关键词： 乳腺癌   Met   单克隆抗体   免疫组化   Met   基因工程抗体   融合蛋白   Fc片段  

摘要： 乳腺癌是世界范围内女性常见恶性肿瘤之一,严重威胁着广大女性的生命健康。随着对肿瘤发生、发展分子机制的深入研究,Met作为一个重要的肿瘤分子标志物日益受到人们的关注。癌基因编码的膜蛋白Met是肝细胞生长因子(HGF/SF)已知的唯一受体,属于具有酪氨酸激酶活性的生长因子受体类。在正常组织中Met有少量表达,而在多种实体肿瘤中存在不同程度的高表达,Met在乳腺癌中过表达并且和乳腺癌浸润转移及预后有密切联系。 Met表达的准确评价将有利于乳腺癌患者进行分子靶向治疗。目前国内外研究中常用的Met抗体是兔抗人Met多克隆抗体(C28)。由于多克隆抗体难以实行标准化和质量控制且存在非特异性染色问题,本课题组研制出一种新的鼠单克隆抗体Met4,专门用于免疫组化检测福尔马林固定石蜡包埋标本中的Met检测。 目的: 1)用Met4检测临床乳腺癌石蜡包埋切片中Met的表达。 2)比较Met4和C28的检测效能。 方法: 1)收集2001-2006年的女性乳腺浸润性导管癌70例,用Met4作为一抗进行免疫组化检测,分析Met表达与患者年龄、肿瘤大小、转移、组织学分级等乳腺癌临床病理特征的联系。 2)用Met4检测17例患者的转移淋巴结和癌旁组织中Met的表达情况并与对应的原发肿瘤比较。 3)挑选21例Met4检测为中等阳性或强阳性的病例以C28作为一抗评价Met水平,比较Met4和C28的检测效能。 结果: 1、Met4染色的乳腺癌组织中Met阳性表达均位于肿瘤细胞膜或细胞浆, 11例(阳性率16%)浆表达阳性,19例(阳性率27%)。 2、Met的表达与年龄、组织学分级、淋巴转移均无显著相关。但膜染色与肿瘤大小出现正相关趋势。 3、乳腺癌原发肿瘤与转移淋巴结均表达Met,表达类型无明显差异,在癌旁组织仅见Met弱表达或不表达。 4、Met4染色主要位于肿瘤细胞浆或细胞膜,无细胞核染色;C28染色主要位于肿瘤细胞浆,无细胞膜染色,在细胞核有较多非特异性染色。Met4组与C28组检测结果细胞浆染色无显著性差别,细胞核非特异性染色差异性明显。 结论: 1、Met在乳腺癌中过表达。 2、Met4可以作为乳腺癌的免疫组化诊断试剂。 目的将已制备的抗Met单链抗体基因与人IgG Fc基因片段融合,表达有活性的融合蛋白分子,以增强单链抗体的可溶性。 方法从人淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增并制备人IgG的Fc基因片段,并克隆于已构建好的pBAD-scFv原核表达载体中,转化大肠杆菌Top10,经阿拉伯糖诱导表达融合蛋白scFv-Fc。所表达的可溶性蛋白经亲和层析纯化、SDS-PAGE、Western blot分析鉴定,并用ELISA检测抗体效价。 结果序列分析表明重组质粒pBAD-scFv-Fc基因序列正确;SDS-PAGE分析表明,scFv-Fc融合蛋白分子量为60Ku,且为可溶性蛋白;该蛋白经过His亲和层析纯化、ELISA检测,结果表明,该融合蛋白能够与抗原分子Met特异性结合。 结论改造后的抗体融合蛋白scFv-Fc能与人Met特异性结合,增加了抗体蛋白溶解度,有利于抗体的大量制备。

关键词： 认识   基因工程疫苗   亚单位疫苗   减毒活疫苗   致病物质   人类   灭活疫苗   淋巴细胞   技术手段   传统疫苗   特种兵   病原体   白细胞   重组   招安   训练   卫士   体内   人体   免疫  

摘要： 传统疫苗说到底,本身就是一种病原体、致病物质,只不过被人类"招安",通过一些技术手段将它减毒、灭活,然后潜伏在体内,替人类工作.它的工作就是帮助人体的免疫卫士--白细胞、淋巴细胞等练兵,提前熟悉敌情,训练一批特种兵专门对付这种病毒.根据处理手段划分,疫苗主要分为灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗和重组基因工程疫苗等几类.

