni V)是一种人畜共患病毒,通过对尼帕病毒基因组的分析,尼帕病毒属于单股负链RNA病毒目、副粘病毒科。与副粘病毒科中的其他成员相比,Ni V基因组与亨德拉病毒(He V)基因组同源性很高,因此二者被划为亨尼帕病毒属(Genus Henipavirus)。近年来又新发现了三种亨尼帕病毒,分别是雪松病毒(Ced V),加纳病毒(GHV)和墨江病毒(Moj V)。1998-1999年,全球首次暴发尼帕病毒疫情,当次疫情造成马来西亚当地百万头猪被扑杀,百余人感染死亡,病死率达48%。自被发现以来,尼帕病毒和亨德拉病毒多次在亚太地区局部暴发。该病毒于2018年被“世界卫生组织(WHO)研发蓝图”列为“可致严重国际暴发”的重点疾病之一,在生物安全等级上属于最危险的第四级。疫苗是预防病毒导致的传染性疾病的有力手段,目前已经有多种尼帕病毒的疫苗处于研究阶段,包括重组蛋白疫苗、水疱性口炎病毒载体疫苗、麻疹病毒载体疫苗、痘病毒载体疫苗等,但没有人用疫苗被批准上市。研究目的本研究构建表达尼帕病毒融合蛋白(F)和附着蛋白(G)的非复制型痘苗载体疫苗、亚单位疫苗,在BALB/c小鼠模型上采用不同免疫策略评价其诱导的特异性体液免疫和细胞免疫应答,为发展我国尼帕病毒基因工程疫苗的研发和应用提供科学参考和技术支持。研究方法与结果一、尼帕病毒非复制型痘苗病毒载体疫苗与亚单位疫苗的构建与表达鉴定含有靶抗原的质粒pc DNA3.1-F、pc DNA3.1-G,其表达尼帕病毒马来西亚株的融合蛋白(F)和附着蛋白(G),且序列经哺乳动物密码子偏好进行优化。通过设计引物将靶抗原通过PCR扩增以获得目的基因片段,将目的基因片段插入重组专用质粒p JSC1175-Lacz上,在鸡胚成纤维细胞中与NTV进行同源重组,通过蓝白斑筛选纯化重组的非复制型痘苗病毒疫苗(NTV-F、NTVG),通过免疫印迹法验证其成功表达F蛋白和G蛋白。为了获得可溶性的Ni V F蛋和G蛋白,我们首先删除F蛋白和G蛋白的膜锚定区域,以使其有效的分泌到细胞外。保留Ni V F蛋白1-488氨基酸序列,并且为了让其稳定在融合前构象,我们进行了氨基酸位点的突变,为了增加其免疫原性,在第488aa残基后加三聚域(TD)以形成三聚体,Ni V G蛋白为II型跨膜蛋白,其N端位于膜内,所以保留其172-602位氨基酸,均在C端添加6×His标签后插入真核表达质粒,以使用镍柱亲和层析对其进行纯化。通过SDS-PAGE及Western blot鉴定,得到了纯度≥90%的可溶性的F蛋白和G蛋白,即s F、s G,拟作为亚单位疫苗备用。二、DNA疫苗、NTV疫苗免疫诱导特异性免疫应答选取6-8周龄BABL/c小鼠进行免疫,评价疫苗诱导的特异性体液免疫应答。运用ELISA检测小鼠血清中特异性Ig G抗体,构建基于HIV的尼帕假病毒建立可在生物安全二级实验室(BSL-2)开展的Ni V中和抗体检测。结果显示,pc DNA3.1-F、pc DNA3.1-G、NTV-F、NTV-G在进行同源和异源疫苗免疫以及两种抗原联合免疫方案时均诱导了较高滴度的特异性Ig G抗体,其中DNA-NTV免疫方案诱导的Ig G抗体最高,并且各免疫组诱导的抗体能够中和HIV-Ni V假病毒,其中pc DNA3.1-G+NTV-G免疫组诱导产生了最高的中和抗体滴度,F+G抗原的联合免疫诱导的中和抗体滴度比单抗原免疫组要高。于此同时,我们对疫苗诱导产生的特异性细胞免疫反应进行了评估。在加强免疫后两周,处死小鼠分离脾细胞,运用ELISPOT实验检测其IFN-γ分泌情况。结果表明:疫苗在小鼠体内诱导了较强的CD8+T细胞免疫应答,其中DNA-NTV免疫组诱导的T细胞免疫应答较其他组强,具有显著性差异。三、筛选Ni V-F、Ni V-G特异性H-2d限制的T细胞表位设计并合成覆盖Ni V-G全长的119条多肽,Ni V-F全长的108条多肽(前后肽重叠10个氨基酸,以5个氨基酸向前步进,每条肽段包含15个氨基酸序列),取各免疫组加强免疫的小鼠的脾细胞,以矩阵设计的Ni V-G、Ni V-F肽池为刺激物,运用ELISpot检测G蛋白和F蛋白特异的优势肽,通过矩阵分析确定刺激活性强的CTL表位肽,F蛋白筛选到了12条优势肽,其中刺激活性最强的是F56(IIVRVYFPILTEIQQ),G筛选到了12条优势肽,其中刺激活性最强的是G72(IKQGDTLYFPAVGFL)、G73(TLYFPAVGFLVRTEF)。四、重组亚单位疫苗的免疫原性研究选取6-8周龄BABL/c小鼠进行免疫,评价重组蛋白s F、s G配合不同佐剂诱导的免疫应答。运用ELISA检测小鼠血清中的特异性Ig G抗体,进行微量中和实验检测免疫后诱导的中和抗体水平,利用ELISPOT实

