关键词： 基因工程疫苗   伪狂犬病毒   伪狂犬病病毒   绒山羊   动物疫病防控   口蹄疫   牲畜五号病   病毒病   猪蓝耳病   动物检疫   生猪生产   新兽药   病毒株   澳大利亚   大洋洲   人感染高致病性禽流感   科技情报   科学技术情报  

摘要： 日本灾难性的口蹄疫事件给澳大利亚警示澳大利亚牛委员会要求州、联邦政府继续保持动物安全和动物检疫的投资。澳大利亚牛委员会主席格雷格·布朗说,业界愿意作出自己的贡献,但是,保护澳大利亚的畜牧业和食品安全的的利益

关键词： 生物制药技术   自然寿命   高通量筛选技术   基因工程疫苗   橡胶树   “双刃剑”   腹式呼吸   马尔戈   改变世界   天然药物   全球生物   喷鼻剂   医药生物技术   马铃薯甲虫   医药工业  

摘要： 当今世界,真正可以称得上"突飞猛进""日新月异"的恐怕要数科学技术了:且不说众人关注的转基因技术,也不说被炒得沸沸扬扬的人类干细胞移植和"克隆"技术,单是"嫦娥""神

关键词： 香蕉   基因工程   植物表达载体   抗病基因  

摘要： 香蕉（Musa spp.）是多年生常绿大型草本单子叶植物，是世界第四大水果，也是继水稻、小麦和玉米之后的第四大粮食作物，因此，香蕉在热带、亚热带各国经济和社会发展中发挥着重要作用。香蕉栽培中存在不少问题，如缺乏耐寒、抗虫、抗病等优良品种，特别是近年来香蕉枯萎病的毁灭性威胁，严重制约了香蕉产业的发展。由于香蕉基因型复杂（有二倍体AA、BB和AB型、三倍体AAA、AAB、ABB型、四倍体AAAA、AABB型等），且香蕉主栽品种均为三倍体（AAA的香芽蕉或ABB的粉蕉），具有不育、不结籽的特性，难以通过有性杂交进行改良，现代生物技术的飞速发展为香蕉育种提供了新途径，可以获得常规育种难以得到的新类型，从而创造出新种质。众所周知，高效的受体再生体系则是遗传转化成功的关键。目前香蕉转基因研究中所采用的外植体材料主要是胚性悬浮细胞，因此建立起有效的香蕉胚性细胞悬浮系(embryogenic cell suspension，ECS)及体胚发生途径植株再生技术是香蕉遗传转化成功的关键。　　 本研究以香蕉品种‘粤优抗1号’为试材，探讨了影响建立香蕉胚性细胞悬浮系的因素，并以香蕉品种‘粤优抗1号’胚性细胞悬浮系为受体，分别用由南瓜韧皮部特异启动子NPP2驱动GUS报告基因的植物表达载体pBdENP、由花椰菜花叶病毒CaMV35S组成型启动子驱动CAPD目的基因的植物表达载体pHZ05和由CaMV35S组成型启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体pBI121进行转基因研究，获得了转pBdENP植物表达载体的抗性植株55株，转pHZ05植物表达载体的抗性植株2株，转pBI121植物表达载体的抗性植株34株。PCR检测初步表明外源基因已经整合到香蕉基因组中。同时，也开展了玉米Ubiquitin启动子的克隆和抗病基因AFP植物表达载体的构建，主要研究结果如下：　　 (1)初步建立了香蕉胚性细胞悬浮系。以‘粤优抗1号’未成熟雄花为外植体，在胚性愈伤组织诱导培养基上培养12个月诱导出了胚性愈伤组织，然后在悬浮系继代培养基(ZZL)上经过5次悬浮培养尝试最终成功建立了香蕉胚性细胞悬浮系。胚性愈伤组织的诱导率非常低（本研究的胚性愈伤组织诱导率为0.33％），且诱导过程中会产生多种类型的非胚性愈伤组织。香蕉ECS的建立需选取黄白色、松脆、透明的胚性愈伤组织用小型培养容器（50ml三角瓶）进行悬浮培养（小心去除半透明原胚），并及时去除褐色成分和富含淀粉粒的细胞（团），初期三天继代一次，待ECS稳定后换用较大型培养容器（150ml三角瓶）培养，一周继代一次。　　 (2)利用扫描电镜和透射电镜观对初步建成的香蕉ECS进行超微结构观察。发现香蕉ECS表面呈褶皱状，细胞（团）之间结合紧密;具有完整的细胞结构，细胞中央有一近圆形的细胞核、核仁明显;细胞质中含有大量大小不一的液泡，细胞质浓，代谢旺盛;有光滑的非胚性细胞存在。　　 (3)初步建立了香蕉遗传转化体系。分别利用韧皮部特异启动子NPP2驱动的GUS报告基因、CaMV35SP驱动的密码子优化的抗菌肽D(CAPD)基因和花椰菜花叶病毒35S组成型启动子（CaMV35S）驱动的GUS报告基因的植物表达载体对‘粤优抗1号’香蕉胚性细胞悬浮系进行遗传转化。结果表明，在ZZSS2和RD1阶段进行光培养有利于后期胚状体的产生，而暗培养有利于后期体胚的萌发;TDZ的最佳浓度为3mg·L-1;卡那霉素的较适合筛选压定为20mg·L-1。　　 (4)获得了香蕉抗性植株。经过卡那霉素的筛选，获得转pBdENP植物表达载体的抗性植株55株，转pHZ05植物表达载体的抗性植株2株和转pBI121植物表达载体的抗性植株34株。随机选取27株转pBdENP植物表达载体的抗性植株和1株转pBI121植物表达载体的抗性植株，用NPT II引物和chvA引物进行PCR检测，结果28株抗性植株均扩增出560bp的特异条带，而chvA引物的PCR检测出3号样品（转pBdENP植物表达载体的抗性植株）为农杆菌污染造成的假阳性;对2株转pHZ05植物表达载体的抗性植株进行CAPD引物的PCR检测，实验结果初步表明CAPD基因已整合到香蕉基因组中。　　 (5)克隆了玉米多聚泛素蛋白基因启动子。该序列全长为1989bp，包含核心启动子成分（如TATA框，核心序列为TATAAA）、上游启动子成分(CAAT框、核心序列为CAAT;GC框，核心序列为GGGCGG)以及其他调控元件。其中，TATA盒的主要作用是使转录精确地起始。CAAT框和GC框则主要是控制转录起始的频率。　　 (6)构建了3个植物表达载体。分别是以NPTⅡ为选择标记基因、由35S驱动AFP抗病目的基因植物表达载体pBI121-AFP;以HYG选择标记基因、由35S驱动AFP抗病目的基因植物表达

