关键词： 奶牛良种补贴   生猪产品   基因工程疫苗   禽流感病毒   流感病毒群   兽药残留   消息树   畜产品质量安全   牛白细胞黏附缺陷症   生猪屠宰   种公牛   改良中心   隐性有害基因   动物疫病   奶牛养殖   牛奶质量  

摘要： "国家肉牛改良中心"启动运行本刊讯农业部副部长张宝文3月1日为西北农林科技大学授牌,标志着依托西北农林科大建设的"国家肉牛改良中心"正式启动运行。据介绍,这个中心将力争建成全国肉牛新种质的创制中心、地方黄牛的肉用改良中心和新技术研发中心以及肉牛繁育饲养新技术的集成示范中心。

关键词： 小麦   基因工程育种   耐盐性   农杆菌介导的生长点转化   SOS信号途径   SOS基因   TaSOS1基因  

摘要： 小麦是世界上分布最广、种植面积最大的粮食作物,种植总面积和总产量均为各种粮食之首。土壤盐渍化严重影响了农作物的产量和农业生产的发展,对植物尤其是农作物进行耐盐、耐旱的改良势在必行。传统的遗传育种难以打破种间隔离的限制,植物的基因工程技术主要包括转基因技术解决了这一问题。SOS信号途径对植物的耐盐性至关重要,本论文采用一种新的小麦基因转化方法-农杆菌介导的小麦生长点转化法,把SOS基因进行串联,首次把拟南芥的SOS基因转入小麦,各种分子实验证据证明SOS基因已经整合进小麦基因组并得到稳定遗传和表达。论文分析了SOS基因在SOS信号途径中的作用方式,SOS信号途径在小麦耐盐中的作用和小麦内源基因TaSOS1在SOS转基因植株中的表达。 1.实验采用农杆菌介导的小麦生长点转化法对五种基因型小麦进行转化。生长点转化法简单,高效,稳定,对实验设备要求低,克服了基因枪等转化方法多拷贝插入,转化效率低等缺点,农杆菌介导的转化多为单拷贝单位点插入,有利于转基因的表达和稳定遗传,在此基础上,进一步简化了试验程序,不需要长时间的组织培养,缩短了实验周期,并大大提高了转化率。 2.用100mg/L的潮霉素和0.2mg/L(0.1%)的Basta分别对SOS基因转化植株进行筛选,筛选两周后和对照植株对比明显,筛选后成活的植株通过PCR,Southern杂交进一步验证,发现小麦生长点的转化频率与受体的基因型相关,转化率从高到低依次是济麦21,烟麦,高肥。基因型与转化率有关主要是因为不同基因型的小麦对农杆菌抗侵染能力不同。 各种分子实验结果证明拟南芥的SOS基因已经整合进小麦基因组中,RT-PCR结果证明外源基因已稳定遗传并表达。 3.对转基因后代进行了遗传和耐盐分析。 1)对T代SOS2-SOS3转化小麦进行了统计分析,结果表明转化植株T代的分离比大约是3:1,基本符合孟德尔遗传规律。 2)分析转基因后代种子萌发率,发现正常条件下转基因后代与对照的种子发芽率相当,盐胁迫下SOS1转基因后代和对照种子差别不大,但SOS2-SOS3和SOS1-SOS2-SOS3转基因后代种子的发芽率要明显高于对照种子的发芽率。 3)分析不同盐浓度处理两周后,SOS转基因小麦和对照植株干鲜重,发现在OmMNaCl下,对照和转基因植株生长状况差别不大,随着盐浓度的增加,对照和转基因植株生长量都有所减少,SOS1转化植株在低浓度下比对照稍好,高浓度下和对照差别不大,而SOS2-SOS3和SOS1-SOS2-SOS3转化植株在盐胁迫下生长状况明显好于对照。转基因株系和对照植株NaCl处理后根中和叶中的Na、K含量测定结果显示,SOS2-SOS3和SOS1-SOS2-SOS3转化植株的Na低于SOS1转化植株和对照植株,K/Na比高于SOS1转化植株和对照植株。 4)盐处理后对植株MDA含量和过氧化氢酶活性进行测定,发现盐处理两周后植株MDA含量都有所上升,但是SOS2-SOS3转基因植株MDA含量得增加少于对照和SOS1转基因植株。200mM NaCl处理24h后,转基因植株和对照植株过氧化氢酶活性变化不明显,处理48h后,SOS2-SOS3转基因植株过氧化氢酶活性明显增强,SOS1转基因植株酶活性也有所增强,但是低于SOS2-SOS3转基因植株。 5)RT-PCR对小麦TaSOS1表达分析的结果表明,与对照植株和SOS1转基因植株相比,SOS2-SOS3转化植株中的TaSOS1表达量增强,推测蛋白复合体SOS2-SOS3可能磷酸化并激活了小麦质膜上的Na/H逆向转运蛋白TaSOS1,从而增强了转基因植株的耐盐性。 以上结果证明了SOS信号途径在单子叶植物小麦耐盐中的起作用,并进一步证明SOS信号途径中,Na/B逆向转运蛋白SOS1的作用依赖于SOS2—SOS3蛋白复合体的调节,RT-PCR分析小麦TaSOS1表达的结果表明SOS2—SOS3蛋白复合体可能调节小麦转运蛋白TaSOS1的活性,参与了小麦其它的耐盐信号途径。

