关键词： 基因工程疫苗   FDMV   重组蛋白   活性检测  

摘要： 目的构建一种能预防AsiaⅠ型口蹄疫病毒(FMDV)的感染表位重组蛋白疫苗,并对其免疫学活性进行研究。方法以AsiaⅠ型FMDV VP1上的B细胞表位和T细胞表位氨基酸序列为抗原位点,设计了包含上述位点的、具有最佳空间构象的重组蛋白,命名为"CZ-1"。通过PCR及基因克隆等方法构建了其表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。通过镍亲和层析和G-25凝胶过滤层析纯化及复性,获得具有免疫学活性的重组蛋白CZ-1。免疫豚鼠获得含针对AsiaⅠ型FMDV中和抗体的血清,通过细胞中和试验及乳鼠中和试验,检测豚鼠血清中抗FMDV的保护性中和抗体滴度。结果该基因工程重组蛋白能够在动物体内诱导产生抗AsiaⅠ型FDMV具有保护性的中和性抗体。结论该基因工程重组蛋白有望开发成预防AsiaⅠ型FDMV感染的新型疫苗。

关键词： 基因工程抗体   微型双功能抗体   CD3   CD19   非霍奇金淋巴瘤   阿糖胞苷   联合治疗  

摘要： 背景与目的B淋巴细胞白血病和恶性淋巴瘤是原发于骨髓造血系统和淋巴结并弥漫全身的恶性肿瘤。传统的放化疗对于早、中期患者疗效满意,但对于晚期患者则疗效欠佳,尤其是病理分级较低的患者比如慢粒或套细胞淋巴瘤。近年来,基于抗体的生物治疗因为其特异靶向性、高亲和性收到了良好效果。微型双功能抗体是继单克隆抗体之后一种新型抗体药物,它是基因工程抗体的一种形式,仅由抗体的VL和VH片段构成,通常是抗XAVL／抗XBVH片段和抗XBVL／抗XAVH片段之间通过分子间力形成二聚体,它具有两个抗原结合位点,可选择性募集效应细胞到靶细胞周围,介导特异性杀伤作用。CD19分子表达于干细胞外的B淋巴细胞发育的各个阶段,B细胞来源的恶性肿瘤均有表达,CD3分子表达于T细胞和NK细胞,本实验基于此构建抗CD3／抗CD19 (Diabody)微型双功能抗体,并且为增强其稳定性进一步改造为二硫键稳定的抗CD3／抗CD 19 (ds-Diabody)微型双功能抗体,表达并纯化后测定它们体内外生物学活性和介导效应细胞杀伤靶细胞的作用。 方法用重叠PCR (Overlap PCR)和PCR方法,构建抗CD3／抗CD19表达载体pAYZCD3CD19,再用PCR法通过引物在抗CD3VL-100位和抗CD3VH-44位引入半胱氨酸突变,构建二硫键稳定的抗CD3／抗CD 19表达载体pAYZdsCD3CD19,转化感受态大肠杆菌16C9进行原核表达。表达产物经6×His-tag亲和层析柱分离纯化,12%SDS-PAGE电泳及westen-blot鉴定。应用间接免疫荧光和竞争性免疫荧光结合流式细胞分析技术(FACS)检测双功能抗体与CD19+Raji细胞和CD3+Jurkat细胞的结合活性,将2种双功能抗体在0.2%的人血清白蛋白中37℃温育不同时间点至72h后,通过间接免疫荧光法FACS检测其结合活性,并比较二者的稳定性。 