关键词： 玉米遗传育种   常规育种   玉米自交系   杂种优势群   分子标记技术   基因工程   玉米矮花叶病毒   玉米矮化花叶病毒   抗病基因   特种玉米   转基因植物   生物技术产品  

摘要： 育种工作者都希望培育出性状优良的品种,而实现这一目标的关键是得到目的基因和对高产、优质、抗病虫等目标性状的选择。过去人们多借用形态学和同工酶等遗传标记来辅助育种,并已在玉米育种中获得了成功。

关键词： 力达霉素   基因工程菌株   融合蛋白   cagA-VH基因   抑菌活性   HPLC分析  

摘要： 力达霉素(lidamycin，LDM)，原名C-1027，是一种新型的烯二炔类抗肿瘤抗生素，由球孢链霉菌C-1027(StreptomycesglobisporusC-1027)产生。其抗肿瘤活性比临床常用的阿霉素强10，000倍，已经进入临床II期试验。力达霉素由一个酸性辅基蛋白CagA(C-1027apoprotein、C-1027AG，也写作LDP)和一个烯二炔结构的发色团(chromophore，也写作LDC)非共价结合组成，发色团为活性组分，辅基蛋白保护和运载发色团。由于力达霉素自身具有辅基蛋白，可以将其与抗肿瘤抗体偶联成为融合蛋白，改造为靶向特异肿瘤的载体，构建导向性力达霉素。IV型胶原酶降解细胞基底膜中的Ⅳ型胶原，破坏基底膜及细胞外基质的完整性，引起肿瘤细胞的侵袭与转移，IV型胶原酶已经成为抗肿瘤研究的靶标。抗IV型胶原酶抗体可以抑制IV型胶原酶的活性并可作为导向药物的载体。<br>　　 本工作根据已知的抗IV型胶原酶单链抗体基因序列，设计合成了具有链霉菌偏好密码子的抗IV型胶原酶单域抗体VH(抗IV型胶原酶抗体重链可变区)基因，构建了含有辅基蛋白与抗IV型胶原酶单域抗体融合蛋白基因cagA-VH和用于筛选的阿普霉素抗性基因aac(3)IV的重组质粒pBSH，用接合转移的方法导入力达霉素产生菌***-1027，通过同源重组双交换，以cagA-VH-aac(3)IV取代力达霉素生物合成基因簇中原有的辅基蛋白基因cagA，得到基因工程菌株***-1027VH，以获得Ⅳ型胶原酶靶向的力达霉素。对基因工程菌株进行发酵，以枯草杆菌(Bacillussubtilis)为检定菌，结果表明基因工程菌株发酵液具有一定的抑菌活性，但与原产生菌相比活性较低。经Westernblot分析在胞内能检测到融合蛋白和降解的辅基蛋白，而胞外仅检测到降解的辅基蛋白条带。ELISA检测到融合蛋白的免疫活性。同时构建了含有融合蛋白基因cagA-VH但不含抗性基因的重组质粒pBS03H，通过同源重组双交换，以cagA-VH基因取代cagA基因，得到仅融合了抗IV型胶原酶单域抗体基因的基因工程菌株***-1027NVH。同样进行了发酵、抑菌活性、SDS-PAGE和Westernblot的检测，结果与***-1027VH基本相同。<br>　　 为了增加融合蛋白的表达量，获得高活性的导向性力达霉素，本工作进一步构建了辅基蛋白阻断株，并通过导入多拷贝的融合蛋白表达质粒的策略来提高融合蛋白的表达量。构建重组质粒pBSA，将质粒接合转移至***-1027中，采用同源重组双交换的方法将cagA基因阻断。通过抗性筛选、PCR和Southernblot验证，最终获得辅基蛋白阻断株，命名为***。用四种辅基蛋白表达质粒pKCTA900、pSETTA900、pLTA900和pLTA400分别导入在自身启动子和/或强启动子控制下的cagA基因对阻断突变株***进行互补，得到相应的互补菌株。对阻断株和互补菌株进行发酵，发酵液的抑菌活性和HPLC分析结果表明阻断株完全丧失了力达霉素的产生能力，而互补菌株能不同程度地恢复产生力达霉素，其中***/pKCTA900基本恢复到野生株的水平。将质粒pKCA900、pSETA900、pLA900和pLA400接合转移至野生株***-1027中构建了相应的辅基蛋白过表达菌株。抑菌活性和HPLC分析结果表明过量表达cagA基因可以提高力达霉素的产量。<br>　　 构建辅基蛋白.单域抗体的融合蛋白表达质粒pKCTH2600、pSETTH2600分别导入辅基蛋白阻断株中进行表达。重组菌株***/pKCTH2600发酵液的抑菌活性在发酵晚期与野生株相当，经Western1blot分析在胞内、胞外均能检测到融合蛋白的特异条带。ELISA检测到融合蛋白的免疫活性。结果表明融合蛋白在辅基蛋白阻断株中以多拷贝质粒的形式获得表达且表达量较基因工程菌株S。globisporusC-1027VH和***-1027NVH明显提高。<br>　　 综上所述，本工作通过优化融合基因的表达策略，提高了融合蛋白的表达水平，为获得抗IV型胶原酶单域抗体VH导向的力达霉素奠定了基础，为进一步构建高表达的导向力达霉素重组菌株提供了新的技术平台。