关键词： 禽流感病毒   热休克蛋白70   M2e   NP   融合   ELISA   序列分析   蛋白质疫苗  

摘要： 禽流感(AI),特别是高致病性禽流感(HPAI)已经威胁人类健康和经济发展。应用高效的疫苗并结合广泛开展禽流感的免疫监测是当前、乃至将来很长一段时期控制禽流感的主要措施。禽流感亚型众多,亚型间的交叉免疫反应很弱,而且还可能会出现新亚型流感病毒的流行。流感病毒(AIV)基质蛋白(Matrix 2,M2)、核蛋白(Nucleoprotein,NP)等结构蛋白具有高度保守和交叉免疫保护反应的特性。因此,研究广谱性禽或人流感病毒疫苗和诊断技术成为流感综合防控技术中的新课题。其中,在流感病毒新型疫苗的设计中,关键技术是如何提高抗原刺激机体产生强有力的免疫保护。 热休克蛋白70(Heat Shock Protein 70,HSP70)对机体免疫系统具有重要的调节作用。HSP70可作为分子载体,增强与其结合的蛋白抗原性。因此,在现代疫苗的研究中,HSP70能充当基因工程等新型疫苗的佐剂。在目前,已逐渐撑握和利用细菌源HSP70的免疫调节功能及其机制,但HSP70的生物种属非常多,各个种属间在功能上是否具有特异性,这些仍没有进行系统的研究。哺乳动物源HSP70作为疫苗佐剂的研究较少,分子内部结构与免疫调节功能的关系还不清楚。 鉴于以上提出的问题,本研究工作进行了初步的探讨和研究。主要工作和结果如下: 成功克隆了含结核杆菌、鹌鹑、鸡和鼠源HSP70编码序列。在基因和氨基酸水平对不同种属源HSP70进行同源性和遗传进化分析。结果显示,同一种源HSP70保守性最高。鸡与鹌鹑间、牛源与犬源间、人源与鸡源间HSP70的同源性分别是98.6%、97.8%、92.1%,从而推测禽源间、牛源与犬源间、人源与鸡源间HSP70功能的一致性较强。大肠杆菌与结核杆菌为代表的细菌源HSP70与禽源及哺乳动物源HSP70同源性均低于50%。可以说,细菌源HSP70的免疫增强功能及其发挥机制均与禽源及哺乳动物源HSP70有较大的差异。各种属源HSP70分子内部结构的氨基酸序列差异分布在核酸结合域和C端区较多,而多肽结合域相对比较保守。 运用PCR方法将小鼠HSP70(MsHSP70)基因亚克隆至pET28a(+)和pET32a(+)中,重组质粒转化至大肠杆菌表达宿主菌Rosetta(DE3)中。经IPTG诱导表达的可溶性MsHSP70重组蛋白并通过镍离子亲合柱层析纯化。结果表明,MsHSP70成功通过pET32a(+)在Rosetta(DE3)菌中得到表达,纯化后的可溶性目的蛋白纯度达85%。 通过大肠杆菌表达系统,重组表达获得TRX-NPe·M2e和GST-NPe·M2e融合蛋白。初步建立以TRX-NP·M2e融合蛋白为检测抗原的间接ELISA方法,对阳性血清的检测,表明GST-NPe·M2e蛋白包被的间接ELISA具有一定特异性和敏感性。 以AIV M2e蛋白为模式抗原,初步研究小鼠源HSP70的不同长度分子作为AIV基因工程疫苗佐剂的效应。按同一个阅读框将M2e基因分别融合至HSP70(1-637))、HSP70(383-637))和HSP70(383-537))的C-端。融合基因克隆至pET32a(+)中,三种重组质粒分别转化至大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)plysS或Rosetta(DE3)中。经IPTG诱导表达三种不同长度可溶性重组蛋白,并通过镍离子亲合柱层析纯化。将纯化的三种融合蛋白分别免疫BALB/c小鼠,通过ELISA方法检测实验鼠血清中特异性M2e抗体。结果表明HSP(383-537))、HSP70(383-637))和HSP70(1-637))均能增强机体产生M2e的特异性抗体。其中HSP(383-537))的作用明显比HSP70(383-637)),特别是要比HSP70(1-637))强。因此,在以AIV M2e蛋白疫苗设计中,小鼠HSP(383-537))能替代MHSP70(1-637))和HSP70(383-637))作为分子佐剂(疫苗载体)。但其中的具体机制有待进一步实验证明。