利用非放射性荧光染料Calcein-AM进行抗体介导的体外特异性杀伤活性检测,Ficoll-Hypaque法分离外周血淋巴细胞(PBL),流式细胞术从中分选T淋巴细胞及CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞作为效应细胞,首先以Raji细胞为靶细胞,按不同效靶比,不同抗体浓度设组,以PBS,抗CD3scFv+抗CD3scFv抗体及抗CD3／抗Pgp双功能抗体为对照,另设CD19-k562细胞为非相关靶细胞组,比较双功能抗体介导特异性体外杀伤活性。取上述杀伤实验效靶比25：1,抗体浓度500ng/ml各组,ELISA法比较激活的T细胞分泌IL-2,IL-4的量,FACS检测T细胞表面标记CD25和CD69激活后的表达变化,实时定量PCR检测各组穿孔素(Perforin)和颗粒酶A (GranzymeA)的释放,FACS检测T细胞凋亡的变化。建立Balb/c裸鼠Raji细胞移植瘤模型,以PBL联合Diabody及ds-Diabody间隔7天尾静脉给药一次,共给药3次,Diabody和ds-Diabody设立3个浓度梯度,并以PBS, PBL,抗CD3scFv+抗CD19scFv抗体及抗CD3／抗PgP抗体为对照,建立k562细胞移植瘤模型作为非相关细胞对照组,观察抗体体内毒性反应,根据肿瘤大小计算抑瘤率,评价疗效。 取不同终浓度的抗代谢类化疗药阿糖胞苷(Ara-C),作用Nalm6细胞72h,FACS测定CD80和CD86表达。取不同终浓度Ara-C作用Nalm6细胞72h,MTT法检测Ara-C对Nalm6的抑制率。确定使Nalm6细胞CD80和CD86表达升高但又不产生抑制效果的Ara-C终浓度。Calcein-AM法测定双功能抗体联合Ara-C或单独介导T细胞的体外杀伤活性,并测定激活的T细胞分泌IL-2, IL-4的量,表面标记CD25和CD69的表达变化,Perforin和GranzymeA的释放,以及T细胞凋亡的变化,具体方法同前。 结果基因重组质粒pAYZCD3CD19和PAYZdsCD3CD19经测序证实序列正确,构建成功。Diabody和ds-Diabody能够在原核表达系统中进行可溶性表达,表达产物经6×His-tag蛋白纯化柱纯化,浓缩后产量均为约5mg/L。12%SDS-PAGE显示Diabody在28kD和26kD各有一条带,western-blot在28kD显示有带,与理论相符。ds-Diabody非还原性SDS-PAGE中,在45kD可见1条带(空间构象使电泳分子量小于实际分子量),western-blot在同一位置显示有带;还原性SDS-PAGE显示45kD消失,在28kD和26kD各有一条带,western-blot在28kD显示有带,这些均与理论相符,45kD为二硫键稳定的二聚体,在还原剂巯基乙醇作用下二硫键断开,形成28kD