关键词： 大豆   品质改良   常规育种   基因工程育种   烟草   大豆球蛋白Gy7及Gy7 cDNA基因   叶盘法转化   根癌农杆菌   胚尖   6-BA,IBA   再生  

摘要： 大豆起源于中国,是重要的农作物和经济作物。其品质育种是大豆育种的重要目标。虽然依靠常规育种技术已选育出大量的优质大豆品种,但是随着经济的发展和人们生活质量的提高,对大豆的品质提出了更高的要求,通过基因工程育种改良大豆遗传性状,使其具有更高的营养价值和经济价值,已成为当今大豆遗传育种研究的热点。本文首先对目前利用常规育种和基因工程育种对大豆品质改良的研究进展进行了综述。 大豆含有丰富的蛋白质,是世界上重要的植物蛋白来源。其中大豆球蛋白方面的研究受到人们的重视。11S大豆球蛋白是大豆贮藏蛋白的重要成分,目前已发现六种有功能的大豆球蛋白,G1、G2、G3、G4、G5和G7,编码这些大豆球蛋白的基因家族分别是Gy1、Gy2、Gy3、Gy4、Gy5和Gy7。在六种有功能的大豆球蛋白中,通过分析比较重要氨基酸含量发现,Gy7基因编码合成的G7大豆球蛋白含有最高的赖氨酸含量和含硫氨基酸含量,是目前已发现的优质大豆球蛋白基因。 本文将实验室已构建的两种表达载体pCAMBIA1301-Gy1-Gy7-NOS和pCAMBIA1301-Gy1-Gy7 cDNA–NOS采用叶盘法分别转化烟草革新1号。经抗性筛选、分化和生根各获得转基因植株30和33棵,对T0代转基因植株进行PCR及PCR Southern检测结果显示,单转Gy7基因的转基因后代中有12棵呈现阳性,单转Gy7 cDNA基因的后代中有13棵呈现阳性。试验结果表明,Gy7和Gy7 cDNA基因已成功转入烟草中,并能够正常表达。本实验为以后利用两种表达载体转化大豆进而改良大豆蛋白质品质奠定了基础。 再生体系的建立是利用基因工程技术成功改良大豆品质研究的重要前期工作基础。本文采用胚尖法再生体系,以高蛋白大豆品种黑农35和黑生101为材料,研究不同浓度6-BA和IBA对胚尖出芽和伸长再生的影响,对大豆胚尖法再生体系进行了改良,为以后利用大豆胚尖法进行遗传转化提供理论依据。

