关键词： 基因工程疫苗   植物组织   免疫应答反应   转基因植物   抗原蛋白   侵染能力   防御能力   过敏反应  

摘要： 植物基因工程疫苗是利用植物系统表达病原菌抗原蛋白一个或几个亚单位的疫苗，它没有病原菌完整的侵染能力，却可以使机体对特异的病毒或细菌产生免疫应答反应。由于转基因植物产生的疫苗对动物实施免疫只是简单地摄取含这种疫苗的植物组织或种子，所以这种疫苗不会被酶类所破坏，可通过机体肠道黏膜作用激发特异性免疫应答，使动物获得持久性疾病防御能力，且没有或很少出现病原体的过敏反应。

关键词： 抗中性粒细胞胞浆抗体   糖皮质激素治疗   利妥昔单抗   血管炎   systemic   CD20分子   基因工程抗体   急进性肾炎  

摘要： 肾脏是抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎(anti-neutrophil cytoplasm antibody associated systemic vasculitis,AASV)最常累及的器官,常表现为急进性肾炎,死亡率高.尽管大多数AASV患者对免疫抑制剂和糖皮质激素治疗有较好的疗效,但是本病的高复发率、治疗过程中的毒副作用、高感染率等都导致AASV的预后不佳.利妥昔单抗(rituximab,RTX)是一种特异性针对CD20分子的基因工程抗体,能与B淋巴细胞表面的CD20结合,并通过补体介导的细胞毒作用等机制对B淋巴细胞进行特异性清除,从而达到治疗作用.

关键词： 村级动物防疫员   生猪   人畜共患病   定点屠宰   兽药产品   动物防疫体系   屠宰场   肉类产品   基因工程疫苗   禽流感   国家工程实验室   兽医部门   动物卫生监督   行业动态  

摘要： 国内要闻农业部专家称禽流感不会出现大范围暴发流行2009年1月8日,从农业部获悉,针对当前正值禽流感高发季节,禽流感疫情防控形势严峻,农业部要求各地采取强化免疫、加强疫情监测和报告、加强活禽市场监管、强化流通环节检疫监管、抓实春节期间疫病防控和动物卫生监督等五项措施加强防控。

关键词： 噬菌体抗体库   单链抗体   羊  

摘要： 【目的】构建单链抗体(ScFv)噬菌体表面展示文库,从中筛选抗羊抑制素单抗并进行表达,建立制备羊抑制素单抗的新方法。【方法】用未经免疫的多种小鼠脾细胞作为基因来源,采用噬菌体抗体库技术,构建天然噬菌体表面抗体文库。用羊抑制素对其进行3轮吸附-洗脱-富集,筛选抗羊抑制素单抗,用ELISA检测其抗原结合活性。【结果】构建了天然鼠源噬菌体抗体库,为筛选和制备各种单链抗体提供了一个平台。用羊抑制素对其进行筛选,制备抗羊抑制素单抗,经ELISA检测,55/96克隆具有与羊抑制素结合活性,阳性率为57%。【结论】制备的羊抑制素可溶性ScFv及其表面展示噬菌体抗体有很好的抗原结合活性,为羊抑制素单抗的制备提供了一种新的方法。

关键词： 酶联免疫吸附   化学发光检测   出血热   组织灭活疫苗   体外细胞培养   基因工程疫苗   病毒衣壳蛋白   烈性传染病   兔子   高效表达   方法   病毒疫苗   致死率   养殖业   发病率   危害   损失   热症   缺陷   基础  

摘要： 兔出血热症(RHDV)是兔子的一种烈性传染病,该病的发病率和致死率都非常高,给兔子养殖业带来了巨大的损失和危害.目前,该病毒体外细胞培养的方法尚未建立,所以,兔出血热病毒疫苗都是第一代疫苗,即组织灭活疫苗,它们存在一定的缺陷和风险.因此,能体外建立高效表达病毒衣壳蛋白VP60的方法可以为基因工程疫苗的产生奠定坚实的基础.