关键词： 肺炎链球菌   基因疫苗   减毒沙门菌   肺炎链球菌毒力蛋白   黏膜免疫   基因水平转移  

摘要： 背景与目的: 肺炎链球菌是社区获得性感染最常见的致病菌,全球每年有超过100万儿童死于肺炎链球菌感染性疾病。目前肺炎链球菌对抗生素多重耐药情况日趋严重,使肺炎链球菌感染的治疗面临重大挑战,WHO提出应用疫苗预防肺炎链球菌感染是减少耐药菌传播、缓解抗生素耐药压力,保护高危人群的唯一方法。 国内外越来越多的临床研究发现目前应用的肺炎链球菌23价荚膜多糖疫苗和7价蛋白-多糖结合疫苗存在血清型依赖,成本昂贵,不降低肺炎链球菌鼻咽部携带等不足。研发新一代非血清型依赖的安全、便携、廉价的新型肺炎链球菌疫苗具有巨大的经济效益和深远的社会价值。 肺炎链球菌作为条件致病菌,多种毒力因子独立或协同的参与了其粘附、定植、迁移、侵袭性致病的全过程。基于肺炎链球菌相关毒力蛋白的DNA疫苗具有非血清型依赖、覆盖率广、造价低廉等优势,成为第三代肺炎链球菌疫苗的研究热点。靶抗原的选择,优势载体系统的应用和理想的接种途径是新型肺炎链球菌DNA疫苗研究的关键环节。本课题组前期研究已经证实了肺炎链球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A,PspA)及肺炎链球菌黏附素A(pneumococcal surface adhesion A ,PsaA)的联合是最优势的候选抗原组合形式,但是传统的DNA疫苗免疫途径并不具备激发鼻咽部特异性sIgA抗体保护的能力,而且免疫原性较弱。鉴于鼻咽部定植是肺炎链球菌感染的首要步骤,研究如何优化DNA疫苗的载体系统,选择理想的免疫途径进而增强肺炎链球菌DNA疫苗的免疫效能,尤其是增加其鼻咽部粘膜免疫保护效能具有重要意义。 因此,本课题围绕“肺炎链球菌基因工程疫苗的实验研究”,进行了以下三部分研究工作:(1)第一部分:基于优势靶抗原组合(pspA+psaA基因),构建肺炎链球菌多价DNA疫苗。复制肺炎链球菌鼻咽部携带及腹腔攻击动物模型,裸质粒肌肉注射方式免疫接种,评价其免疫原性及保护效能;(2)第二部分:基于载体-宿主致死平衡原理,设计改造现有减毒沙门菌为宿主菌的沙门菌-原核质粒平衡致死系统,将其携带的原核质粒改造为非抗性基因筛选的真核质粒,构建新型减毒沙门菌为载体的多价肺炎链球菌DNA基因工程疫苗,复制肺炎链球菌鼻咽部携带及腹腔攻击动物模型,经口服途径免疫接种,评价其稳定性、免疫原性及免疫保护效能;(3)第三部分:进一步利用基因组学及分子遗传学技术针对优势靶抗原进行分子进化及比较基因组学的初步研究。旨在为肺炎链球菌新一代基因工程疫苗的研发提供理论基础和实验室依据。方法: 1.分子克隆技术构建PsaA和PspA’(PspA的N端抗原表位所在区域基因片段)的重组真核表达质粒PsaA-pcDNA3.1和PspA’-pcDNA3.1。两种重组质粒DNA疫苗PsaA-pcDNA3.1和PspA’-pcDNA3.1裸质粒单独或联合肌肉注射免疫小鼠,ELISA检测免疫小鼠脾细胞分泌细胞因子及血清中特异性抗体IgG水平;复制小鼠肺炎链球菌D39株鼻咽部携带和腹腔侵袭性感染模型,观察免疫小鼠鼻咽部肺炎链球菌携带改变和腹腔攻击小鼠21天生存情况。 2.新型减毒沙门菌为载体的多价肺炎链球菌DNA疫苗构建及其稳定性、免疫效能检测。 (1)肺炎链球菌DNA疫苗的新型减毒沙门菌载体系统构建:基于pcDNA3.1(+),应用BspHI、XmnⅠ双酶切获得片段SV40ori-Neor-SV40Pa-pUCori和Pcmv-MCS-BGHpA-f1ori,再用SalⅠ酶切SV40ori-Neor-SV40pA-pUCori获得片段pUCori;将酶切获得的pUCori、Pcmv-MCS-BGHpA-f1ori两个片段及变形链球菌asd基因PCR扩增产物进行连接,构建新互补质粒pcDNA3.1000,并最终转化入宿主菌沙门菌χ4550中(pcDNA3.1000x)。 (2)分子克隆技术构建新型减毒沙门菌为载体的肺炎链球菌DNA疫苗pcDNA3.1001x(编码pspA’基因)和pcDNA3.1002x(编码psaA基因),并检测重组质粒在哺乳动物细胞BHK-21中的表达(RT-PCR及Western-blot)及质粒稳定性。新型减毒沙门菌为载体的肺炎链球菌DNA疫苗pcDNA3.1001x和pcDNA3.1002x单独或联合口服免疫小鼠,ELISA检测免疫小鼠脾细胞分泌的细胞因子、血清中特异性抗体IgG及鼻咽部灌洗液中sIgG水平。复制小鼠肺炎链球菌D39株鼻咽部携带模型和腹腔侵袭性感染模型,观察免疫小鼠鼻咽部肺炎链球菌D39菌落计数改变和腹腔攻击小鼠21天生存情况,以评价新型减毒沙门菌为载体的多价肺炎链球菌DNA疫苗的免疫原性及保护作用优势。 3.采用分子遗传学技术进一步分析肺炎链球菌基因工程疫苗优势抗原蛋白的分子进化特点及抗原多样性