关键词： 单细胞蛋白饲料   马铃薯薯渣   醉鸡   肉牛产业   基因工程疫苗   亲鸽   人工育雏   种鸽   生猪期货   母牛   兽药饲料  

摘要： 微生物发酵技术破解马铃薯薯渣变废为宝难题哈尔滨工业大学近日研发的一项利用微生物液态发酵技术转化马铃薯薯渣,进而生产单细胞蛋白饲料的新技术,很好地解决了将马铃薯薯渣"变废为宝"、改变其污染环境的状况这一难题。目前中国年产马铃薯700万余吨,用于生产淀粉时产生大量含有纤维素、维生素等营养成分的薯渣和汁水,由于没有有效的处理技术只能任其排放,不仅造成巨大的资源浪费,还破坏了生态环境。2004年,在"国家自然科学基金"和"科技部科技支撑计划"等科研项目的支持下,哈尔滨工业大学生物工程研究所杨谦教

关键词： 猪繁殖与呼吸综合征   基因工程疫苗   杆状病毒   ORF5m和ORF6基因  

摘要： 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病。PRRS自1987年首次报道发现于美国以来,现已遍及世界各主要养猪国家与地区,并已成为危害养猪业最严重的传染病之一。同其它病毒性疾病的防制一样,免疫接种仍是预防与控制PRRS的主要措施。目前用于预防PRRS的主要商用疫苗是传统的常规弱毒疫苗和灭活疫苗,但由于存在弱毒疫苗散毒和灭活疫苗免疫效果不理想等原因,使得这两种疫苗的使用都存在着一定的争议。因此,研制更安全、高效、廉价的新型疫苗成为研究者关注的焦点。 ORF5基因编码的囊膜糖蛋白GP5是PRRSV的主要免疫原性蛋白,也是目前研制PRRSV新型疫苗的主要靶蛋白。但单独基于天然ORF5基因构建的一些试验性疫苗普遍存在诱发中和抗体缓慢和不高的问题。最近研究证实将通用型辅助性T淋巴细胞表位(PADRE)插入ORF5基因的中和表位和覆盖表位间,获得修饰后的ORF5基因ORF5m,可以使ORF5基因的中和表位充分暴露,从而诱发更强的免疫反应。另外,GP5蛋白与ORF6基因编码的M蛋白在成熟的病毒粒子和感染的细胞内可以形成异源二聚体GP5/M,并且这种异源二聚体的形成能促进GP5蛋白的翻译后修饰、转运,从而促进免疫动物产生更强的特异性免疫应答。 杆状病毒载体是目前应用十分广泛的载体之一,主要应用于基因治疗、基因功能研究、疫苗开发等领域。近年来研究发现,这种载体可以携带以哺育动物启动子驱动的外源基因表达盒进入哺乳动物细胞,从而在哺乳动物细胞内使外源基因得到高效稳定的表达,而其自身基因组并不复制和表达。同时,经过适当的修饰或预处理,杆状病毒表达载体还可介导外源基因在哺乳动物体内获得表达。 目前利用杆状病毒作为体内基因投送的载体已受到广泛的关注。但研究证实血清补体系统是杆状病毒体内基因转导过程中的主要抑制因素。因此,为了消除杆状病毒的补体敏感性,本研究利用水泡性口炎病毒G蛋白对杆状病毒进行了修饰,构建了囊膜表面展示有水泡性口炎G蛋白的杆状病毒载体。在此基础上将由CMV启动子驱动的PRRSV ORF5m基因和PRRSV ORF6基因两个独立的表达盒以转座的方式重组入杆状病毒基因组中,获得重组杆状病毒BV-G-5m/6。 将重组病毒以3种不同剂量(10～9pfu/只,10～8pfu/只,10～7pfu/只)经肌肉注射免疫Balb/c小鼠,同时与共表达PRRSV ORF5m和ORF6基因的常规DNA疫苗pCI-5m6进行比较。结果重组病毒BV-G-5m/6所诱发的免疫反应呈剂量依赖性,但3种不同剂量的重组病毒所诱导的IFN-γ水平和中和抗体水平均明显高于常规DNA疫苗免疫组,其中10～9pfu重组病毒免疫组所诱导的免疫反应最强,二免后3周平均中和抗体水平达到1:32以上,ELISA检测IFN-γ水平达90pg/ml以上。表明重组杆状病毒BV-G-5m/6是一种具有良好发展前景的猪繁殖与呼吸综合征候选疫苗。

