关键词： Met   基因工程抗体   融合蛋白   Fc片段  

摘要： 目的:将已制备的抗Met单链抗体基因与人IgGFc基因片段融合,表达有活性的融合蛋白分子,以增强单链抗体的可溶性。方法:从人淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增并制备人IgG的Fc基因片段,并克隆于已构建好的pBAD-scFv原核表达载体中,转化大肠杆菌Top10,经阿拉伯糖诱导表达融合蛋白scFv-Fc。所表达的可溶性蛋白经亲和层析纯化、SDS-PAGE、Westernblot分析鉴定,并用ELISA检测抗体效价。结果:序列分析表明重组质粒pBAD-scFv-Fc基因序列正确;SDS-PAGE分析表明,scFv-Fc融合蛋白分子量为60ku,且为可溶性蛋白;该蛋白经过His亲和层析纯化、ELISA检测,结果表明,该融合蛋白能够与抗原分子Met特异性结合。结论:改造后的抗体融合蛋白scFv-Fc能与人Met特异性结合,增加了抗体蛋白溶解度,有利于抗体的大量制备。

关键词： 叶绿体   基因组   基因工程  

摘要： 本文介绍了植物叶绿体基因组的特征、叶绿体基因的表达调控以及叶绿体基因工程。

关键词： 灭活疫苗   保存   运输   基因工程疫苗   病原微生物   传染性疾病   生物制品   免疫效果  

摘要： 疫苗是由病原微生物或其产物制成的，能有效预防动物传染性疾病的生物制品，包括活疫苗、灭活疫苗以及基因工程疫苗等。然而，很多因素会影响疫苗的免疫效果，甚至造成免疫失败。因此，本文介绍如何正确购买、运输和保存疫苗，为生产实践提供一些参考。

关键词： 基因工程   番茄   育种  

摘要： 文章简单介绍了基因工程的概念、特点及其意义,并对基因工程在番茄抗虫害、抗病害、抗除草剂、抗逆性、雄性不育、改善番茄品质和终结种子育种上的原理、应用及研究进展进行了综述,同时探讨了基因工程在番茄育种中存在的问题,解决方法和发展前景,并且对基因工程在番茄育种中的应用进行了简单总结与概括。

关键词： 溶藻弧菌   单链抗体   基因工程疫苗   斜带石斑鱼   活性检测   原核表达  

摘要： 近年来，单链抗体技术的发展非常迅速，并被广泛地应用于人类疾病的研究中，但是在水产领域中的应用却鲜有报导。本论文的目的是构建斜带石斑鱼抗溶藻弧菌单链抗体，并对其原核表达产物与溶藻弧菌的结合活性进行检测。本实验设计引物所用的序列来自实验室构建的经溶藻弧菌感染后的斜带石斑鱼外周血淋巴以及头肾Smart cDNA文库，经测序后发现的大量的免疫球蛋白重链与轻链的基因，这为斜带石斑鱼抗溶藻弧菌单链抗体的构建提供了丰富的材料，通过对测序得到的免疫球蛋白可变区序列进行分析，根据其可变区的框架一区(FR1)和框架四区(FR4)筛选出一类丰度较高的重链的可变区(VH)与轻链的可变区(VL)基因序列，并分别按照这两类序列的框架一区(FR-1)和框架四区(FR4)设计引物进行VH、VL的扩增，在Vn的5’端、VL的3’端分别加上Nde I和Xho I酶切位点以便与表达载体pET-21a连接，中间以一段柔和的多肽(Gly4Ser)3(linker)按Vx-linker-VL的形式连接后构建抗溶藻弧菌的单链抗体(SeFv)的原核表达质粒pET21a-S，经测序后得到ScFv基因序列全长705碱基对，编码235个氨基酸，符合鱼类免疫球蛋白可变区基因的特征，含有框架区(FRs)、抗原互补区(CDRs)以及免疫球蛋白特征性的半胱氨酸残基，证明ScFv基因构建成功，于是用该质粒转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达，并在37℃、28℃、16℃分别进行了表达，结果显示在三个温度下ScFv均以包涵体的形式进行表达，分子量为24.8kDa；所得蛋白纯化后，用ELISA进行抗原结合活性检测其效价为1:3200；随后再用表达的ScFv蛋白与佐剂混合后对体重约2kg的新西兰大白兔进行免疫制备多克隆抗体，免疫程序结束后抽血并分离血清，检测血清中抗ScFv的多克隆抗体的效价为1:10000.\n 本实验成功构建了斜带石斑鱼抗溶藻弧菌单链抗体ScFv，并成功进行了原核表达以及表达产物的纯化，用ELISA检测了ScFv与抗原(溶藻弧菌)的结合活性，其结果显示ScFv与溶藻弧菌有良好的结合活性；随后制备的兔抗ScFv的多克隆抗体经ELISA检测显示出ScFv还具有良好的免疫原性。以上的研究为ScFv作为基因工程疫苗以及作为溶藻弧菌的特异性探针等实际应用奠定了基础。