关键词： 理科综合   打点计时器   结构简式   化学方程式   滑动变阻器   电阻丝   生长素   气体密度   金属棒   动摩擦因数   螺旋测微器   小麦种子   实验步骤   基因工程疫苗   羊毛脂  

关键词： 人物简介   国家自然科学基金   封面   书籍结构   中国工程院院士   博士生导师   动物病毒   中青年专家   湖北恩施   陈焕春   专家组   基因工程疫苗  

摘要： 陈焕春,男,1953年3月生,湖北恩施人。博士,教授,博士生导师。我国著名动物医学专家、动物病毒学专家。农业部有突出贡献中青年专家,1992年获国务院政府特殊津贴。2003年当选为中国工程院院士。

关键词： 叶绿体基因工程   小麦   人干扰素α-2b基因   烟草   基因转移   细胞器基因组  

摘要： 植物细胞中,除了细胞核中具有遗传物质DNA之外,叶绿体和线粒体也拥有半自主性的能自我复制和遗传的基因组。随着基因组测序技术的发展,越来越多的植物核基因组、叶绿体基因组和线粒体基因组相继完成了测序。研究发现叶绿体基因组和线粒体基因组结构和序列信息在揭示物种起源、进化演变及其不同物种之间的亲缘关系等方面具有重要价值;与此同时,比核转化具有明显优势的叶绿体转化技术在遗传改良、生物制剂的生产等方面显示出巨大潜力,使得叶绿体基因工程成为植物基因工程中发展的新领域。叶绿体基因组结构和序列分析则是叶绿体基因工程的基础,而叶绿体基因工程研究又为细胞器与核基因组之间的基因转移、基因表达的协调作用机制等研究提供实践证明,对研究植物的进化起源有重要的意义。 叶绿体基因工程技术也随着叶绿体测序的完成逐渐成为转基因定点整合、多拷贝高效表达外源基因,培育优良性状农作物品种和作为生物反应器合成目的蛋白的热门选择。本研究以小麦叶绿体基因组中的atpB和rbcL作为同源重组片段,用nptII和gfp分别作为筛选基因和标记基因,构建小麦叶绿体定点整合表达载体,用基因枪轰击法分别转化小麦的幼胚盾片和幼穗段。对T0代再生植株进行分子生物学验证,PCR和Southern blot结果证实标记基因gfp已经成功整合到叶绿体基因组中,并得到了同质化的再生植株。用T1代植株的叶片检测到GFP绿色荧光在叶绿体中表达,证明已经成功建立了小麦叶绿体稳定遗传转化体系。 应用植物细胞作为生物反应器生产药用蛋白或疫苗等也成为现今研究的热点,本研究用农杆菌浸染烟草叶片的方法将人干扰素α-2b基因转入烟草核基因组,在再生烟草植株的叶片蛋白中检测到具有活性的人干扰素α-2b蛋白;构建了烟草叶绿体定点整合载体,为以烟草叶绿体表达人干扰素α-2b蛋白做好了前期准备。 本文全面统计分析研究了已完成测序的藻类,苔藓,蕨类,裸子,被子植物的各物种的核基因组和细胞器基因组的相关信息。分别比较了不同物种的基因组大小,基因编码区和非编码区的大小变化趋势。在174种叶绿体基因组已测序的物种中,有26种核基因组也完成了测序,分别比对各物种的叶绿体基因组和它的核基因组,结果发现随着物种越来越高等,其叶绿体基因在核基因组中的同源性也越来越高,有5种被子植物的同源性高达100%。对15种线粒体基因组和核基因组都已测序的物种进行同样的全序列比对,也发现了随物种进化逐渐增高的趋势,但与叶绿体相比,不是太明显,最高的同源比例仅为82.6%。 本文还对藻类、双子叶植物和单子叶植物的叶绿体的保守基因进行了统计。将单子叶植物保守基因中没有的藻类的保守基因分别与拟南芥和水稻的核基因组比对分析,其中绝大多数遗传系统基因都成功转移,而光合系统和生物合成系统则都丢失了相当一部分基因。还对拟南芥和水稻的叶绿体基因和线粒体基因在核基因组中的同源比例和拷贝数进行了统计。综合分析这些序列的信息后,我们提出以下假设,在植物进化过程中,细胞器基因到核基因组的转移,大致经过了先以拷贝的形式转移到核基因组的非编码区,而后获得表达功能,细胞器中相应基因的消失进而使细胞中的遗传物质逐步转移到核基因组中,最终实现核基因组对植物遗传物质表达的总体调控功能。