关键词： 幽门螺旋杆菌   脲酶   纳米抗体   基因工程  

摘要： 幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染可导致严重的健康问题。截止2022年,幽门螺杆菌已经在全世界44亿人的胃部定植。目前针对Hp的治疗主要以抗生素为主,但随着抗生素的滥用,导致Hp耐药性增加,治疗失败可能会逐渐导致原发感染发展为更严重的并发症。脲酶是Hp在胃中定植和致病的关键因素,抑制脲酶的活性对降低Hp感染风险是至关重要的。本研究构建了特异性针对Hp脲酶亚单位(UreB)的重组纳米抗体Ab的基因工程表达系统,并对其在食品级益生菌中的表达进行了探索,主要研究内容如下:(1)Hp脲酶的制备及活性测定:对Hp扩增培养后,提取菌体内得脲酶,通过透析除盐和浓缩后,经Quick Start Bradford方法测定,脲酶含量为0.73 mg/m L。依次利用酚红指示剂法和靛酚法对提取的脲酶分别进行定性与定量的活性测定,结果显示所制备的脲酶具有很高的活性,其酶活力为27.77 U/mg。(2)抗Hp UreB纳米抗体(UreB-Ab)的结构分析:I-TASSER软件分析显示UreB-Ab与PDB数据库中的6EHW结构模型的匹配评分最高,从而得到评分最高的结构模型,再利用Cluss Pro2软件进行UreB-Ab对接预测,应用Pmyol软件进行分子间作用力分析。结果显示为UreB与抗体Ab分子间有较强的相互作用力(氢键)。(3)UreB-Ab在大肠杆菌中的异源表达及活性检测:分别构建了p ET-28a(+)-Ab、p E-SUMO-Ab、p Mal-c2x-Ab等重组载体,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达后分别获得Ab、SUMO-Ab、MBP-Ab等抗体蛋白。单向免疫扩散实验结果显示脲酶与Ab在孔周围可形成白色沉淀环,活性测定结果显示Ab、SUMO-Ab、MBPAb对脲酶的抑制率依次为48.0%、74.0%、12.5%,表明重组抗体具有很好的对Hp UreB抗原的亲和力及抑制活性。(4)UreB-Ab在益生菌中的异源表达及活性检测:分别构建了PTM151-Ab、PNZ8148-Ab、PNZ8148-Usp45-Ab等重组载体,依次在益生菌株大肠杆菌Nissle1917(Ec N)、乳酸乳球菌NZ9000中获得了表达。单向免疫扩散实验证实所获抗体均能与UreB抗原有效结合,活性测定结果显示Ec N表达的Ab对脲酶抑制率为67.4%,而乳酸乳球菌表达的Ab对脲酶抑制率为85.7%,均可作为幽门螺杆菌抗体药物潜在的口服益生菌递送系统。研究结论:本研究应用基因工程方法,得到了特异性针对Hp脲酶亚单位B(UreB)的重组纳米抗体(UreB-Ab)益生菌表达系统,将有望以活菌形式递送进入体内,实现对Hp的直接精准防控。此外,特异性识别Hp抗原的抗体不仅能应对感染,还能克服细菌耐药性的发展。因此,本研究为Hp的免疫药物疗法开发奠定了良好的基础,具有良好的创新性与应用潜力。