关键词： 胸膜肺炎放线杆菌   apx IC基因   猪肺炎支原体   P36基因   基因工程疫苗   环介导的核酸恒温扩增(LAMP)  

摘要： 由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,MHP)和胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)单独感染或混合感染是引起目前呼吸道综合症的主要原因之一,给养猪业造成严重的危害。猪传染性胸膜肺炎弱毒疫苗是一种新型疫苗,优于传统的灭活疫苗,它可以激发良好的体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫,具有良好的抗体反应和不同血清型菌感染的交叉保护,而且使用方便、成本低,是当前国内外研究的热点。 针对临床中这两种病原同时感染或继发感染的现状,而分别接种单独的疫苗会造成猪只的应激和养殖成本增加,以致弱的胸膜肺炎放线杆菌表达MHP主要抗原蛋白的突变株,并研制有效的基因工程疫苗,是预防这两种呼吸道传染病的策略。 本研究以APP血清10型菌株和猪肺炎支原体为材料,分别克隆APP毒素apxⅠ操纵子的调节基因apx IC以及MHP主要免疫原性蛋白——乳酸脱氢酶(P36)基因,将P36基因插入到apx IC,构建含抗生素标记和负向筛选标记的中间转移载体pEICALDH。将pEICALDH热激法转化大肠杆菌X7213感受态细胞,将转化的阳性子再与胸膜肺炎10型菌进行接合转移试验,通过同源重组,在DAP缺乏的含NAD的TSA培养基上,利用营养缺陷筛选法和SacB负向筛选法,获得P36基因插入apxIC基因的APP突变株,该突变株不含抗生素抗性基因,用突变株培养上清,浓缩后进行western bolt检测,发现浓缩蛋白能与毒素Ⅰ单抗反应。将该毒株划线接种于含绵羊红细胞和NAD的TSA培养基上,观察24-72个小时,未发现溶血现象,说明该突变株丧失了亲本菌株所具有的溶血活性。将10～7CFU/ml的突变株和亲本菌分别接种10只Balb/C小鼠,连续观察14天,亲本菌在接种后24小时内小鼠全部死亡,而突变株接种组小鼠死亡3只,TSB接种组小鼠全部存活,说明突变株对小鼠的毒力下降;用2×10～6CFU/ml重组菌免疫Balb/C小鼠,一个月后用2×10～8CFU/ml亲本菌攻击免疫鼠,保护率为100%,而TSB对照组小鼠全部死亡。这些结果说明,该突变株有望用于疫苗研究。 环介导的基因扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新型的恒温核酸扩增方法,具有特异、高效、快速的特征。利用水浴锅以及基于apxⅣ基因设计的6个特异性引物,LAMP可以在30分钟内快速检测胸膜肺炎放线杆菌。通过加入SYBR GreenⅠ染料,扩增产物可以肉眼观察。LAMP法检测胸膜肺炎放线杆菌的特异性与Nested PCR相当,但敏感性高于Nested PCR,此方法可以成为快速检测胸膜肺炎放线杆菌的重要手段。