关键词： 猪链球菌2型   马链球菌兽疫亚种   沙门氏菌   重组菌株   生物学特性   IgG亚类   免疫保护力  

摘要： 猪链球菌2型(Streptococcus suis type2)和马链球菌兽疫亚种(Streptococcus ***)是重要的人兽共患病病原,能引起猪和人的脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎以及突发性死亡,是我国猪链球菌病主要病原,对养猪业造成极大危害,同时对该病防治有重大公共卫生学意义。新近研究表明猪链球菌2型表面蛋白Sao、0197和马链球菌兽疫亚种表面类M蛋白SzP分别是两个病原的重要的毒力因子和保护性抗原,是优秀的疫苗候选抗原。减毒沙门氏菌作为疫苗载体一直受到医学与兽医学的广泛重视,具有能有效递呈抗原、诱导粘膜免疫、细胞免疫、制备成本低廉、副作用低等优点。本研究将上述抗原基因sao、0197、szp分段克隆至无抗性原核表达质粒,成功构建能有效表达外源抗原的无抗性重组猪霍乱沙门氏菌株,并对重组菌菌株作为猪霍乱沙门氏菌—猪链球菌多联基因工程疫苗的免疫效果进行初步评价,为猪链球菌病的防治进行有益探索。 1.猪霍乱沙门氏菌—猪链球菌重组疫苗菌株构建及生物学特性鉴定 参照经报道的猪链球菌2型05ZYH33株(genebank ***000407)sao基因、0197基因序列及马链球菌兽疫亚种ATCC35246株szp基因(genebank ***263781)序列,设计引物扩增sao基因A段(saoA,121bp-897bp),0197基因(121bp-1593bp)及szp基因A段(szpA,238bp-789bp),构建无抗性原核表达质粒pYA-saoA、pYA-0197及pYA-szpAsaoA,进一步电转沙门氏菌C501构建Asd互补菌株C501(pYA-saoA)、C501(pYA-0197)及C501(pYA-szpAsaoA),并对上述重组菌株生物学特性进行鉴定。结果表明:成功构建了重组沙门氏菌C501(pYA-saoA)、C501(pYA-0197)和C501(pYA-szpAsaoA);重组菌株回复了能在DAP-LB平皿上生长的能力;重组菌株能高效表达外源抗原,且额外的表达基本不影响沙门氏菌本身的生长特性、生化特性及表型;外源抗原基因能在重组菌内稳定遗传并持续表达;重组沙门氏菌C501(pYA-saoA)、C501(pYA-0197)和C501(pYA-szpAsaoA)毒力较亲本株C500略为下降,表明作为疫苗免疫安全性更好。 2.猪霍乱沙门氏菌—猪链球菌重组疫苗菌株免疫保护力研究 构建的重组菌C501(pYA-saoA)能高效表达猪链球菌2型Sao蛋白A段(SaoA),重组菌C501(pYA-szpAsaoA)能高效表达SaoA与马链球菌兽疫亚种类M蛋白A段(SzpA)的融合片段。将2株重组菌株分别制备基因工程疫苗,通过免疫小鼠实验研究免疫原性,评估免疫效力;为检测抗体,本研究通过BL21原核表达重组蛋白GST-SaoA、GST-SzpA,纯化的蛋白用于抗体ELISA检测。结果表明:制备的重组蛋白GST-SaoA、GST-SzpA用于ELISA具有较好的特异性和反应原性;无论采用口服还是皮下免疫方式,重组菌株C501(pYA-saoA)免疫小鼠能诱导特异性的针对rSaoA的血清IgG抗体及肠道sIgA抗体,并能提供免疫小鼠抵抗SC19致死剂量攻毒,口服免疫和皮下免疫保护率分别为73.3%、100%;重组菌C501(pYA-szpAsaoA)免疫小鼠能诱导特异性的针对rSaoA和rSzpA的血清IgG抗体及肠道sIgA抗体,并能提供免疫小鼠抵抗SC19与C55138致死剂量的攻毒,针对SC19攻毒,口服免疫和皮下免疫保护率分别为73.3%、80%,针对C55138攻毒,口服免疫和皮下免疫均能提供完全保护;进一步检测抗体IgG亚类,重组菌株C501(pYA-saoA)、C501(pYA-szpAsaoA)诱导的IgG以IgG2a为主,表明重组菌株诱导高水平体液免疫、粘膜免疫同时,也能诱导一定水平细胞免疫参与机体防御。