关键词： 产毒素多杀性巴氏杆菌   沙门氏菌   重组菌株   生物学特性  

摘要： 猪进行性萎缩性鼻炎(Swine progressive atrophic rhinitis, PAR),主要是由D型产毒素多杀性巴氏杆菌(toxigenic Pasteurella multocida, T+Pm)引起的猪的呼吸道疾病,该病给养猪业造成较大经济损失。 疫苗免疫是预防该病的主要手段,随着分子生物学的发展,新型的基因工程疫苗被广泛用于动物传染病的预防。本研究以徐引弟博士构建的沙门氏菌缺失株C501为载体,将产毒素多杀性巴氏杆菌toxA基因C端免疫原性片段通过构建重组质粒电转化C501,获得产毒素多杀性巴氏杆菌重组沙门氏菌基因工程疫苗菌株。主要研究内容如下： 1.重组菌株的构建及其生物学特性的研究 参照产毒素多杀性巴氏杆菌toxA基因序列(NO. AY864768),设计引物扩增toxA基因C端,构建无抗性原核表达质粒pYA-toxAc,并电转沙门氏菌C501,获得重组菌株C501 (pYA-toxAc)。该重组菌株可以稳定遗传表达外源基因片段,且表达产物不影响沙门氏菌自身生长特性、表型及生化特性;重组菌株毒力较亲本株C500下降约2倍左右。 2.重组菌株对小鼠的免疫保护效力研究 将重组菌株C501 (pYA-toxAc)分别通过口服和皮下注射两种方式免疫小鼠,间隔14天加强免疫一次,第28天分别用猪霍乱沙门氏菌C78-1株10×LD50口服攻毒和产毒素多杀性巴氏杆菌HN-13株5×LD50腹腔攻毒。试验结果表明,皮下免疫重组菌可以刺激小鼠产生针对沙门氏菌和toxAc较高的IgG抗体和较低的IgA抗体;口服免疫获得较高的IgA抗体,而IgG抗体较低。无论口服或皮下免疫小鼠均可以对猪霍乱沙门氏菌的攻击提供100%保护,皮下方式免疫小鼠对产毒巴氏杆菌的攻击为80%的保护,口服组为60%的保护,对照组80%死亡。 3.重组菌株对猪的免疫试验 选取10头产毒素多杀性巴氏杆菌与沙门氏菌血清学和病原学均为阴性的断奶仔猪，随机分为2组,每组5头。以3×109CFU/头的剂量颈部肌肉注射免疫,间隔14天进行第二次免疫,对照组采用20%氢氧化铝作为空白对照。首免、二免后14天,分别采血,检测血清中沙门氏菌和产生针对toxAc的IgG抗体水平。试验结果表明免疫猪可以产生针对沙门氏菌和toxAc外源抗原的IgG抗体,OD(630)值分别为2.135和1.351。