关键词： CD19   嵌合抗体   杆状病毒  

摘要： 急性白血病(Acute Leukemia,AL)是儿童期发病率最高的恶性肿瘤。其中B系来源的急性淋巴细胞性白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia,ALL)是儿童白血病最常见的类型。联合化疗的应用虽然明显改善了儿童ALL的预后,但仍有20～30%的病死率。治疗失败的主要原因是白血病细胞耐药和化疗的毒副作用。与化疗比较,靶向治疗具有高度的选择性和特异性,因而可大大提高疗效,降低药物的毒副作用。白血病细胞系列特异性表面分化抗原(Cluster Differentiation,CD)分子的单克隆抗体(Monoclonal Antibody,简称单抗,McAb)可以作为白血病/淋巴瘤靶向治疗的先导分子。 目前大多数高亲和力的单克隆抗体是鼠源性的,天然的鼠源性单抗应用于人体,作为异种蛋白可刺激人体产生人抗鼠抗体(Hhuman Anti-Mouse Antibody,HAMA),既影响单抗的治疗效果,又可能诱发严重的过敏反应,大大限制了单抗在人体的应用;因此有必要对其进行降低免疫原性而保留抗原结合力的改造。抗体的免疫原性主要位于恒定区Fc段,而抗原结合活性位于可变区Fv段。改造方法之一是制备人-鼠嵌合型抗体,用人的Fc段基因替代鼠Fc段基因,保留鼠源性Fv段基因,然后利用现代基因工程技术表达嵌合抗体蛋白。当前临床使用的抗人CD20嵌合型抗体美罗华(Rituximab)便是嵌合型抗体成功应用于临床的典型代表。 美罗华因其对于CD20+的B系非何杰金淋巴瘤(Non Hodgkin’s Lymphoma,NHL)有确切的疗效,已被纳入该类淋巴瘤的一线治疗方案中。但CD20分子在B系分化早期表达较少,限制了它在B祖细胞型白血病和部分淋巴瘤中的应用。CD19是B细胞的另一个特异性的表面标记,它在B系细胞表面的持续稳定表达贯穿了B细胞的整个发育过程。因此,CD19分子可作为理想的先导分子用于治疗B细胞性白血病和淋巴瘤。 目前,国际上正在研究的抗人CD19单抗有多种,大多数研究结果表明,无论它们是非结合型单抗,还是结合型单抗,动物实验和临床治疗前研究均显示出其在靶向治疗B淋巴细胞系恶性肿瘤方面具有较为理想的效果;同时发现,这些不同克隆的抗人CD19抗体与B系肿瘤细胞的反应性不尽相同,对B系肿瘤细胞的选择性杀伤作用也并非完全一致。更重要的是,到目前为止,临床上尚无如美罗华一样在临床上成功应用的CD19单抗制剂,因此,有必要对更多的CD19克隆进行基因改造和功能研究。 本课题拟对本实验室自行研制的、有自主知识产权并经国际鉴定和命名的鼠抗人CD19单抗ZCH-4-2E8(简称2E8)进行改造,基因工程构建杆状病毒表达载体,并在昆虫细胞Sf9中表达,检测其抗体活性,为该抗体免疫毒素的研制和临床应用以及下一步制备人源化抗体打下基础。 杆状病毒表达系统在真核表达系统中应用较为广泛,它具有基因容量大,表达效率高,有表达后修饰,可操作性和生物安全性好的特点。pAc-κ-CH3杆状病毒载体是专为表达抗体而设计的杆状病毒载体,它带有IgGl的重、轻链恒定区(CH、CL),重、轻链的前导序列(Leader)及可变区VH、VL的插入位点,并据报道抗体表达量高达6-18 mg/L。故本研究选择该系统来表达目的蛋白。 材料与方法 1、真核分泌型重组杆状病毒穿梭载体pAc-x-CH3-VH-VL的构建: 1.1 VH、VL基因的克隆与测序:以本研究室前期研究得到的带有2E8重、轻链可变区序列(VH、VL)的pSectag2A/ScFv质粒作为模板,设计引物通过PCR将XhoⅠ和NheⅠ酶切位点引入VH的两端,SacⅠ和HindⅢ酶切位点引入VL的两端;PCR产物电泳后目的条带切胶回收,纯化后将目的基因片段连接入pGEM-T easy vector(TA克隆),转化大肠杆菌DH5α,铺板,挑白色菌落,扩增后抽提质粒酶切鉴定并对其进行测序核实。 1.2真核分泌型pAc-κ-CH3-VH-VL重组杆状病毒穿梭载体的构建:将测序核实过序列正确的TA-VH和pAc-κ-CH3经XhoⅠ和NheⅠ双酶切处理后通过连接、转化、筛选、扩增、抽提质粒、酶切鉴定等步骤后,测序核实序列正确插入,命名为pAc-κ-CH3-VH,再将TA-VL和pAc-κ-CH3-VH经SacⅠ和HindⅢ双酶切处理后通过连接、转化、筛选、扩增、抽提质粒、酶切鉴定等步骤后,测序核实序列正确插入,从而获得真核分泌型重组杆状病毒穿梭载体pAc-κ-CH3-VH-VL。用Qiagen plasmid purification mini kit抽提转染级纯质粒. 2、重组杆状病毒穿梭载体pAc-κ-CH3-VH-VL转染Sf9细胞、扩毒、表达重组抗体: 2.1 Sf9细胞、2E8细胞、Nalm-6细胞、Hi