关键词： 多药耐药   微型双功能抗体   基因工程抗体   药物稳定性  

摘要： 肿瘤细胞对不同的化学相关或不相关的抗肿瘤药物产生不敏感性,即多药耐药(Multidrug resistance,MDR)。MDR是造成肿瘤化疗失败的主要原因,产生MDR的原因通常是因为药物失活或被外排泵排出肿瘤细胞。MDR产生的主要分子机制是细胞表面存在一种叫做P-糖蛋白(P-glycoprotein,Pgp)的跨膜糖蛋白,由MDR1基因编码,Mr为170000。Pgp蛋白属于ATP结合盒(ATP-binding cassette,ABC)转运蛋白超家族,是ATP依赖性的药物外排泵,能将各种不同的药物排出细胞,从而产生MDR。已经证实Pgp蛋白与肿瘤复发和预后差高度相关,是评价肿瘤预后的重要指标之一。以Pgp为治疗靶点已经成为克服肿瘤耐药的新策略。 Diabody是双特异性抗体(Bispecific antibody)的一种构建形式之一。通常是两个具有不同抗原结合位点的抗体可变区序列,在同一个启动子控制下组成两个顺反子,同一顺反子中VH和VL用一个短Linker连接。表达产物中同一顺反子上的V和V因Linker太短而存在空间位阻,不能配对,只能与另一顺反子上的V和V配对,共价结合形成二聚体。Diabody分子量在55-60 kDa,肿瘤穿透性强;缺乏Fc段,副作用小;Diabody能够将体内细胞毒性T细胞靶向到肿瘤细胞表面,直接发挥细胞毒杀伤效应,避免了使用外源性非特异性细胞毒性物质,并且不受MHC限制。抗CD3/抗Pgp Diabdoy具有良好的临床应用前景。但是,由于Diabody自身结构特点,两条肽链是通过非共价键结合在一起,容易解离而失去活性。向Diabody引入二硫键,可以大大增强其稳定性,并且不影响抗体亲和力,甚至亲和力增加。 T细胞活化需要协同刺激信号,否则,T细胞不但不能有效活化,还会处于无能状态。B7分子是协同刺激分子最主要的家庭成员,它包括两种分子:CD80和CD86。文献报道,化疗药物阿糖胞苷(ARA-C)能够诱导肿瘤细胞高表达B7分子。因此,我们推测抗CD3/抗Pgp Diabdoy和ARA-C联合应用可以增强细胞毒性T细胞的活性,达到更好的治疗效果。 本实验室构建了抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体(Diabody),并进行原核可溶性表达,体外实验证实具有良好的生物学活性,体内实验证实能有效地介导细胞毒性T淋巴细胞杀伤耐药移植瘤细胞。抗CD3/抗Pgp Diabody带有15肽的Etag纯化标记,可能引起免疫原性,影响其临床应用价值。并且抗CD3/抗Pgp Diabody在体内实验中,停药一周后肿瘤复发,不能彻底根除肿瘤。可能与体外活化的T细胞在体内不能维持其持续活化的状态,以及Diabody不稳定有关。本实验主要对抗CD3/抗Pgp Diabody进行了两项改进,分别为:①通过基因工程技术将抗CD3/抗Pgp Diabody的纯化标签Etag去除,降低免疫原性。与ARA-C联合应用治疗耐药裸鼠移植瘤。②向抗CD3/抗Pgp Diabody的抗CD3或抗Pgp可变区引入一对二硫键,增强其稳定性,提高疗效。 实验结果显示,去除Etag的抗CD3/抗Pgp Diabody生物学活性没有明显改变,与ARA-C联合应用,疗效大大增强,在观察窗内肿瘤没有复发。向抗CD3/抗Pgp Diabody的抗Pgp可变区引入一对二硫键后,二硫键不能正确配对。而向抗CD3/抗Pgp Diabody的抗CD3可变区引入一对二硫键后(dsCD3-Diabody),二硫键能够正确配对,在原核系统可溶性表达。dsCD3-Diabody抗原结合活性没有明显改变,介导细胞毒性T细胞发挥杀伤效应的能力亦没有明显改变,而体内外稳定性大大增强,介导细胞毒性T细胞杀伤耐药移植瘤的作用增强一倍。 近二十年来,已经证实存在肿瘤干细胞,肿瘤干细胞的存在可能是肿瘤复发难治的根源。最近研究显示,急性髓系白血病(AML)细胞上PgP蛋白的表达明显高于其他亚群的细胞,这样白血病干细胞(LSC)就容易逃脱化疗药物的杀伤作用,重新生长并增殖。研究同时发现,LSC上的Pgp蛋白虽然数量增多,但是其功能是降低的,这可能是ABCB1逆转剂临床治疗效果并没有预期那么好的原因之一。我们研制的抗CD3/抗Pgp Diabody是通过识别Pgp蛋白的三维结构,与之特异性结合,从而介导细胞毒性T细胞发挥细胞杀伤效应。因此,抗CD3/抗Pgp Diabody较ABCB1逆转剂具有更好的临床应用价值。