关键词： 苏丹红I   单链Fab抗体   包涵体   酶联免疫吸附测定  

摘要： 抗体是机体免疫系统针对侵入体内的抗原物质所产生的一种特异性免疫球蛋白,抗体研究的发展经历了多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体三个阶段。基因工程抗体是将抗体基因或基因片段通过基因工程技术进行重组,并在不同表达系统中产生的抗体或抗体片段,目前基因工程抗体包括人-鼠嵌合抗体、改型抗体、双特异性抗体、小分子抗体等。 所谓小分子抗体是指相对分子质量较小但具有抗原结合功能的抗体分子片段,包括Fab、Fv、scFv等,其中Fab和scFv是目前小分子抗体研究的重点。 小分子抗体具有制备方法简单、免疫原性弱、穿透力强等优点,因此在肿瘤导向治疗和病毒性疾病的治疗,以及放射免疫成像检查肿瘤等方面得到了广泛的应用。 本课题是在结合小分子抗体Fab和scFv优缺点的基础上,拟克隆抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体的编码基因Lc和Fd,并将二者在原核表达载体pET24a内用人工合成的Linker连接,构建成基因工程抗体scFab的表达载体,最后通过原核表达,期望能得到一种兼具scFv和Fab优点的新型基因工程抗体scFab。本论文主要包括以下几个部分: 1.从分泌抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体的杂交瘤细胞中通过PCR技术获得Lc和Fd基因,克隆至T-A克隆载体后,进行克隆鉴定和DNA测序。DNA序列BLAST和编码蛋白质序列分析表明所得到的抗体基因符合小鼠的IgG基因特征。 2.经过对已有载体的改造,重新设计了可以直接用于scFab原核表达的载体;同时,在上述对抗体分析的基础上,选取合适Lc和Fd基因片段,在其两端引入酶切位点后与人工合成的Linker相连,一起克隆到经过改造的载体pET24a(+)中,构建成表达载体pET24a-scFab,成功转染大肠杆菌***21(DE3)。 ***诱导scFab在*** BL21(DE3)表达,SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定,显示scFab蛋白以包涵体的形式表达,经过对其表达条件进行优化后,获得大量表达的scFab抗体蛋白包涵体。 4.尿素溶解scFab包涵体,以含谷胱甘肽氧化还原系统的复性液对其进行复性,透析浓缩得到复性抗体,间接ELISA和竞争ELISA检测结果表明复性抗体对苏丹红Ⅰ具有很高的结合活性和结合特异性。 论文结论:本研究成功构建了一种新型基因工程抗体scFab,为新型基因工程抗体研究奠定了初步的理论和实验基础。

关键词： 痘苗病毒   天花病毒   中和性抗体   预防和治疗   痘病毒感染   世界卫生大会   抗感染治疗   种痘   正痘病毒   疫苗   突发事件   生物武器   生物恐怖   被动免疫   自然界   治疗性   预防方   特异性   类病毒   制剂  

摘要： 痘苗病毒(Vaccinia virus,VACV)属于痘病毒科、正痘病毒属,是迄今所知结构最为复杂的一类病毒,曾是预防天花病毒的一种有效疫苗.1980年世界卫生大会正式宣布天花被完全消灭,天花病毒在自然界已不存在,并推荐不需再接种痘苗.然而非法保存的天花病毒有可能成为生物武器而用于生物恐怖,停止种痘使得多数人暴露于感染天花的危险之中.为了预防和治疗天花及其它痘病毒感染、应付突发事件,上述这些重新唤起了人们对痘苗病毒作为一种疫苗及其相关诊断、治疗性制剂的研究开发兴趣.中和性抗体在抗感染治疗及紧急被动免疫预防方面一直扮演着重要的角色.由此可见,研制特异性针对痘苗病毒的中和性抗体以用于紧急预防和治疗是十分必要和可行的.