关键词： 力达霉素   明胶酶   抗体   活体成像   正交设计   靶向治疗  

摘要： 抗体-药物偶联物的开发是当前抗肿瘤药物研发的一个重要发展方向,然其成功的发展在某种程度上有赖于抗体部分的靶向运输能力和被输送药物的生物学活性。明胶酶在多种肿瘤中高表达,且在肿瘤的侵袭、转移以及血管生成中发挥着重要的作用,来源于小鼠的单克隆抗体3G11具有特异性结合明胶酶的特性。力达霉素是一个高效的抗肿瘤大分子抗生素,以单克隆抗体3G11为基础,结合力达霉素的特性,我们构建了多种类型的基因工程融合蛋白。为了进一步增强抗体片段对明胶酶高表达肿瘤细胞的靶向能力和提高抗肿瘤效果,我们作了以下的研究和探索。 一、抗明胶酶的双单链抗体和力达霉素的融合蛋白dFv-LDP制备及其体内的靶向能力研究 随着抗体工程的研究进展,目前认为双价的单链抗体片段具有最佳的肿瘤靶向能力。为了进一步提高前期所构建的抗明胶酶单链抗体和力达霉素融合蛋白Fv-LDP-AE的抗肿瘤效果,我们构建了含有2个scFv和力达霉素辅基蛋白的融合蛋白,将其命名为dFv-LDP。表达该重组蛋白的质粒pET30a(+)/dFv-LDP经过酶切鉴定和序列测定后,转化于大肠杆菌BL21 (DE3)和Rosetta(DE3)pLysS中,进行诱导表达,结果发现融合蛋白dFv-LDP更易于在Rosetta(DE3)pLysS中表达,产物主要以包涵体的形式存在,目的蛋白经纯化、复性后,每升发酵液可以获得50 mg纯度达到95%以上有活性的dFv-LDP融合蛋白。抗原ELISA结果表明,融合蛋白dFv-LDP与抗原明胶酶的亲和常数为0.043μM,比单链的Fv-LDP融合蛋白的亲和力提高了4倍左右。融合蛋白dFv-LDP亦能与肿瘤细胞特异性结合,对Bel-7402、PG-BE1、HT-1080、HepG2、MCF-7等肿瘤细胞均呈阳性免疫反应。流式细胞术分析表明融合蛋白dFv-LDP在一定程度上能被细胞内吞,相对单链的Fv-LDP来说比率有所增加,但总体不太明显。体内的靶向实验中,融合蛋白dFv-LDP具有比单链的Fv-LDP更优越的肿瘤靶向能力,在人肝癌Bel-7402、高转移肺癌PG-BE1和结肠癌HCT-116裸鼠异位移植瘤中展现了优良的靶向能力,能够很快在肿瘤部位富集。因此,本实验构建的双单链抗体融合蛋白dFv-LDP具有良好的肿瘤靶向能力,有望在同等条件下携带更多的力达霉素分子到达肿瘤部位,从而提高抗肿瘤效果并降低对非靶器官的损伤。 二、融合蛋白dFv-LDP与发色团AE的组装条件的优化 力达霉素是一个大分子抗肿瘤抗生素,可以拆分为一个辅基蛋白和一个高活性的发色团。该发色团可以和基因工程表达的含有力达霉素辅基蛋白结构域的重组融合蛋白组装,构建具有高度活性的强化融合蛋白。然而这种组装效率受一些因素的影响,本文利用融合蛋白dFv-LDP和发色团AE组装作为一个研究对象,拟对这些影响因素进行分析和研究。利用高效液相色谱分析不同摩尔浓度的力达霉素并建立其发色团和辅基蛋白摩尔浓度的标准曲线;在此基础上利用L9(34)正交设计分析组装时的温度、时间、pH以及发色团和基因工程融合蛋白dFv-LDP的摩尔比率4个因素对组装效率的影响,挑选最优组装效率的组合。结果建立了力达霉素发色团和辅基蛋白摩尔浓度的标准曲线,所选择的4个因素对组装效率都有明显的的影响(P<0.01),其影响程度先后顺序是温度>时间>pH>发色团和融合蛋白dFv-LDP浓度的比率;最优的组装条件为温度10℃,时间12 h,pH7.0和发色团与蛋白摩尔比率为5：1。经过优化后,融合蛋白dFv-LDP与发色团的组装效率提高了20%左右。该优化组装条件对其他基因工程表达的含有力达霉素辅基蛋白的融合蛋白与发色团组装有一定的参考价值。 三、强化融合蛋白dFv-LDP-AE的体内抗肿瘤作用研究 小动物活体成像表明融合蛋白dFv-LDP具有很好的肿瘤靶向效果,当其与发色团AE组装后,我们进一步评价其体内的抗肿瘤效果。MTT法表明强化融合蛋白dFv-LDP-AE具有不亚于力达霉素的对多种肿瘤细胞强烈的杀伤能力,IC50值介于1×10-10～10-12 M之间。小鼠肝癌H22抑瘤实验表明,在等摩尔的情况下,强化融合蛋白dFv-LDP-AE比单价的Fv-LDP-AE有更高的抗肿瘤能力(89.5% vs84.2%),两者都较单独的力达霉素(73.6%)有明显的提高(P<0.05),说明抗体携带力达霉素的靶向治疗能够提高力达霉素的治疗效果;在肝癌Bel-7402裸鼠移植瘤中,dFv-LDP-AE也展现了更好的抗肿瘤效果,0.4 mg/kg,0.6 mg/kg,0.8 mg/kg三个剂量的dFv-LDP-AE的抑瘤率分别为64.2%、73.1%和87.3%,均强于力达霉素的63.4%抑瘤率。而0.48 mg/kg的Fv-LDP-AE的抑瘤率为73.9%,小于