关键词： 连翘   组织培养   遗传转化   转化效率   基因工程育种  

摘要： 连翘(Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl)为木犀科(Oleaceae)连翘属(Forsythia)落叶灌木,早春开花,开花数量多且花色金黄艳丽,具有较强的适应性和抗病虫害能力。连翘不仅是我国大宗、常用中药材,而且有着良好的生态价值、观赏价值,是北方地区优良的早春观花灌木。基因工程育种是一种有效的育种手段,由于缺少转基因体系阻碍了连翘的基因工程育种,导致目前缺少栽培品种。现代分子生物技术,尤其是植物组织培养和基因工程的发展,为连翘基因工程育种和新品种的改良提供了技术支持。本试验选取连翘茎段为外植体进行组培再生体系的探讨,以无菌苗叶片、下胚轴和子叶为外植体进行遗传转化受体系统的探索,确定了连翘外植体对卡那霉素和潮霉素的耐受力,使用根癌农杆菌介导法将携带β-葡萄糖苷酸酶(GUS)和潮霉素磷酸转移酶(Hpt)选择标记基因的p CAMBIA1301载体转化到连翘外植体中,对其转化条件进行优化,试验结果如下:1、以连翘茎段为外植体,75%酒精消毒30 s,0.1%(m/v)升汞消毒8 min,连翘茎段污染率较低为23.33%、褐化情况较轻及成活率最高为66.67%;茎段最适启动培养基为:MS(Murashige and Skoog)+6-BA 1.0 mg·L+NAA 0.3mg·L+Sucrose 30 g·L+Agar 7g·L,腋芽萌发时间为3～5 d,腋芽诱导率为97.00%;最适生根培养基为:1/2 MS+IBA 0.2mg·L+NAA 0.2 mg·L+Sucrose 25 g·L+Agar 7 g·L时,生根率可达到73.54%,生根速度快,根长且粗壮。2、连翘种子最佳消毒处理:75%酒精消毒30 s,再用0.1%的升汞消毒12 min,污染率较低为16.88%,发芽率较高,无菌苗长势良好。WPM(Woody Plant Medium)培养基子叶和下胚轴愈伤组织诱导率高于MS,因此以WPM培养基作为愈伤组织诱导培养基,连翘下胚轴和子叶最适诱导培养基为:WPM+6-BA 1.0 mg·L+NAA 0.5 mg·L+Sucrose 30 g·L+Agar 7 g·L,诱导率分别为89.67%和89.00%,子叶愈伤组织最佳分化培养基为WPM+6-BA 1.0 mg·L+NAA 0.1 mg·L+KT 1.0 mg·L+Sucrose 30 g·L+Agar 7 g·L,诱导率为35.56%,下胚轴愈伤组织不定芽诱导培养基为WPM+6-BA 2.0 mg·L+KT 0.3 mg·L+Sucrose 30 g·L+Agar 7 g·L。3、连翘外植体对卡那霉素不敏感,而对潮霉素敏感,依据外植体愈伤组织诱导状况得知,下胚轴潮霉素致死浓度为20 mg·L,子叶潮霉素致死浓度为15 mg·L;抑菌剂羧苄青霉素浓度为400 mg·L,可以有效抑制农杆菌的生长,同时对外植体抑制作用较小。4、下胚轴在菌液浓度OD=0.8,真空辅助侵染3 min后,再常规侵染浸泡至20 min,共培养4 d,是最优转化条件,GUS表达率最高为52.72%;子叶在菌液浓度OD=0.8,真空辅助侵染1 min,再常规浸泡至20 min,共培养3 d,是最优转化条件,GUS表达率较高为33.31%;较长时间的共培养使农杆菌大量繁殖,外植体死亡。本实验以连翘无菌苗为材料,建立了连翘再生体系和遗传转化受体系统,探讨了菌液浓度、侵染时间和共培养天数等因素对遗传转化的影响,筛选了转化的最优条件,为利用基因工程技术对连翘基因工程育种和优良性状改良奠定了基础。