关键词： 宫颈癌   基因工程疫苗   转基因番茄   植物偏爱密码子优化   HPV18L1全长基因   基因克隆   嵌合型启动子  

摘要： 第一篇、植物偏爱密码子优化HPV18L1全长基因的克隆及其植物表达载体的构建。 植物口服疫苗，成本低廉，使用简便，可规模化生产，且具有完整的真核细胞表达系统；果蔬类植物如番茄、香蕉等以其独具的可食（饲）性在疫苗研制方面展示了良好的开发应用潜能。目前已有多种疫苗分子在转基因植株中得到表达，部分植物疫苗经动物实验和志愿者的口服免疫测试结果表明：其可有效激发机体产生特异性的局部粘膜免疫反应和全身体液免疫、细胞免疫反应。 宫颈癌：女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，每年约有51万妇女被诊断为宫颈癌，其中约28．8万的死亡病例。近20年来对宫颈癌的病因及癌变机制的研究表明人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）是宫颈癌的主要致癌因素，近99%的宫颈癌组织中可检出HPV DNA。因此，控制HPV感染必将减少肿瘤的发病率。HPV晚期基因编码的病毒主要结构蛋白（衣壳蛋白）L1具有自我组装的功能，在HPV病毒颗粒的形成过程中起到了包装病毒DNA的作用，在许多表达系统中，衣壳蛋白可以在体外合成不含病毒DNA的类病毒颗粒（viruslike particles，VLPs），它可诱导出特异性针对HPV衣壳蛋白的免疫反应，是宫颈癌预防性疫苗的关键靶点。Gardasil和Cervarix HPV VLP预防性宫颈癌疫苗的上市，意义重大，但其价格高昂，在发展中国家广泛应用存在困难。植物基因工程的发展，给宫颈癌疫苗研制带来新的思路，探索研制价廉易用的果蔬型植物口服疫苗，对宫颈癌的防治意义重大。 本研究以植物偏爱密码子对HPV18L1基因进行改造，以期获得改造后的HPV18L1全长基因（mHPV18Ll），并构建以E35S-E8嵌合型启动子驱动的重组质粒：中间载体pB35E8-18L1及植物表达载体pC35E8-18L1，为进一步深入研发HPV转基因植物口服疫苗研究奠定前期工作基础。 目的：设计合成植物偏爱密码子优化后的mHPV18L1全长基因，并构建由嵌合型启动子E35S-E8驱动mHPV18L1的植物表达载体。 方法： 1．自GenBank获取国内外所发布的HPV18L1全长基因序列，经生物信息学分析后选定目标序列，经Synthetic Gene Designer及JCat （Java Codon Adaptation Tool）分析软件将此序列原始密码子改造为植物偏爱密码子，在C端加入蛋白纯化标签His-tag，获得改造后的mHPV18L1全长序列； 2．将mHPV18L1亚克隆入pMD18T-mHPV18L1重组质粒，并进行酶切分析和测序鉴定以确证； 3．选择嵌合型启动子E35S-E8驱动mHPV18L1，亚克隆构建中间载体和植物表达载体，并进行酶切和测序鉴定。 结果： 1．通过重叠PCR合成了植物密码子优化的mHPV18L1全长基因，构建了重组质粒pMD18-T-mHPV18L1。 2．成功构建由嵌合型启动子驱动mHPV18L1的中间载体pB35E8-18L1和植物表达载体pC35E8-18L1。 结论：成功获得植物偏爱密码子优化后的mHPV18L1全长基因及E35S-E8嵌合型启动子驱动的植物表达载体pC35E8-18L1，为后续mHPV18L1在植物中的转化、表达奠定了一定的工作基础。 第二篇、嵌合型启动子驱动弓形虫tSAG1在转基因番茄中的表达研究。 番茄是广为人们喜爱且可生食的果蔬类植物，另其有较为成熟的再生、转化技术体系，在转基因植物口服疫苗研究中，番茄作为重要的转基因植物受体一直备受青睐。然而，以农杆菌介导的基因组稳定转化体系可能出现的位置效应和转基因沉默而导致的外源目的基因的表达效能低下，依然是需要解决的重要问题。正确选择能启动外源目的基因高效能表达的启动子是植物反应器研究中的关键环节。 本室前期有关弓形虫转基因番茄口服疫苗的系列研究呈示：E35S-E8嵌合型启动子具有优于常用植物组成型E35S启动外源基因表达的潜能。本研究正是基于此工作基础，对E35S-E8嵌合型启动子驱动弓形虫tSAG1在转基因番茄中的表达进行了深入的研究，对在番茄中表达的重组tSAG1进行了表达量、稳定性以及免疫反应性的鉴定，旨在为后续弓形虫转基因番茄口服疫苗研究筛选获得高效能表达具有免疫学活性tSAG1转基因番茄品系以实施下一步的动物口服免疫实验，同时也为HPV及其他疾病疫苗分子（如本论文第一篇中的mHPV18L1）在转基因番茄中的表达研究提供含具有高效能启动活性的启动子在内的优化表达体系。 目的：对E35S-E8嵌合型启动子驱动弓形虫tSAG1在转基因番茄植株中的表达量、稳定性及其免疫反应性进行鉴定。 方

