关键词： 动物基因工程疫苗   基因工程技术   疫苗开发   原理   “十一五”   基金资助  

摘要： 本专著受华夏英才基金资助出版，为“十一五”国家重点图书。

关键词： 疫苗佐剂   中药   抗原特异性   基因工程疫苗   免疫原性   免疫应答   合成肽疫苗   动物疾病  

摘要： 疫苗的应用对于控制人类和动物疾病的流行起到了非常重要的作用,目前正在开发的新型疫苗如合成肽疫苗、基因工程疫苗、核酸疫苗等具有良好的抗原特异性和低毒性,但免疫原性较差,诱导机体产生的免疫应答不够强,有必要配合安全高效的佐剂来增强其免疫原性或增强宿主对抗原的保护性应答.中药是我国的宝贵遗产,与合成药物相比,具有不良反应少、毒副作用小、多效性、无依赖性等特点,并对机体具有显著的免疫调节作用,加之在使用安全性方面的优势,已成为疫苗佐剂研究的一个热点.本文就对目前中药作为疫苗佐剂的研究进展做一综述.

关键词： 玉米   基因工程   遗传育种  

摘要： 自从1989年首次获得可育的玉米转化体以来,转基因玉米研究与产业化取得了飞速发展。综述了基因工程在玉米遗传育种的研究进展,介绍了转基因的应用领域及常用的转基因技术,应用转基因技术培育了一批抗除草剂、抗虫、抗病、抗逆、优质的转基因材料,对其应用前景进行了展望。

关键词： 基因工程疫苗   母猪群   萎缩性鼻炎   多杀性巴氏杆菌   哥本哈根   保护作用   抗体滴度   抗体反应  

摘要： 猪萎缩性鼻炎疫苗是预防和控制猪萎缩性鼻炎的重要工具。由于毒素在猪萎缩性鼻炎致病和免疫中的重要作用,因此,针对毒素的新型疫苗也成为各国学者研究的热点,随着分子生物学和生物工程技术的发展,利用基因工程技术研制新型、安全、有效、使用方便的疫苗也得到了极大关注。

关键词： 水产养殖业   免疫学技术   植物疫苗   应用   基因工程疫苗   免疫应答反应   低成本生产   抗原蛋白  

摘要： 植物基因工程疫苗是利用植物系统表达病原菌抗原蛋白的一个或几个亚单位，它没有病原菌完整的侵染能力，却可以使机体对特异的病毒或细菌产生免疫应答反应，这种小规模、低成本生产高附加值的医药产品的技术在未来农业中，特别是水产养殖业中具有广阔的前景，自问世以来近20年间，倍受学术界和商界的青睐，发展十分迅速，

关键词： 动物基因工程疫苗   基因工程技术   疫苗开发   畜牧养殖业   原理   畜禽健康   动物疫病   禽流感  

摘要： 在畜牧养殖业中，禽流感、口蹄疫、蓝耳病、猪瘟等一系列畜禽重大疾病无时不刻威胁着畜禽健康和养殖业安全，而能够帮助人们战胜这些动物疫病的最大功臣就是疫苗。

关键词： 基因工程抗体   diabody   二硫键   药物稳定性  

摘要： 向抗CD3/抗Pgp(P-glycoprotein)微型双功能抗体(Diabody)中引入二硫键,使diabody两条链以共价键交联,增强其稳定性。用重叠PCR(Overlap PCR)和PCR方法,将抗CD3/抗Pgp diabody中抗CD3或抗Pgp轻重链可变区的适当部位定点突变成半胱氨酸,进行原核表达。表达产物经阳离子层析柱和抗Etag亲和层析柱分离纯化,还原性和非还原性SDS-PAGE电泳鉴定。应用间接免疫荧光和竞争性免疫荧光结合流式细胞分析技术(FCM)检测生物学活性。将改造前后的两种抗体分别置37oC含0.2%人血清白蛋白(Human serum albumin,HAS)的PBS中孵育,取多个时间点比较两者与两种把抗原的结合能力。基因重组质粒经测序证实序列正确。向抗Pgp轻重链引入突变的diabody(dsPgp-diabody)在原核表达系统中,SDS-PAGE显示纯化后的蛋白二硫键不能配对。而向抗CD3轻重链引入突变的diabody(dsCD3-diabody)能够在原核表达系统中进行可溶性表达,二硫键能够正确配对。并且与改造前的diabody相比,dsCD3-diabody的抗原结合特异性没有改变,抗原结合和竞争活性均无下降。改造前的diabody在37oCPBS(0.2%HAS)中孵育1h后活性即开始下降,24h后活性完全丧失;而dsCD3-diabody孵育72h后活性并无明显下降。本实验成功构建了dsCD3-diabody,并且能够进行可溶性表达。向diabody抗CD3轻重链区引入的二硫键在宿主菌中可以正确配对,抗原结合活性没有明显下降,而稳定性大大增强。向diabody轻重链区引入二硫键,以增强其稳定性的方法是可行的。