关键词： 子宫内膜异位症   α1-抗胰蛋白酶   基因工程抗体   抗原结合片段   Fab噬菌体抗体库  

摘要： 子宫内膜异位症是一种以异位子宫内膜组织出现为特征的育龄期妇女常见疾病。目前临床诊断的金标准主要依赖于腹腔镜检查，因其具有高侵入性，使得大众接受度低。CA125作为目前临床最常用的生化指标，只在重度子宫内膜异位症患者体内有明显升高，且其敏感性和特异性均较低。所以，目前的医疗技术并不能解决诊断子宫内膜异位症低侵袭性和准确性的问题。α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，A1AT）主要存在于动物血清中，是由肝细胞合成的一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，能对抗多种以丝氨酸为活性中心的蛋白酶。有研究证明，A1AT及其亚型的半定量分析可用来早期筛查子宫内膜异位症。　　在基因工程重组抗体中，抗原结合片段（Fragmentantigen-binding，Fab）不仅具有优异的组织穿透力和稳定结构，且免疫原性低、亲和力高;在与噬菌体展示技术相结合后，筛选效率提高，筛选对象精准，更利于筛选到针对细微差距抗原的抗体，这些抗原由甲基化、磷酸化和糖基化等化学修饰产生。　　本研究在HEK293FT悬浮系统中高效分泌表达了A1AT蛋白，利用纯化的蛋白免疫小鼠，通过噬菌体展示技术构建了A1AT的Fab噬菌体抗体库，在三轮淘选之后，以酶联免疫吸附试验（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays，ELISA）筛选出针对A1AT及其亚型的Fab抗体。　　以下为本研究的主要结果：　　1、以肝细胞cDNA为模板，构建了分泌型A1AT真核表达重组质粒，通过瞬时转染HEK293FT悬浮细胞大规模表达A1AT蛋白，利用亲和层析获得高纯度的重组A1AT蛋白。用PNGaseF酶切重组A1AT蛋白，得到A1AT亚型蛋白。　　2、用纯化的A1AT蛋白免疫小鼠，从第三周开始取血检测血清中效价，确定小鼠体内抗体效价的产生趋势，结果表明小鼠在免疫后可以产生抗体，且效价在第9周可达到峰值，效果最好，A1AT抗体效价最高可以达到1:64000，且维持6周。　　3、取最优效价的小鼠脾脏，提取脾细胞总RNA，经逆转录后的cDNA纯度较高，以此cDNA为模板经三轮重叠延伸扩增出Fab片段。将Fab目的片段和pComb3Xλ载体酶切后连接，电击转化于XL1-Blue感受态中，最终得到A1AT-Fab抗体库，库容达到1.15×107，挑取24个克隆进行PCR验证，表明重组率达到100%。　　4、对A1AT-Fab抗体库进行3轮淘选，亲和性高的噬菌体得到富集。从中挑取188个单克隆，以A1AT蛋白作为抗原，用ELISA分析验证，得到64个阳性克隆。将A1AT亚型蛋白作为抗原，再次验证这64个阳性克隆，发现有6个克隆对A1AT亚型没有阳性反应。结果表明，筛选到可识别A1AT的阳性克隆64个，其中只能识别糖基化A1AT，而不识别A1AT亚型的阳性克隆6个。以A1AT亚型蛋白为抗原，从抗体库中挑取16个单克隆，经ELISA分析验证后，得到5个阳性克隆，再以A1AT蛋白作为抗原验证这5个阳性克隆，筛选得到2个并未产生阳性反应的克隆，则表明这两个为只识别A1AT亚型，而不识别糖基化A1AT的阳性克隆。