关键词： 禽流感   疫苗   分子克隆   原核表达   高密度发酵   蛋白质纯化   蛋白质复性   免疫效力   H5N1   高致病力毒株   低致病力毒株   SPF鸡   小白鼠   HI   ELISA  

摘要： 禽流感是一种禽类的烈性传染病，在世界范围内广泛流传，严重威胁着养禽业。尤其是高致病性禽流感的流行，病死率极高。禽流感的传染性极强，并可跨物种进行传播，近年发现，人类也是禽流感病毒宿主之一，自2003年底至2008年6月19日，亚、非、欧三大洲15个国家共报告了383例经实验室检查确诊的人H5N1禽流感病例，241例死亡。禽流感作为一种全新的病种，已成为人类健康和生命的严重威胁，而面对禽流感病毒的侵害，人类自身却毫无免疫防护。2004年初，世界卫生组织已就禽流感的流行向全世界提出警示，许多国家和地区更将禽流感列为头号监控对象。引起禽流感的病原体是禽流感病毒，该病毒具有非常高的变异性，理论上来讲，禽流感病毒的血清亚型可多达256个，并可与其他流感病毒进行重组，进而发生病毒变异和宿主的改变，因此，禽流感病毒复杂多变的基因组常常被许多学者看做是人类流感病毒的最大基因库。 由于禽流感病毒广泛存在于各种禽类和野生鸟类体内，因此禽流感的控制是一项长期艰巨的任务，疫苗的开发和使用是应对这项艰巨任务最实际、最有效和最经济的手段。理想的疫苗应该是在具备良好的安全性的前提下，不仅能够调动机体的体液免疫，产生病毒中和抗体，更能够充分调动机体的细胞免疫来充分发挥病毒清除机制。基于以上理念，本研究以亚洲地区主要流行的H5N1亚型禽流感病毒为研究对象，比对了2003年以来中国及周边国家，尤其是东南亚国家所发表的H5N1亚型禽流感病毒毒株的HA1和NP蛋白序列，筛选出了同源性较高的HA1和NP蛋白序列作为标准参考序列。通过计算机软件对禽流感病毒H5N1亚型的HA1蛋白进行了全面分析，优选了出了主要T细胞表位和B细胞表位，并对NP蛋白进行了全面分析，优选出了主要CTL表位。依据这些优选表位，我们设计了禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗，该疫苗以含有主要保护性B细胞表位和覆盖多种DR类型的MHC II表位的H5N1病毒HA1蛋白做为主体骨架，并在该骨架C端引入了优选出的CTL细胞表位。在对该疫苗基因进行密码子和碱基组成优化后，采用人工合成的方法获得了编码该禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗的基因，并将该基因克隆入大肠杆菌表达载体pRSET B中，在大肠杆菌中得到了良好表达，禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗蛋白表达量占菌体总蛋白30%，表达形式为包涵体。 疫苗的使用是防治禽流感的最有效手段，同时也对疫苗生产过程中的产量和成本控制提出了很高的要求。本研究对禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗工程菌的生长和表达的最理想pH值范围、碳源浓度、培养基配方以及诱导时长等条件进行了探讨并优化，建立了该工程菌的中试发酵工艺，并进行了高密度发酵培养，在保证禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗蛋白30%表达量的前提下，使工程菌密度达到54OD600，禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗理论产量约为3.4g/L。在此基础上，我们又进一步探索出了一条简洁高效的疫苗蛋白纯化和复性工艺，经过简单的包涵体洗涤和Ni+亲和柱层析即可使禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗蛋白纯度达到95.5%，复性后疫苗蛋白原液浓度可达2.4mg/mL。 为评价该禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗的免疫效力，本研究首先将该疫苗作为免疫原进行了小白鼠实验，验证了其在小白鼠体内的免疫应答。然后分别用高致病性禽流感病毒(HPAIV)A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[Gs/GD/1／96(H5N1)毒株和低致病力禽流感病毒（LPAIV) A／Chicken／Huadong／87／20O6(Ck／HD／87／06（H9N2)对免疫后SPF鸡进行攻毒，确定该疫苗对两种不同禽流感病毒亚型的保护效果。两个靶动物试验均用低、中、高三个剂量组对SPF鸡进行免疫，并分别用两种毒株攻毒，其中H5N1亚型的保护试验通过临床反应症状、检测HI抗体水平、ELISA法检测抗体，以及建立RT-PCR方法检测攻毒后各组病毒载量，来说明禽流感H5N1亚型基因工程疫苗的免疫效力;H9N2亚型的保护试验通过检测免疫后HI抗体水平和攻毒后排毒情况来说明其免疫效力。结果表明，禽流感H5N1亚型基因工程疫苗能在小白鼠体内产生良好的免疫应答;不同剂量的免疫组对不同禽流感病毒亚型感染后SPF鸡均达到了不同程度的保护，根据两个病毒亚型试验的比较，说明该疫苗对禽流感病毒H5N1亚型的免疫效力略强于H9N2亚型。其中10μg/只剂量组免疫保护率达到了100%，因此可以说明，该禽流感H5N1亚型基因工程疫苗可以考虑作为防御禽流感疫病的疫苗。 为评价该禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗的抗原特异性和免疫效力，本研究分四个部分去验证。一是建立间接ELISA方法确定该疫苗抗原与禽流感H5（Re‐4株、Re‐5株）标准阳性血清、H9标准阳性血清、H7标准阳性血