关键词： 六邻体   抗原性分析   基因克隆   腺病毒   基因序列   基因工程疫苗  

摘要： 目的：腺病毒(Adenovirus，AdV)是引起呼吸道感染最常见的病原体之一。其感染能导致严重的呼吸道疾患，尤其是婴幼儿、免疫低下者、器官移植或患有呼吸道疾病者，甚至能导致死亡，因此建立有效的防治腺病毒感染措施意义重大。六邻体是腺病毒主要的结构蛋白，能够刺激机体产生相应中和抗体。但腺病毒共有51个血清型，一种型别六邻体抗体能否与其他型别腺病毒发生免疫学反应，能否中和其他型别的腺病毒，对研发多效价的腺病毒疫苗具重要意义。本实验旨在预测不同型别腺病毒六邻体所共有的型间共同的特异性抗原表位，克隆、表达高度保守的腺病毒六邻体蛋白片段，为研发多效价的腺病毒疫苗奠定基础。<br>　　 方法：对GenBank中已收录的14个型别人呼吸道腺病毒核酸全序列进行比对分析，找出高度保守序列，结合抗原性预测的结果和六邻体蛋白三维空间结构暴露情况，对保守序列进行评价，确定了不同型别腺病毒六邻体所共有的型间共同的特异性抗原表位，选择了六邻体单体蛋白的基因序列进行克隆。以本实验室分离的腺病毒(HAdv)基因组DNA为模板，PCR扩增目的片段，定向克隆构建原核表达质粒pQE31-hexon。<br>　　 结果：通过生物信息学软件分析后确定六邻体蛋白氨基酸序列267～435比较适合研发多效价的腺病毒疫苗，扩增的基因长508bp。构建了重组质粒pQE31-hexon。<br>　　 结论：构建了重组质粒pQE31-hexon。为进一步表达、纯化该蛋白做准备，为开发研制预防多型别HAdV感染的多价腺病毒基因工程疫苗奠定了基础。