关键词： 支气管败血波氏杆菌   分离   鉴定   病原流行病学   生物学特性   毒力试验   免疫原性   沙门氏菌   重组疫苗  

摘要： 支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)可引起猪发生肺炎和萎缩性鼻炎(Atrophic rhinitis,AR),也是猪呼吸道疾病综合征(porcine respiratory diseasecomplex,PRDC)的重要致病因子之一。更重要的是,Bb的先期感染易于导致其它多种病原的继发感染,从而增加猪群呼吸道疾病的发病率和严重程度,造成严重经济损失。以AR为代表的猪波氏菌病现已遍布养猪业发达国家,已成为猪的重要呼吸道传染病之一。本研究对Bb的病原流行病学、生物学特性、免疫原性基因、诊断方法和重组沙门氏菌基因工程疫苗进行研究,为我国Bb的流行病学分布提供理论依据,为猪波氏菌病的临床诊断、预防与控制提供新方法。主要研究内容如下: ***的分离鉴定与病原流行病学研究 从全国十五个省市送检的2,057份有肺炎或AR症状猪的肺脏等病料组织中分离出190株Bb和不同数量的共感染菌。2003～2006年间的Bb总分离率为9.2%;不同省份Bb的总分离率介于7.5～14.1%之间;不同年份Bb的总分离率介于7.3～11.8%之间;Bb的分离率与猪日龄有一定关系。Bb最常见的共感染菌依次是链球菌(55.9%)、副猪嗜血杆菌(50.0%)、大肠杆菌(43.1%)、巴氏杆菌(25.5%)和绿脓杆菌(17.6%)。在43份有典型AR症状猪的病料中,分离出22株Bb、7株产毒素巴氏杆菌和6株绿脓杆菌;在分离出产毒素巴氏杆菌的7份病料中均同时分离出Bb,而其中6份又同时分离出绿脓杆菌。研究结果表明,Bb在我国猪群的感染十分普遍,Bb与其它病原菌的共感染情况非常严重,且在AR的发生中具有重要作用。 ***的生长特性及强毒菌株的筛选 Bb在多种培养基中均生长良好,但加血液的鲍-姜氏培养基更易于BbⅠ相菌形态的维持,且在含绵羊血的鲍-姜氏培养基上产生更明显的β-溶血环。小鼠致死性试验结果表明Bb毒力普遍较弱,但少数菌株如1562、3331、HH0809等表现出很强的毒力。以HH0809株为出发菌株分别建立小鼠和仔猪的呼吸道感染模型。采用建立的感染模型测定HH0809株对小鼠的LD(the 50%lethal dose)为1.4×10 CFU,对猪的LD为2.0×10 CFU,详细记录了感染小鼠和感染仔猪的症状和病理变化。Bb生长特性研究以及小鼠和仔猪的呼吸道感染模型的建立为猪波氏菌病快速诊断试剂及高效疫苗的研制、开发奠定基础。 ***保护性抗原基因的筛选 以强毒菌株HH0809的基因组为模板,分段克隆表达Bb重要的保护性抗原丝状血凝素基因fhaB(6,260 bp)和百日咳杆菌粘附素基因prn(2040 bp)。fhaB基因分为5段,从N端到C端分别命名为F5(1,400 bp)、F4(1,200 bp)、F3(1,200 bp)、F2(1,800bp)和F1(660 bp);prn基因分为2段,从N端到C端分别命名为P1(1,190 bp)和P2(850 bp),以及prn基因全段(2,040 bp);将8段DNA片段分别克隆到pGEX-KG表达载体并在大肠杆菌BL21中进行诱导表达,纯化包涵体后使用30μg(与等体积弗氏完全佐剂混合)免疫BALB/c小鼠,于21 d后使用4×LD的Bb强毒株HH0809进行呼吸道的气雾攻毒。结果表明:fhaB基因各片段表达产物GST-F1、GST-F2、GST-F3、GST-F4和GST-F5免疫组小鼠的存活率分别为66.7%(6/9)、0(0/9)、0(0/9)、44.4%(4/9)和11.1%(1/9);prn基因各片段表达产物GST-P1、GST-P2和GST-PRN免疫组小鼠的存活率分别为88.9%(8/9)、100%(9/9)和100%(9/9)。小鼠保护力试验结果证实FHA和PRN均是Bb重要的保护性抗原成分。其中,FHA的C端F1片段(TypeⅠdomain)和PRN的P2段(RegionⅡdomain)分别为两种抗原最重要的免疫保护性抗原区域,有望作为波氏菌病的诊断抗原和新型疫苗的成分。 ***抗体检测ELISA方法的建立与应用 利用已纯化的各段表达蛋白GST-F5、GST-F4、GST-F3、GST-F2、GST-F1、GST-P1、GST-P2和GST-PRN分别进行间接ELISA检测方法研究。结果显示,作为包被抗原,GST-PRN优于其它各段蛋白。进一步通过凝血酶Thrombin酶切GST-PRN并回收,获得纯的不含GST载体蛋白的PRN蛋白片段。以PRN蛋白片段为抗原建立检测PRN抗体的间接ELISA检测方法。结果表明,PRN-ELISA方法特异性良好,该方法对猪巴氏杆菌病等7种常见细菌性疾病阳性血清的检测结果均为阴性;ELISA方法能够检测到人工感