关键词： 抑制素   基因疫苗   免疫反应  

摘要： 抑制素具有抑制促卵泡素合成与分泌的功能,其主动或被动免疫动物,可以促进排卵、提高产仔数,进而提高繁殖力。国内外科学家致力于抑制素疫苗的研究,从天然提取,人工合成,重组表达到基因免疫。基因免疫技术是上世纪90年代发展起来的免疫新技术,与第一代、第二代免疫技术相比,具有安全、有效、制备容易、保存运输方便等优点,因而受到广泛重视。前期研究证明,抑制素DNA疫苗具有抑制素蛋白质疫苗的作用,但与蛋白质疫苗相比,抑制素DNA疫苗免疫原性相对较低;之外,目前抑制素DNA疫苗是以抗性基因标记筛选的,而美国FDA组织规定在临床上严禁使用含有抗性基因筛选标记的疫苗。为解决上述问题,本研究选择牛疱疹病毒(bovine herpes virus-BHV-1)的BVP22基因佐剂来增强激素类基因疫苗的免疫效果,主要包括抑制素和生长抑素的基因疫苗。而DNA疫苗的抗性基因则以营养筛选标记替代,且以缺失相关营养标记基因的减毒沙门氏菌为载体传递疫苗,构建成对基因治疗更为有效安全的染色体-质粒平衡致死系统。具体内容如下: (1)BVP22基因佐剂对抑制素DNA疫苗免疫效果的研究:构建与BVP22融合的抑制素DNA疫苗pEGISI-VP22,将pEGISI-VP22与pEGISI免疫雌性昆明小鼠,结果pEGISI-VP22诱导的ELISA抗体及小鼠的产仔数均显著高于pEGISI免疫组,表明与BVP22融合表达能显著增强抑制素DNA疫苗的体液免疫,并能进一步提高小鼠的繁殖力,是一种极有希望的抑制素新型DNA疫苗。 (2)BVP22基因佐剂对生长抑素基因疫苗免疫效果的研究:构建与BVP22融合的生长抑素DNA疫苗pEGS2SS-VP22,体外试验证实pEGS2SS-VP22可表达生长抑素融合蛋白BVP22-S2SS。表达质粒免疫昆明小鼠,发现与BVP22融合能快速增强SS特异性ELISA抗体,提高小鼠的生长速度,表明BVP22能增强生长抑素DNA疫苗的免疫反应。同时验证BVP22基因佐剂是增强激素类基因疫苗免疫反应的新途径。 (3)以减毒猪霍乱沙门氏菌为载体传递抑制素DNA疫苗的研究:首先利用asd基因营养筛选标记取代pVAX载体的kan抗性基因筛选标记,成功构建不含抗性筛选标记的真核表达质粒pVAX-asd。从而构建无抗性抑制素真核表达质粒pVAX-asd-IS。该质粒pVAX-asd-IS以减毒菌为载体进行传递,构建成抑制素重组菌C501(pVAX-asd-IS)。口服途径免疫45只小鼠,对其免疫剂量(10,10,10CFU/mL)、免疫次数(1、2、3)进行比较。结果以10CFU/mL的剂量仅免疫一次后的小鼠产仔数显著高于其他试验组与对照组。免疫后小鼠可诱导Th1和Th2型免疫反应,以诱导Th2型免疫为主。在试验结束后宰杀小鼠,取其内脏等组织,通过石蜡切片和基因整合等检测方法证明以减毒猪霍乱沙门氏菌为载体传递抑制素DNA疫苗是安全、有效的。 (4)重组菌C501(pVAX-asd-IS)免疫途径(口服、肌注)比较研究。36只小鼠分为6组,免疫后对诱导的体液免疫、粘膜免疫以及细胞免疫中的IL-4和IFN-γ进行比较。结果说明肌注和口服免疫都可诱导机体Th1型和Th2型免疫反应,但肌注效果更好,且能提高产仔数。 (5)以减毒猪霍乱沙门氏菌为载体传递抑制素重组抗原的研究:将抑制素基因片段融合入asd筛选标记原核表达质粒pYA3493中,制备抑制素重组原核表达质粒pYAIS。将质粒pYAIS电转化入减毒猪霍乱沙门氏菌asar缺失株C500中,制备重组菌C501(pYAIS)。结果表明重组菌C501(pYAIS)能稳定遗传并可表达抑制素重组抗原。分别将重组菌以三个剂量(10,10,10CFU/mL)和不同免疫次数(1、2、3)口服免疫昆明小鼠,结果显示试验组均产生较高水平IgG抗体。与其他试验组和对照组相比,以10CFU/mL剂量免疫三次后小鼠产仔数最高,差异显著。试验中小鼠均无异常临床表现,对机体不存在急性、慢性以及生殖等方面毒性作用。