关键词： 抑制素   基因疫苗   基因免疫   生殖激素   双羔率   绵羊  

摘要： 本文综合应用生物信息学技术、基因克隆技术、蛋白质分析技术、基因免疫技术、酶免疫测定技术、放射免疫测定技术等,以猪抑制素α亚基(1～32)基因及绵羊补体C3d基因作为选择基因,制备串联抑制素基因工程疫苗,用于基因免疫绵羊,研究串联抑制素基因免疫对母羊生殖及生殖内分泌的影响,探讨其作用机制。通过串联抑制素基因疫苗应用研究,探索串联抑制素基因疫苗免疫方案,达到提高绵羊繁殖力、降低生产成本、推广繁育新技术的目的,并为抑制素基因疫苗的成功研制奠定基础。主要内容如下: 1.猪抑制素α亚基抗原表位的预测 综合应用在线软件PredictProtein、DNAStar软件、Antheprot软件和现代生物信息学技术,分析猪抑制素α亚基的二级结构、抗原表位、亲水性、疏水性、Coil区域、易溶性等理化特性,旨在预测其抗原位点和抗原表位。结果表明:猪抑制素α亚基可能的抗原位点分别是N端1～32、105～130氨基酸区段。由于N端有多个Pro,易构成Coil结构,对抗原表位的形成有一定的影响,所以猪抑制素α亚基的抗原表位可能位于1～32。 2.串联抑制素基因疫苗的制备与鉴定 应用基因克隆技术,以猪抑制素α(1～32)基因及绵羊补体C3d基因为选择基因,并引入狗前胰岛素原信号肽基因,制备串联抑制素重组质粒pcDNA-DPPISS-DINH和pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3。通过酶切鉴定,串联抑制素重组质粒pcDNA-DPPISS-DINH和pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3构建正确,并在BHK-21细胞中获得了分泌型表达,为羊抑制素基因工程疫苗的研制奠定了基础。 3.串联抑制素基因疫苗对绵羊生殖激素的影响 根据基因免疫技术,以成功制备的串联抑制素重组质粒pcDNA-DPPISS-DINH和pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3为免疫原,对60只绵羊进行基因免疫试验,应用酶联免疫法(ELISA)检测抗抑制素抗体、放射免疫法(RIA)测定处理后不同时期血清中激素水平。结果表明:重组质粒pcDNA-DPPISS-DINH和pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3免疫绵羊后,各实验组P/N值均显著高于对照组(P<0.05),且在第3次加强免疫后抗体水平明显上升。首次免疫后,促卵泡素(FSH)平均含量均高于对照组,且在第2次、第3次加强免疫阶段差异显著(P<0.05)。第2次免疫后促黄体素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)含量均高于对照组(P>0.05),第3次加强免疫后E2、P含量均显著高于对照组(P<0.05)。这些结果表明,串联抑制素基因免疫绵羊可促进FSH分泌,进而影响绵羊卵泡发育和诱导绵羊产双羔。 4.串联抑制素基因免疫诱导绵羊孪生的研究 为了研究串联抑制素基因免疫对绵羊孪生的影响,以制备的串联抑制素基因疫苗pcDNA-DPPISS-DINH和pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3为免疫原,对120只绵羊进行免疫试验。结果表明:0.6 mg pcDNA-DPPISS-DINH和0.8 mg pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3免疫绵羊后,双羔率分别为22.2%和30.0%,均与对照组间差异显著(P<0.05),并且分子佐剂sC3d能增加绵羊对串联抑制素基因免疫的反应性。串联抑制素重组质粒成功诱导绵羊孪生的研究,为抑制素基因疫苗的研制提供了理论依据和技术支撑。 5.串联抑制素基因免疫的安全性研究 用高于正常实验组5倍、10倍(重组质粒pcDNA-DPPISS-DINH 1.5 mg、3.0 mg;pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3 2.0 mg、4.0 mg)的免疫剂量对8只绵羊进行基因免疫试验,旨在确定串联抑制素基因免疫绵羊的安全性。结果表明:串联抑制素基因疫苗pcDNA-DPPISS-DINH和pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3免疫绵羊后,实验羊的精神、食欲、运动等均无异常,体温、脉搏、呼吸均无明显变化,没有观察到基因免疫的任何毒副作用与不良反应。由此得出结论,串联抑制素基因疫苗pcDNA-DPPISS-DINH和pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3免疫绵羊诱导其孪生是安全、可靠的。