关键词： 副溶血弧菌   多重PCR   单链抗体   基因芯片  

摘要： 副溶血弧菌是一种广泛存在于水环境中的一种导致人类和水生动物发生疾病的一种致病菌。在本研究中,我们建立了一种基于基因芯片和基于基因工程单链抗体的融合蛋白的检测方法,对副溶血弧菌进行检测。 以副溶血弧菌的基因组的特征性基因为出发点,利用副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因(tlh)上的367 bp的片段检测TLH,耐热溶血毒素基因(tdh)上269 bp的片段检测TDH,鞭毛蛋白编码基因(FlaB)上的176 bp的片段检测FLAB,利用Bio-dUTP标记的液相三重PCR产物与特异探针(引物)的杂交,结合碱性磷酸酶检测系统,应用基因芯片技术同步检测副溶血弧菌的三个特有基因。实验中,使用了36份的实际样品对该检测体系作了进一步的验证分析,在检测的18株副溶血弧菌中,检测到有8株是强毒株,10株是弱毒株,这与实际的结果相符合。在检测的18株其他细菌中,均未发现任何的非特异性条带,这与实际的结果也是一致的。 通过PCR扩增副溶血弧菌基因组中的约1.3 kb的tlh抗原基因,利用基因工程技术,构建了pET32a-tlh载体,将抗原基因与硫氧还原蛋白基因进行融合,转化大肠杆菌并进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE凝胶电泳分析表明有一条与预测分子量大小相一致的目的条带,表达量约占菌体蛋白的45%左右,蛋白的可溶性高。融合蛋白末端的Trx标签增加蛋白的可溶性,His6标签有利于蛋白质的纯化。 用纯化后的蛋白免疫Balb/c小鼠,经过加强免疫后测定小鼠的抗血清效价,达到一定的效价后,从小鼠的脾脏中提取总RNA,反转录得到cDNA第一链,通过PCR扩增得到重链可变区V和轻链可变区V基因,组装成scFv并克隆到噬菌体载体pCANTAB-5E中,构建噬菌体抗体库。通过噬菌体展示技术淘选得到一株高亲和力的单链抗体WW6。