关键词： 三唑磷   ELISA   单克隆抗体   单链抗体   二硫键稳定Fv抗体   同源建模   分子对接  

摘要： 为了研制基因工程抗体,本文首先通过杂交瘤技术筛选能够稳定分泌高亲和力、高特异性抗体的杂交瘤细胞,以从中克隆编码抗体可变区的基因。利用杂交瘤细胞制备的单克隆抗体建立了三唑磷残留ELISA检测方法,并对方法进行了系统优化。优化后的ELISA应用于食品和环境样品中三唑磷残留检测,其良好的回收率和较小的变异系数一方面证明了ELISA在三唑磷等农药的残留检测中具有良好的应用前景,另一方面也说明筛选的杂交瘤细胞是成功的,可以用于基因工程抗体的研制。 然后从杂交瘤细胞株出发,通过RT-PCR技术,利用小鼠重链和轻链可变区通用引物扩增得到了抗三唑磷单克隆抗体轻、重链可变区基因序列。再通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法,将两个可变区基因连接起来,构建了单链抗体(ScFv)核苷酸序列。然后将ScFv序列插入到pET-29a(+)载体,得到了重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,阳性菌株经IPTG诱导培养后,表达得到了ScFv蛋白。蛋白经过变性、纯化和复性处理后,通过竟争抑制ELISA进行了初步鉴定,结果表明,ScFv具有免疫亲和活性。 在此基础上,利用Accelrys公司的Discovery Studio(DS)软件系统通过同源建模法模拟了抗三唑磷单链抗体的三级结构及ScFv与三唑磷农药小分子间的对接构象。首先通过模板分子搜索、序列比对、构建模型及模型合理性评价等过程分别构建了轻、重链可变区三维结构;然后再通过模板分子搜索、序列比对及叠合等过程,初步构建了ScFv的三维结构模型。模型经过动力学和能量最小化优化后,最终得到了评价合理的ScFv的三维结构。分子对接模拟结果显示,单链抗体与三唑磷主要以范德华力和氢键发生相互作用,抗体有13个氨基酸残基可以与农药分子发生作用。这些氨基酸作用位点和作用方式的确定为进一步进行抗体分子的改造和研究抗体与农药小分子间的作用机理打下了坚实的基础。 最后在二硫键稳定抗体(dsFv)的研制、dsFv同源建模及分子对接方面开展了部分工作。利用PCR定点突变法,通过设计突变引物,成功地将半胱氨酸突变位点引入了轻、重链可变区的相应位点,从而为dsFv小分子抗体的研制打下了基础。DS软件系统对dsFv三级结构及dsFv与三唑磷的对接构象的模拟结果表明,dsFv与ScFv具有相似的活性口袋,在与三唑磷发生对接过程中,也是以氢键和范德华力作为主要作用方式,参与作用的氨基酸残基大部分相同,但dsFv可参与反应的氨基酸数目更多,这意味着dsFv和ScFv对三唑磷的亲和力可能会有差异。