关键词： 伪狂犬病毒   基因工程抗体   毕赤酵母表达   酵母编辑   中和活性  

摘要： 伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的一种烈性传染病,猪被认为是PRV的主要宿主和传染源,在自然条件下犬、貂、狼、猫、牛、羊、兔等许多动物对该病毒也容易感染。自2011年以来,在我国山东、河北、辽宁和北京等地陆续有关犬、水貂等毛皮动物感染PRV的报道。毛皮动物感染PRV的主要特征为瘙痒、发热、呼吸系统和神经系统障碍。目前,尚无专门针对毛皮动物PRV的疫苗,也无治疗药物。毕赤酵母是一种甲基营养酵母,其优点之一是与哺乳动物系统如CHO细胞系具有高度的相似性。这种酵母系统不仅价格低廉,而且具有相对快速的表达时间、协同翻译和翻译后处理。通过使用工业生物反应器,可以从小的培养量中大规模地生产感兴趣的蛋白质。在实验室制备的具有中和活性的鼠源单克隆抗体基础之上,进行单链抗体sc Fv-Fc在缺失YPS1基因的GS115-ΔYPS1毕赤酵母表达。为了构建融合表达的单链抗体sc Fv-Fc,首先对抗伪狂犬病毒单克隆抗体轻、重链可变区进行测序,然后与狐源Ig G天然抗体的Fc片段进行基因融合。将编码sc Fv-Fc抗体的融合基因克隆到p PIC9质粒整合到酵母基因组中,通过间接免疫荧光法筛选到了有活性的阳性整合菌株,sc Fv-Fc在毕赤酵母中的表达量达到39.2 mg/L。实验结果显示YPS1蛋白敲除后对外源表达蛋白的降解现象具有一定的改善,提高了外源蛋白的表达量的同时不影响菌体生长及正常的外源蛋白诱导表达;间接免疫荧光实验表明在毕赤酵母中产生的sc Fv-Fc抗体是具有与PRV结合的生物学特性,病毒中和试验表明重组单链抗体具有活性,中和效价为1:10。从实验结果来看此抗体具有诊断和治疗伪狂犬病毒病价值及潜力,同时也表明毕赤酵母在生产蛋白药物领域具有巨大的研发潜力。

关键词： 鸭甲型肝炎病毒   鉴定   间接酶联免疫吸附试验   防治   基因工程疫苗   中药  

摘要： 鸭病毒性肝炎(duck viral hepatitis,DVH)是一种具有高度接触性和高致死率的传染病,主要病原为鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis A viral,DHAV)。其特点是肝空泡增多、肝坏死和出血。幼雏鸭感染后的病死率可达95%以上。鸭甲型肝炎病毒可分为DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3共3种血清型,其中DHAV-1最广泛且毒性最强。为准确、高效、特异地鉴定DHAV,建立一系列检测方法。目前较为常用的是间接酶联免疫吸附试验(I-ELISA)。对DHAV-1的防治早期多使用灭活苗和弱毒苗,但是并未达到理想的免疫效果。近年来,很多研究集中于基因工程疫苗及中药的应用,对于防治DHAV-1具有很好的前景。

关键词： 猪流行性腹泻病毒   基因工程疫苗   核酸疫苗  

摘要： 猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是一种急性肠道传染病,给世界各国带来严重的经济损失。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是引起该病的主要病原体,感染该病毒可引起猪体内严重的肠黏膜破坏、肠细胞坏死,进而引起急性水泻。目前PEDV毒株在我国广泛流行,导致仔猪的感染率和死亡率急剧上升,严重影响我国养猪行业的健康发展。高致病性PEDV毒株的暴发引起了各国的高度关注,研究者目前已开发出各种类型的疫苗,极大的控制了病毒的传播速度和死亡率。在众多不同种类的疫苗中,基因工程疫苗以其良好的安全性和较高的免疫保护而备受关注,目前已开发出的基因工程疫苗包括亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗、重组活载体疫苗、转基因植物疫苗和核酸疫苗等。本文主要针对这5种基因工程疫苗的最新研究成果展开综述,为将来的疫苗研究和产业化提供理论指导。