关键词： 重组腺病毒   FMDV   疫苗   残留DNA  

摘要： 口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种感染偶蹄类动物的传染性疾病。口蹄疫的暴发对于动物的健康造成严重的威胁,大量动物死亡以及因口蹄疫而引起的贸易壁垒给其他无疫情国家经济带来了沉重的打击。目前还没有消灭口蹄疫的国家,疫苗在疾病控制中起到了主要的作用。虽然灭活病毒疫苗能够有效预防口蹄疫,但其应用还伴随着残留的危险问题,包括病毒灭活不完全、病毒在疫苗生产设备中的逃逸等。为此,基因工程疫苗就成为了克服病毒灭活苗缺点的候选。 口蹄疫是由小RNA病毒科的口蹄疫病毒引起的。病毒颗粒由60个亚单位组成,每个亚单位包含各一分子的VP1,VP2,VP3和VP4,这4个分子组成了病毒壳蛋白P1,P1包含病毒衣壳表面的几乎所有的抗原表位。FMDV的主要中和性抗原表位位于VP1的G-H环,目前研究中发现应用含有该位点的基因工程疫苗,虽然诱导产生较高的抗体水平但是对动物的保护率并不能达到理想的水平。提示其它表位在抗FMDV免疫中同样起到重要作用,如果将P1蛋白作为疫苗抗原将起到更好的免疫效果。同时P1蛋白在形成VP1,VP2,VP3和VP4的过程中需要3C蛋白酶的作用,因此在本研究中,将P1和3C蛋白共同作为疫苗的抗原,同时通过密码子优化的方式以求达到获得高效FMD基因工程疫苗的目的。 研究中人工合成了密码子优化的P12A3C序列,利用over-lapping PCR技术扩增获得P12A3C的全长基因,定向克隆到重组腺病毒AdEasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建了重组穿梭质粒pAdTrack-P12A3C与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化BJ5183菌,利用细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒pAdEasy-P12A3C;转染293细胞以包装、扩增重组腺病毒AdP12A3C,并用同样的方法制备对照空载腺病毒Adeasy。通过PCR、RT-PCR、ELISA鉴定重组腺病毒P12A3C基因的体外转录和表达情况。此外研究中还构建了重组DNA疫苗质粒pcP12A3C。将上述基因工程疫苗免疫BALB/c小鼠,通过ELISA、液相阻断法、中和试验检测疫苗的特异性体液免疫应答反应;通过细胞因子分泌、淋巴细胞增殖试验、CTL活性测定检测疫苗的特异性细胞免疫应答反应。结果发现构建成功的DNA疫苗重组质粒pcP12A3C和重组腺病毒AdP12A3C,体外感染细胞中能有效表达P12A3C基因。用疫苗pcP12A3C和AdP12A3C免疫小鼠后可刺激机体持续产生特异性体液免疫应答和细胞免疫应答,其中,AdP12A3C诱导的中和性抗体水平达到1:32以上,达到有效的中和抗体水平。而DNA疫苗pcP12A3C虽然诱导了中和性抗体的产生但效价较低。DNA疫苗和重组腺病毒疫苗都诱导产生Th1型的细胞免疫反应,免疫小鼠可诱生出病毒特异性的CTL活性,杀伤靶细胞。结论表达P12A3C抗原的重组腺病毒载体疫苗能够诱导机体产生有效的体液免疫应答和细胞免疫应答,具有成为FMD疫苗的发展潜力。 DNA疫苗的研发工作一直是我室的研究重点,并且随着DNA疫苗的发现以及其在预防感染性疾病中的广泛应用已经被誉为医学的巨大成功和发展。DNA疫苗作为生物医药产品应用的质量控制是一个亟待解决的问题。目前,已发现残留工程菌的基因组DNA是一种潜在的危险因素,因此其含量水平必须控制在容许的范围内。研究中我们报告了斑点杂交的方法检测纯化DNA疫苗产品中残留宿主细胞DNA水平。本方法应用了PCR扩增的地高辛标记的大肠杆菌16S rRNA基因为探针。这种斑点杂交方法应用大肠杆菌16S rRNA基因为探针,其灵敏度强于单拷贝的UidR基因探针。优化的斑点杂交法同时具有低背景和灵敏度较高(10 pg残留*** DNA)的特点。本方法适合常规应用检测药学级别DNA疫苗中残留*** DNA水平。