关键词： 鸡球虫病   抗药性   酶制剂   基因工程疫苗  

摘要： 到目前为止,鸡球虫病的防治仍以药物控制为主,大量抗球虫药物的长期使用,导致了鸡球虫抗药性的产生,给鸡球虫病的防治带来很大困难。作者根据鸡球虫抗药的特点,认为制定合理用药程序,开发研制新的抗球虫药物,营养调控以及免疫预防是减少球虫抗药性产生和控制鸡球虫病的主要措施。其中研制高效、低毒、广谱、无残留的抗球虫新制剂,采用基因工程疫苗免疫是今后的主攻方向。

关键词： 噬菌体抗体库Fab   TNF-α   制备   鉴定  

摘要： 目的利用基因工程技术制备人源性抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白的可溶性Fab抗体,并鉴定其抗原结合活性及特异性。方法用固相化的TNF-α蛋白从人天然Fab噬菌体抗体库中筛选出表达抗TNF-α蛋白Fab抗体的阳性克隆,经酶切及连接反应构建可溶性表达噬菌粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG高效可溶性表达,SDS-PAGE及Western blot分析鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定其抗原结合活性和特异性。结果成功筛选并表达了人源性抗TNF-α蛋白的Fab抗体,在非还原SDS-PAGE中形成相对分子质量47kD的条带;Westernblot分析证实表达的蛋白即Fab抗体。ELISA筛选出2株抗体(TA-04,TA-13)具有良好的抗原特异性和抗原结合活性,与小牛血清白蛋白无交叉反应。结论成功表达并鉴定了人源性抗TNF-α蛋白的可溶性Fab抗体,构建了一种基因工程抗体的有效制备途径,为基因工程抗体在肿瘤免疫治疗方面的临床应用研究奠定了基础。

关键词： 脾肾坏死病毒   生物信息学   肿大细胞病毒   原核表达   重组质粒   间接免疫   基因工程疫苗  

摘要： 传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)是肿大细胞病毒属中首个全基因组测序的病毒。本研究室通过液质联用质谱(RPLC—MS)鉴定出ISKNV ORF093L编码蛋白(VP093)存在于纯化的病毒粒子中。生物信息学预测VP093含有8个氨基酸大小的富含亮氨酸的核输出信号(NES)。\n 为进一步鉴定ISKNV ORF093L是否为结构基因，并初步确定VP093在病毒粒子以及真核细胞中的定位和作用，我们进行了以下一系列的研究。\n 我们构建了原核表达重组质粒pET32a(+)—ORF093，获得原核表达蛋白后免疫昆明小鼠，得到特异性抗血清M093。\n 实时荧光定量PCR结果显示，在ISKNV感染的MFF-1细胞中，ORF093L在12hpi前的表达量保持在较低水平，12hpi表达量开始上升，在36hpi到达表达高峰，由此判定ISKNV ORF093L为晚期基因，并很可能编码病毒结构蛋白。使用M093与二次纯化病毒ISKNV和SKIV进行免疫印迹显示，M093可以从两种病毒粒子识别出相应分子量的条带，表明VP093存在于ISKNV和SKIV病毒粒子中，证实VP093是结构蛋白。\n ISKNV感染MFF-1的间接免疫荧光实验揭示了VP093位于部分可识别细胞的细胞膜上。结合免疫电镜的结果，我们推测VP093可能定位于病毒囊膜。\n 我们构建了真核表达重组质粒pEGFP—N3-ORF093，转染BHK细胞后观察发现VP093-EGFP在细胞质内呈点状散在分布，推测VP093的NES序列能够将融合了EGFP(26.9kD)的重组蛋白定位在细胞质中。上述推测以及VP093如何由细胞质最终转移到病毒囊膜上，还有赖于未来进一步研究鉴定。\n 原核表达制备的VP093基因工程疫苗对感染ISKNV鳜的保护效果分析显示，VP093基因工程疫苗对鳜感染ISKNV基本没有保护作用。\n 本研究室分析并鉴定了结构蛋白ISKNV ORF037L、ORF055L和ORF115R，开展了上述三个结构蛋白和ISKNV MCP的基因工程疫苗，以及ISKNV全细胞灭活苗的对ISKNV和SKIV感染免疫保护试验。笔者参与了此项研究，成功完成了pET32a(+)—ORF006载体的构建以及VP006(Major capsid protein，MCP)的原核表达、纯化和复性工作，并制备了特异性鼠抗M006。此外，为了使VP006、VP037和VP115重组蛋白具有趋于完整的生物学功能，笔者利用杆状病毒表达系统初步表达了上述三个基因的重组蛋白，并进行细胞免疫荧光实验探讨了Sf9细胞表达的重组蛋白在细胞上的定位。