关键词： 对硫磷   链霉亲和素   四价抗体   原核表达  

摘要： 本研究通过抗对硫磷单链抗体基因和核心链霉亲和素基因片段的拼接重组,获得抗对硫磷单链抗体-核心链霉亲和素融合基因(scfv-sa),并将该重组基因(scfv-sa)插入到表达载体pET28a(+)中,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达,制备出融合蛋白,并对蛋白的生物学活性进行测定。主要研究内容为: 1.查阅链霉亲和素有关知识,分析其主要的功能性成分,检索编码该部分的基因序列,进行合成,其主要功能蛋白定义为核心链霉亲和素或链霉亲和素核心蛋白。 2.设计引物,扩增出抗对硫磷单链抗体的基因,并且用重叠延伸PCR的方法将其和核心链霉亲和素基因拼接,形成新的重组基因。经过酶切和PCR扩增验证其为预期的目的基因,送由公司测序确认。 3.构建重组基因的原核表达载体,优化原核表达中可溶性蛋白的形成条件,诱导重组基因进行原核表达。并回收可溶性蛋白,用Ni+-NTA纯化,SDS-PAGE检测蛋白分子量大小,Western blot鉴定表达产物为特异性的目的蛋白。结果表明,在大肠杆菌BL21(DE3)中该融合基因能表达出分子量约为46kDa的融合蛋白,形成了四价结构域-四价聚合抗体。 4.用ELISA方法测定该融合抗体生物学活性,ELISA测定结果表明该抗体能与对硫磷特异结合,抗体效价在1:1×106以上,亲和常数为4.25×107 L /mol。制备的抗对硫磷四价聚合抗体能与抗原特异结合,与单克隆抗体相比,抗原结合位点显著增加,ELISA检测灵敏度显著提高。

关键词： 刚地弓形虫   SAG1   MIC3   GRA7   环介导的等温扩增   重组伪狂犬病毒   二价基因工程疫苗  

摘要： 弓形虫病（Toxoplasmosis）是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的、在世界范围内广泛流行的人兽共患寄生虫病。猫是弓形虫的终末宿主,会排出感染性的卵囊,卵囊被认为是弓形虫感染的主要来源之一。人经食物、饮水等途径摄入卵囊而感染。不过,也有越来越多的研究将目光关注于人通过食用含有T. gondii组织包囊的肉及肉制品而感染弓形虫的风险。免疫预防是控制弓形虫病的主要手段,但由于弓形虫复杂的生活史中有着多种多样的因素对弓形虫免疫产生影响,目前弓形虫的免疫预防研究进展不大。在弓形虫病诊断方面,尽管已有很多方法用于弓形虫的检测,但在临床实际应用中缺乏操作简便、快速且不需要昂贵仪器的病原学诊断方法。为此本研究对T. gondii LAMP病原学诊断方法及T. gondii-PRV二价基因工程疫苗进行了研究,主要研究结果如下： 1.弓形虫LAMP检测方法的建立 环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是由日本学者Notomi于2000年发明的一种新型体外恒温核酸扩增方法,主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域,在等温条件下进行高效扩增反应。基因的扩增和产物的检测可一步完成。目前,该技术已被广泛应用于病毒、细菌、动物原虫等疾病的检测。 