关键词： TF   凝血因子Ⅲ   嵌合抗体   真核细胞   基因工程抗体  

摘要： 组织因子(tissue factor, TF)是相对分子量为47 kD的跨膜糖蛋白,在调节凝血功能方面有重要的作用,近年来研究发现TF参与动脉粥样硬化的发生发展、血管生成和肿瘤生长等非凝血功能。利用TF单克隆抗体的导向性和特异性,抑制TF的活性,从而抑制肿瘤的生长。由于鼠源性抗体药物对人类具有免疫原性,其广泛的临床应用受到极大限制,而采用基因工程技术对鼠源性抗体进行人源化改造是治疗用抗体的重要手段。因此,本文在自行研制的抗人TF鼠源性单克隆抗体的基础上,利用基因工程抗体技术,成功构建了抗人TF人-鼠嵌合抗体基因的真核共表达质粒。将其转染CHO-K1细胞,筛选获得能分泌表达TF嵌合抗体的CHO稳定细胞株(JJ3),经Protein A亲和层析柱纯化获得高纯度的抗TF嵌合抗体,体外分析该抗体具有抗凝血活性和对K562和HL-60癌细胞生长具有明显的抑制作用,为TF抗体治疗的临床应用奠定基础。 首先利用RNA提取试剂盒,从分泌TF鼠源性抗体的杂交瘤细胞(mTA)中提取总RNA,以鼠源性TF单克隆抗体重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR获得重链和轻链可变区目的基因。将目的基因分别与pCN40表达载体连接,构建成重组质粒pCN40-VL-VH。经AgeⅠ、BstBⅠ和HpaⅠ、EcoRⅠ分别对重组质粒酶切鉴定和琼脂糖凝胶电泳分析,两条目的基因片段大小约为300 bp,与理论值(321 bp、351 bp)相吻合,测序分析其序列与目的基因序列一致,表明已成功构建了抗人TF人-鼠嵌合抗体重组质粒pCN40-VL-VH。 其次,以中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)为宿主细胞,采用中量无内毒素提取质粒试剂盒提取重组质粒pCN40-VL-VH,阳离子脂质体方法转染CHO-K1细胞,经G418硫酸盐(800μg/mL)筛选,并通过有限稀释法克隆化培养,培养上清经间接ELISA检测。对筛选的分泌抗体阳性细胞株培养上清经间接ELISA、Western blot方法分析,获得了转染重组质粒pCN40-VL-VH的CHO细胞株(JJ3),并能稳定地分泌抗人TF人-鼠嵌合抗体。利用rProtein A亲和层析柱纯化该细胞培养上清中的抗体,纯化后的产品经紫外分光光度计定量分析抗体产量约为50 mg/L。经SDS-PAGE分析：纯化嵌合抗体的重链和轻链的分子量分别约为50 kD和26 kD,纯度达到97%以上。 最后,选择K562、HL-60、LOVO、BEL-7402人肿瘤细胞株,采用MTT法,体外研究了该纯化抗体对肿瘤细胞增殖的影响。结果表明：在一定浓度范围内,该抗体能够明显地抑制K562和HL-60细胞的生长,最大抑制率分别为35%和64.9%,且呈剂量效应关系,而对LOVO和BEL-7402细胞生长没有明显的影响。不同浓度的嵌合抗体与27.4μg/mL的TF温育1.5 h,经脂化和凝血酶原时间测定,表明随着嵌合抗体浓度的升高,与对照组相比,正常人血浆的PT显著延长(P<0.01)。 上述结果表明：本研究构建了抗人TF人-鼠嵌合抗体重组质粒pCN40-VL-VH,转染宿主细胞并获得能够稳定表达抗人TF人-鼠嵌合抗体的CHO-K1细胞株(JJ3),经亲和层析获得纯度达97%以上的抗人TF人-鼠嵌合抗体,体外实验表明该抗体具有抗凝活性和有效地抑制K562和HL-60细胞增殖的活性。