关键词： 猪水肿病   产类志贺毒素大肠杆菌   重组菌   生物学特性   基因工程疫苗  

摘要： 猪水肿病是由特定血清型产类志贺氏毒素大肠杆菌(Shiga-like toxin Escherichiacoli,SLTEC)引起猪的一种急性、致死性传染病,发病率低,但病死率高,幸存者发育迟缓,饲料回报率低,给养猪业带来很大的经济损失。猪霍乱沙门氏菌(SalmonellaCholeraesuis)是导致2-4月龄仔猪副伤寒的主要病原,过去曾是危害我国养猪业的主要疾病之一,现在在我国特别是农村散养户普遍存在,造成一定经济损失。 产类志贺毒素大肠杆菌的两个主要毒力因子是F18ab菌毛与类志贺毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)。编码F18ab的基因有6个:fedA、fedB、fedC、fedD、fedE和fedF。Smeds A等(2001)利用融合蛋白对F18菌毛粘附特性作了进一步的研究,表明纯化的FedF与细菌的粘附相关。SLT-Ⅱe毒素是由一个A亚基和5个B亚基共同组成的聚合体。SLT-Ⅱe的B亚基没有毒性,而具有免疫原性,是水肿病毒素的主要保护性抗原。 沙门氏菌作为疫苗活载体己受到学界的广泛重视,其主要优点包括沙门氏菌可以经口服或鼻内途径免疫,操作方便,对接种对象应激小。此外,沙门氏菌为胞内侵袭细菌,可以有效呈递抗原,并激发抗沙门氏菌和诱导外源蛋白的特异性体液与细胞免疫反应,并能同时诱导粘膜免疫与全身免疫。 基于以上原因,希望构建以沙门氏菌作为载体表达融合基因SLT-ⅡeB与FedF,得到一种疫苗可以同时预防仔猪水肿病和沙门氏菌病。主要研究内容包括: 1、重组质粒pYA-SF的构建 参照GenBank中大肠杆菌EC0412A株SLT-ⅡeB和FedF序列设计引物,以WH3基因组为模板扩增并克隆SLT-ⅡeB与FedF基因,扩增片段大小为204bp和840bp,前者引物引入EcoRI和SalⅠ酶切位点,后者引入SalⅠ和HindⅢ酶切位点。回收PCR产物,连接pMD18-T,得到质粒pMD18-SLT-ⅡeB-FedF,用EcoRⅠ和HindⅢ分别对质粒pMD-SLT-ⅡeB-FedF和pYA3493双酶切,回收、连接、转化Asd大肠杆菌x6097,得到质粒pYA-SLT-ⅡeB-FedF(缩写为pYA-SF)。 2、重组菌株C501(pYA-SF)的构建与鉴定 将重组平衡表达质粒pYA-SF电转化△asdC500缺失株,在无DAP的LB平板上筛选阳性重组子。用引物pa7/pa6对重组菌株进行鉴定,可以扩增出△asd缺失型菌株的2,229 bp片段,而亲本菌C500则扩增出4,000 bp的片段;引物ps1/ps2扩增出SLT-ⅡeB特异性片段204 bp,引物pf1/pf2扩增出FedF特异性片段840 bp,而亲本菌C500则不能扩增出该两种片段。结果表明获得含有pYA-SF质粒的重组菌株是正确的。 3、重组菌株生物学特性的研究 表型研究与生化特性研究表明重组菌株C501(pYA-SF)与亲本株C500相同。生长曲线得出C501(pYA-SF)生长速度与亲本菌株C500相似,而比C500缺失菌株△asdC500(pYA3493)的生长速度稍快。遗传特性研究表明重组菌株可以稳定遗传。SDS-PAGE结果显示,重组菌株可以分泌表达,因为重组菌株C501(pYA-SLT-ⅡeB-FedF)在约37kDa处有明显的表达带,而空载体对照菌株C501(pYA3493)则没有对应的表达带。 4、基因工程疫苗对小鼠的免疫保护效力研究 皮下免疫小鼠,每周采集小鼠血清,利用间接ELISA检测所有免疫组的IgG抗体,结果表明针对相应抗原的抗体相应增加,加强免疫后抗体平均水平进一步提高。小鼠免疫后30天,分别用猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-1(1×10 CFU)口服攻毒和猪水肿病大肠杆菌强毒株WH3(5×10 CFU)腹腔攻毒,亲本菌株C500组和重组菌株免疫组小鼠抵抗10×LD的猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-1的攻击,而PBS对照组小鼠全部死亡,然而重组菌株免疫组和水肿病三价灭活苗组对2.5×LD大肠杆菌强毒株WH3的攻击差别比较大,重组菌株免疫组只能提供43%的保护率,灭活苗组却能提供89%的保护率,同期的PBS对照组小鼠全部死亡。 5、基因工程疫苗对猪的免疫保护力研究 重组菌株的安全性试验结果发现所有C500(pYA-SF)肌肉注射接种组仔猪的精神食欲正常,未见异常变化。亲本菌株C500接种的仔猪,也没有异常临床表现。将6×10 CFU重组菌株C501(pYA-SF)分别通过肌肉注射途径免疫20日龄仔猪,结果显示免疫仔猪能产生较高水平的抗沙门氏菌和SLTEC重组蛋白rSF的血清IgG,并能抵抗5×LD猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-1的耳静脉攻击(4/4)。同时,免疫仔猪也能抵抗SLTEC强毒株WH3分泌毒素的耳静脉攻毒途径的攻击(3/4),而PBS组