本研究中,我们针对弓形虫MIC3基因（GeneBank No. EU572718）设计了一组引物,包括有内引物对、外引物对以及促环引物对,通过一系列反应条件的筛选建立了弓形虫LAMP病原诊断方法。敏感性实验结果表明该方法能检测到的极限值为0.4个速殖子,特异性实验结果表明该方法具有特异性强的特点。利用该方法和B1-based Nested-PCR同时检测320份临床采集的猪的血液和组织样品,其阳性检出率分别为11.6%和9.69%,说明LAMP方法更为敏感。另外利用该方法检测猪肉样品中弓形虫的感染,在某屠宰场的45份样品中检测出9份阳性,而在5个市场收集的68份样品检出3份阳性,这些结果说明,猪肉中弓形虫感染的风险是切实存在的。上述结果表明基于弓形虫MIC3基因的LAMP诊断方法具有敏感性高、特异性强的特点,加上该方法具有操作省时、省力,不需要昂贵的仪器,因此具有很好的推广应用前景。 2.表达弓形虫SAG1、MIC3和GRA7基因的重组伪狂犬病病毒的构建 伪狂犬病病毒（pseudorabies virus, PRV）是一种能引起多种动物以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要症状的病毒,由该病毒引起的猪伪狂犬病是目前危害全球养猪业的主要传染病之一。伪狂犬病病毒基因缺失标志疫苗是目前应用最为成功的动物标志疫苗之一,同时也是良好的基因工程重组疫苗载体,迄今为止,已有几十种外源基因在PRV中得到表达。 本研究中,分别将经PCR方法扩增的SAG1、MIC3和GRA7全基因插入到PRV gG-缺失通用转移载体pgG-Uni的多克隆位点中以构建转移质粒pgG-SAG1、pgG-MIC3和pgG-GRA7。然后再将上述质粒与PRV TK-/gG-/EGFP+基因组共转染IBRS-2细胞,病变后经空斑纯化得到重组病毒TK-/gG-/ SAG1（MIC3,GRA7）+。通过Western blotting检测重组病毒中外源基因的表达。结果表明重组病毒构建正确,且外源基因得到了正确表达。重组病毒的TCID50测定结果表明,外源基因的插入不影响重组病毒在IBRS-2细胞上的增殖。重组病毒传代30代后外源基因仍然存在,同时以不同剂量接种实验动物没有出现毒力增强现象,这些结果说明重组病毒具有很好的遗传稳定性和安全性。 3.重组病毒作为疫苗的免疫效果及保护力 利用构建的三株重组病毒单独或联合免疫小鼠,所有接种重组病毒的小鼠都产生对弓形虫裂解抗原（TLA）特异性的抗体,伴随着很强的淋巴细胞增殖反应,并且IFN-γ和IL-2的量明显上升。这些结果说明重组伪狂犬病毒能够诱导产生很强的体液免疫和Th1型的细胞免疫。免疫攻击实验结果表明重组伪狂犬病毒免疫后能使小鼠产生抵抗致死性RH株弓形虫攻击的保护力,明显延长攻虫小鼠的存活时间,并同时诱导产生较高水平PRV中和抗体和抵抗致死性PRV的攻击。而那些用两株和三株rPRV混合免疫的小鼠能够产生更高水平的T. gondii-specific IgG抗体、更强的淋巴细胞增殖反应,并且更有效的抵抗弓形虫的攻击。这些结果说明表达弓形虫保护性抗原的重组伪狂犬病毒具备开发成为一种新型疫苗的潜力,可用来同时预防动物伪狂犬病和弓形虫病。