关键词： 4-1BBL   共刺激分子   CD20   4-1BBL/CD20融合蛋白   抗CD3/抗CD20双功能抗体   基因工程抗体  

摘要： 目前,①常规的放、化疗方案选择性较差;②肿瘤细胞产生耐药性;③肿瘤发生微小转移是困扰肿瘤的临床治疗三大难题,双功能抗体或融合蛋白因其具有同时与肿瘤相关抗原和免疫效应细胞表面分子标记结合,并能有效地使效应细胞靶向杀灭肿瘤细胞的作用而倍受关注,最有希望成为解决这些问题的一条新途径。 在抗肿瘤免疫反应中,细胞介导的免疫反应起着重要作用。肿瘤免疫治疗的目标就是产生肿瘤特异性的具有长期持续性杀伤活性的激活的CD8+T细胞。初始T细胞的完全激活需要双重信号刺激,即T细胞受体与抗原肽-MHC分子复合物结合的第一信号,又必须有T细胞和抗原提呈细胞表面多种共刺激分子相互作用提供的共刺激信号即第二信号。T细胞激活诱导阶段若缺乏共刺激信号,会引起T细胞通过活化诱导的细胞死亡途径凋亡和克隆特异性无反应性,进而导致抗肿瘤免疫功能低下,而通过低表达共刺激分子降低免疫原性,使得识别它的抗原提呈细胞或淋巴细胞得不到充分的活化信号,是肿瘤细胞免疫逃逸的重要机制之一,临床实践中,这类肿瘤的治疗效果和预后不佳。共刺激信号途径在T细胞的活化和增殖过程中起着重要作用。CD28／B7分子是研究最多的协同刺激分子,认为是初始T细胞激活发生最主要的机制,然而,近来研究的4-1BB／4-1BBL是TNFR／TNF配体家族的成员,它们分别表达在T细胞和抗原提呈细胞上,被确定有助于扩增和多元化T细胞反应,深入增强和延伸T细胞激活的功能,许多动物实验表明干预4-1BB／4-1BBL共刺激途径可调节T细胞和抗原呈递细胞的功能产生抗肿瘤免疫作用,为肿瘤的免疫治疗提供了新的靶点。 CD20主要表达在前B细胞和成熟B细胞及95%以上的NHL淋巴瘤细胞,是可以用来作为肿瘤定向免疫治疗的抗原。为了特异性定向肿瘤细胞和激活肿瘤特异性T细胞,抗肿瘤免疫性能够被诱导和恢复,利用双特异抗体针对肿瘤相关抗原与效应细胞相连,共同作用于肿瘤细胞,实现肿瘤的靶向治疗,我们已成功构建了抗CD3／抗CD20的diabody表达载体和人4-1BBL胞外区基因表达载体pAYZ4-1BBL并进行了体内外生物活性测定,前者有的抑制肿瘤生长的活性而后者则能抑制激活的T细胞凋亡,增强基于PBL的抗肿瘤效应。然而全身性的T细胞激活将导致不需要的临床副作用,应用4-1BBL和CD3单克隆抗体可代替专职抗原提呈细胞的刺激能力,因此基于4-1BBL和CD3双信号所必须严格定位在肿瘤位点,本实验在此基础上构建了人4-1BBL胞外区／抗CD20融合蛋白,获得可溶性表达在2-3mg／l,流式间接免疫荧光实验及玫瑰花环实验均证实了人4-1BBL胞外区／抗CD20融合蛋白具有与CD20+的Raji细胞和4-1BB+的Jurkat细胞结合活性。研究结果表明人4-1BBL胞外区／抗CD20融合蛋白能增强抗CD3／抗CD20 diabody介导PBLs对靶细胞Raji细胞的杀伤作用,其机制是上调抗凋亡相关基因bcl-xL和bfl-1mRNA的表达,促进淋巴细胞增殖,减少细胞死亡,促进IL-2分泌及上调穿孔素和颗粒酶mRNA表达,更有效导致PBLs杀伤肿瘤细胞。应用裸鼠移植瘤模型也表明联合应用人4-1BBL／CD20融合蛋白和抗CD20diabody能明显抑制肿瘤生长,这充分说明基于4-1BBL和CD3双信号作用能更有效地激发PBLs的活性,从而清除肿瘤。 因此,人4-1BBL胞外区／抗CD20融合蛋白作为一种靶向性免疫调节融合蛋白,能够调节PBL的活化程度,进而增强基于PBL的靶向性的抗肿瘤治疗的效果,是一个有望用于B细胞恶性肿瘤临床治疗的特异性融合蛋白。