关键词： PRRSV   PCV2   核酸疫苗   重组鸡痘病毒   免疫及攻毒保护实验  

摘要： 猪繁殖与呼吸综合症和猪圆环病毒病是目前养猪生产危害严重的重要传染病,引起猪的呼吸系统疾病综合症,病原体是猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcinereproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪2型圆环病毒(Porcinecircovirus 2,PCV2),这两种病原体均可引起猪的免疫抑制。目前,PRRSV和PCV2混合感染已成普遍,两者混合感染时由于免疫抑制,触发猪群其他传染病的发生与流行,病死率增高。当前,对PRRS的防制主要是采用综合防治和疫苗免疫接种相结合的方法,而对PCV2的预防尚无有效的手段。 PRRSV的E蛋白抗体与病毒中和作用有关,与病毒血症消失也相关。PRRSV的E蛋白可诱导机体强烈的体液免疫反应,M蛋白则可诱导病毒中和抗体,且诱导机体细胞免疫。PCV2 Cap蛋白是病毒的主要结构蛋白,具有良好的免疫原性,是构建重组疫苗的首选免疫诱导相关抗原。 为探讨PRRSV E蛋白突变前后对机体的免疫诱导,构建了PRRSV、PCV2基因工程疫苗,本研究采用RT-PCR方法扩增了PRRSV主要保护性抗原基因ORF5、ORF6和PCV2的主要结构蛋白基因ORF2。在对PRRSV ORF5突变的基础上,构建了含有PRRSV ORF5、ORF6、PCV2 ORF2和猪IL18基因的重组核酸疫苗质粒和重组鸡痘病毒。经IFA、RT-PCR等检测结果表明,重组核酸疫苗和重组鸡痘病毒中的目的基因在真核细胞中得到正确表达。 小鼠免疫试验结果表明,从免疫后2～3周开始,小鼠血清中开始出现PRRSV和PCV2特异性抗体,加强免疫后抗体水平继续升高,显著高于pIRESneo免疫对照组。细胞免疫检测结果表明,重组核酸疫苗免疫组小鼠CD4CD8T淋巴细胞亚类的数量及淋巴细胞刺激指数显著高于灭活疫苗免疫组和pIRES免疫组。 猪体免疫试验结果证明,构建的重组核酸疫苗均能刺激实验猪产生PRRSV、PCV2特异性抗体和中和抗体,中和抗体效价最高均可达1:16。细胞免疫检测结果表明PRRSV、PCV2特异性T淋巴细胞增殖、CD4CD8T淋巴细胞比例上升、IFN-γ和IL-2分泌水平显著提高,表明核酸疫苗能够介导较好的Th1类免疫反应。重组核酸疫苗免疫猪的组织器官无病理损伤,可以防止猪体病毒血症的出现。攻毒保护实验证明重组核酸疫苗对实验猪起到明显的免疫保护作用。