关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒   ORF5基因变异   基因工程疫苗  

摘要： ORF5基因编码的E蛋白是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的主要结构蛋白,糖基化的囊膜蛋白E蛋白具有良好的免疫原性,能够代替PRRSV诱导机体产生免疫应答,产生保护性中和抗体,是研发基因工程疫苗的优良候选基因之一,在防控PRRS方面有着重要的意义。目前PRRS的流行毒株存在着广泛的变异,尤其是稳定性较差的ORF5基因的变异给PRRSV的检测和防控带来很大的困难。本文就国内外学者对ORF5基因的变异情况以及基于PRRSV ORF5基因在基因工程疫苗方面的研究进展作了综述。

关键词： 植物   基因工程   疫苗   畜牧业  

摘要： 利用基因工程技术构建植物生物反应器,生产畜禽的植物基因工程疫苗是新兴的研究领域,和其他疫苗相比,具有廉价、安全、有效等优点。在最近的研究中,越来越多的抗原蛋白在植物中得到了表达。应用植物基因工程生产畜禽疫苗对预防集约化饲养动物传染病的发生和流行具有重要意义。本文就植物基因工程疫苗的特点及其在畜禽业上的应用和发展前景进行了综述。

关键词： 猪圆环病毒   包涵体   Ni-BPA亲和层析   免疫效应   基因工程疫苗  

摘要： 猪II型圆环病毒(PCV2)是近年来发现的动物病毒之一，该病毒与猪的多种疾病综合症有关，特别是仔猪断奶后多系统衰竭综合症。该病最早于1991年在加拿大西部发现，病原学及血清学调查表明在许多国家都广泛存在，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。研究表明在主要的几个开放阅读框中，ORF1相对保守，主要编码病毒的复制蛋白，而ORF2相对变异较大，是主要的免疫原性基因，也是PCV2亚单位疫苗研制的主要对象。为了了解PCV2在我国的流行现状以及研制安全、高效的疫苗用于PCV2感染的防治，本课题对PCV2基因工程疫苗进行了探索研究，主要研究内容如下：\n 以河南省猪圆环病毒阳性仔猪的脾脏为材料，提取病毒DNA，根据已报道的PCV2序列设计合成2对引物，应用PCR技术，扩增出猪圆环病毒野毒株ORF2基因和去信号肽基因命名为CORF2，然后将其克隆于pUCm-T载体中，构建克隆载体pUCm-T/CORF2，pUCm-T/ORF2，并进行核苷酸序列测定。\n 1.对CORF2，ORF2基因进行序列分析后，分别酶切pUCm-T/CORF2，pUCm-T/ORF2得到ORF2和CORF2基因，与原核表达载体pET-32a(+)、pET-41a(+)相连，构建重组质粒pET-32a/CORF2、pET-41a(+)/ORF2。\n 2.重组质粒pET-32a/CORF2，pET-41a(+)/ORF2转入宿主菌BLgold(DE3)中，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，用SDS-PAGE电泳和Western blotting检测蛋白表达情况及表达蛋白活性。结果表明重组质粒pET-32a/CORF2能在大肠杆菌中高效表达，其表达的蛋白以包涵体形式存在，表达产物的分子量为38KD左右，与理论推测的蛋白分子量一致。EWestern-blotting及建立的间接ELISA方法检测，表达的ORF2蛋白可被猪圆环病毒阳性血清所识别。pET-41a(+)/ORF2也能在大肠杆菌中表达，表达效果不是很好，经换载体与表达菌后仍不能高效表达，最后放弃。\n 3.收集重组质粒pET-32a/CORF2诱导表达的菌液，超声波破碎分离包涵体，TritonX-100和NaCl分别洗涤包涵体，用8mol/L尿素溶解包涵体后经Ni-BPA亲和层析法纯化，获得了纯度较高的目的蛋白，其纯度可达80%。每孔以100ng纯化的目的蛋白包被酶标板进行ELISA检测，结果显示，纯化蛋白与PCV阳性血清发生特异性反应。\n 4.表达产物经纯化后，以每只小鼠0.1mg、0.2 mg、0.

关键词： 甜菜   基因工程   育种  

摘要： 基因工程作为1种最有效的现代作物育种方式,已在多种作物中得到广泛应用。甜菜转基因研究起步较晚,但取得的成绩显著。从抗病、抗虫、抗除草剂及品质改良等领域综述了基因工程在甜菜育种方面的研究成果及进展。

关键词： 克伦特罗   单链抗体   工程菌   培养条件  

摘要： 重组大肠杆菌BL21携带抗克伦特罗单链抗体(scFv)基因,研究了不同培养基、诱导时期、诱导时间、初始pH以及装液量对重组抗体表达量的影响,并对重组质粒稳定性进行研究。结果表明,在初始pH为7.2、装液量为25mL/250mL的LB培养基中,30℃培养菌体生长至A600nm为0.8时,42℃诱导表达6h,scFv表达量可达33.7%。工程菌在无选择压力条件下连续传代120代,保持稳定,100%的菌株携带重组质粒且经诱导后均有重组抗体的表达。