关键词： 维氏气单胞菌   融合蛋白   基因工程疫苗   缓释微球  

摘要： 气单胞菌属(Aeromonas)是一类严重危害人和水产经济动物的常见致病菌。近几年,高密度人工养鳖业的迅速发展,鳖病也随之大面积暴发,造成了严重的经济损失。2008年,石家庄周边养鳖场暴发群体死亡,继而全省都有发现,给当地养殖户带来巨大损失。 本研究从群体死亡的的中华鳖病灶部位分离得到一株病原菌HBJY01,采用传统鉴定方法并结合分子生物学方法,鉴定该菌的属种。用16S rRNA和gyrB基因通过构建系统进化树和计算序列两两间遗传距离的方法,探讨气单胞菌的进化地位。结果表明传统鉴定方法与分子生物学方法鉴定结果一致,HBJY01的16S rRNA和gyrB基因与维氏气单胞菌的相应基因同源性分别为99%和95%。人工感染实验结果表明HBJY01感染健康中华鳖,死亡率100%,症状与群体死亡的中华鳖大体相同。取其病变肝脏分离到相同病原菌。进而根据GenBank报道的维氏气单胞菌外膜蛋白A基因和嗜水气单胞菌hly基因序列分别设计了两对引物,PCR扩增得到ompA和hly基因。序列分析表明,其片段大小分别为1000bp和1500bp,与参考序列同源性分别为97.45%和96.58%。分别将ompA和hly基因定向克隆于原核表达载体pET-28a,构建了重组质粒pET-ompA和pET-hly,又将hly基因片段构建到ompA基因的下游,得到融合质粒pET-ompA-hly。将三种重组质粒分别转化受体菌BL21,得到的阳性重组菌株BL21(DE3)(pET-ompA)、BL21(DE3)(pET-hly)和BL21(DE3)(pET-ompA-hly),经IPTG诱导后,SDS-PAGE结果表明均有目的蛋白表达;Western blot检测证明表达的目的蛋白为特异性产物。对成功构建的基因工程菌株BL21(DE3)(pET-omp-hly)分别从温度、诱导时间、IPTG浓度方面进行诱导条件的优化,结果表明在37℃,诱导时间6h,IPTG浓度为0.6mmol/L时,蛋白表达量最高,并对基因工程菌株BL21(DE3)(pET-omp-hly)进行动物保护性实验。ELISA和组织切片结果显示基因工程菌株具有较好的免疫保护效果,抗体效价为1:1600。为找到切实可行的免疫途径,本研究采用生物可降解高分子材料PLGA,通过W/O/W法制备口服缓释微球,并对制备工艺进行初步优化,制备得到包封率为68.8%,外观较好的微球。免疫动物实验结果表明保护率较高,达95%,口服免疫后检测抗体水平结果显示,经微球口服免疫的抗体水平较高并且免疫期较长,二免后40天抗体依然呈阳性,为该病的预防奠定了基础。