关键词： 猪传染性胃肠炎   常用疫苗   基因工程疫苗  

摘要： 猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的高度接触性传染病。可侵害各年龄的猪,已成为猪的一种世界性疾病,给养猪业造成巨大经济损失,有效的疫苗接种是目前大多数国家控制本病流行的重要措施。在过去的十年中,人们重点构建基因工程疫苗,但效果不一。灭活苗或弱毒活苗虽然仍显示着良好的优势,但一种安全、有效新型疫苗的研制已成为必然趋势。

关键词： CD20   力达霉素   基因工程抗体   免疫治疗   非霍奇金淋巴瘤   生物毒素  

摘要： 目的构建和表达抗CD20Fab-LDP(力达霉素辅基蛋白)融合蛋白,制备强化融合蛋白抗CD20Fab-LDM(力达霉素),并测定该融合蛋白的生物学活性。方法采用PCR和overlapPCR方法构建抗CD20Fab-LDP融合蛋白,并用双脱氧终止法测定DNA序列;采用亲和层析法纯化该产物,并用Western blot鉴定纯化产物;采用FACS方法鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性;采用冷乙二醇法制备强化融合蛋白抗CD20Fab-LDM;采用MTT法鉴定抗CD20Fab-LDM对CD20+Raji细胞特异性的细胞毒作用。结果DNA序列测定结果表明抗CD20Fab-LDP融合蛋白已构建成功,可溶性表达产物的产量可达4mg.L-1以上,具有与Raji细胞(CD20+)结合的活性,与抗CD20Fab的亲合常数相当,抗CD20Fab-LDM体外能特异性杀伤Raji细胞,IC50值为0.9×10-10mol.L-1。结论成功地构建了抗CD20Fab-LDP融合蛋白,并获得可溶性高效表达,表达产物具有与相应靶抗原结合的活性,并成功制备了抗CD20Fab-LDM强化融合蛋白,体外能特异性杀伤CD20+的Raji细胞。