关键词： Ω序列   四价抗体   原核表达  

摘要： 1、抗对硫磷四价抗体表达载体构建 根据抗对硫磷四价抗体基因序列设计对应对引物,用经优化后的PCR反应条件扩增得到抗对硫磷四价抗体基因后经酶切、PCR扩增初步验证及基因测序确认为目的基因后,将其与达载体pTO-T7连接,转化大肠杆菌rigami 2(DE3),成功构建抗对硫磷四价抗体表达载体。 2、抗对硫磷四价抗体的表达及检测 抗对硫磷四价抗体表达载体经IPTG诱导目的基因表达,表达产物经SDS-PAGE检测蛋白分子量和Western Blot特异性鉴定,结果表明,虽然表达产物中仍有包涵体,但与抗体改造前相比,可溶性蛋白含量已得到显著提高,经浓度测定得知目的蛋白浓度为0.29 mg/ml。 3、抗对硫磷四价抗体的ELISA反应活性检测 改造后的基因工程抗体经纯化后用ELISA方法测定生物学活性,并与实验室保存的单克隆抗体、单链抗体、前期制备的四价抗体相比较,ELISA结果显示该抗体与对硫磷特异结合呈阳性,抗体亲和常数为3.84×10～8 L /mol,半数抑制浓度为0.50μg/ml,表明该抗体亲和力较好,ELISA检测灵敏度得到显著提高。 4.导致包涵体形成的因素很多,目前尚无明确解决的方法,本实验考虑抗体基因序列密码子偏倚性、基因调控序列、诱导条件等方面原因,通过选用合适的表达载体和宿主菌,优化表达条件后提高可溶性蛋白产量,为工程抗体在原核表达系统中实现可溶性表达作出有益探索。

关键词： 自交后代   抗盐性   突变体   细胞工程   基因工程育种   无子西瓜   纯合体   性状分离   植物体细胞杂交   染色体变异   基因突变   生物育种  

摘要： 育种方法有杂交育种、诱变育种、单倍体育种、多倍体育种、基因工程育种、细胞工程育种等。利用生物变异的原理在生产中如何培养新品种是近几年高考的命题热点之一。命题时常以小麦、水稻、玉米等为素材,综合考查各种育种原理、方法、步骤,并常与遗传、变异、进化、基因工程和细胞工程等知识联系起来进行综合考查。为直观详尽地掌握几种育种方式,

关键词： 猪2型圆环病毒   ORF2蛋白   重组杆状病毒   亚单位疫苗  

摘要： 猪2型圆环病毒(Porcine circovirus type 2, PCV2)可单独感染,也可继发感染,近几年在世界各地普遍流行,是对养猪业危害很大的一类疾病。它可引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎和肾病综合病(PDNS)、繁殖障碍、猪呼吸综合征(PRDC)、仔猪先天性震颤、增生性/坏死性肠炎(PNP)、“无名高热症”等。在临床上PCV2普遍存在免疫抑制和免疫激活现象,降低猪的免疫力,使猪生长缓慢,造成其他疾病的大爆发。 目前对于此病没有有效的治疗方法,需用疫苗进行预防。目前,西欧与美国已有商品化疫苗注册上市,主要是灭活疫苗和亚单位疫苗,国内也有灭活疫苗上市。但是由于PCV2在细胞上增殖滴度低、体外培养比较困难、灭活疫苗成本高、注射次数多且易造成机体应激,因此,研究廉价、安全、有效的新型疫苗是目前研究的重点。 本研究探索了新型PCV2疫苗,构建了基于杆状病毒载体的重组毒疫苗与ORF2亚单位疫苗,并通过小鼠实验进一步研究这两种疫苗的免疫原性。具体工作如下： 1、杆状病毒介导的ORF2重组毒疫苗的构建及免疫原性研究： 基因合成pcDNA3.1-iel基因,酶切PFastBac-VSV/G-SV40载体(BamHI)和pcDNA3.1-ie 1 (BglII,BamHI)并连接,载体上的CMV启动子被ie1启动子替代。在iel启动子的多克隆位点下插入增强型绿色荧光蛋白(EGFP),获得重组的杆状病毒AC-V-EGFP。同样,在iel启动子的多克隆位点下插入PCV2 ORF2的整个读码框,构建重组的杆状病毒AC-V-ORF2。将这两种重组杆状病毒体外分别转导哺乳动物细胞和转染Sf9细胞,均检测到目的基因的高效表达。将重组杆状病毒以109pfu/mL100ul的剂量肌肉注射小鼠,首免后三周可检测到ELISA抗体和中和抗体,加强免疫后三周Ac-V-ORF2的ELISA平均抗体滴度达到1：1152,中和抗体滴度达到1：6。因此,Ac-V-ORF2免疫组表现出较好的免疫效果,可以作为PCV2的一种新型的候选疫田。 2、杆状病毒介导的ORF2亚单位疫苗的构建及免疫原性研究 人工合成PCV2 ORF2基因,构建转移载体pFastBacDual-2ORF2。将此载体转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经蓝白斑筛选后获得穿梭质粒Bacmid-2ORF2。将此质粒转染Sf9细胞,获得杆状病毒Ac-2ORF2。将此杆状病毒转染Sf9昆虫细胞后,ORF2基因可在细胞中大量表达。将表达的ORF2蛋白制备成业单位疫苗,分三个剂量：106个cell/mL、5×106个cell/mL和107个cell/mL免疫4～6周龄的BALB/c小鼠。试验结果表明：首免三周后,三个免疫组106个cell/mL、5×106个cell/mL和107个cell/mL小鼠体内已有ORF2 ELISA抗体和中和抗体产生,加强免疫后此三组的抗体水平继续升高,其中5×106个cell/mL最高,ELISA抗体滴度可达到1：2133,中和抗体滴度可达到1：8.33。表明此杆状病毒表达的ORF2蛋白有较好的免疫原性,可以作为PCV2的一种新型的候选业单位疫苗。

关键词： 腺病毒   六邻体蛋白   基因工程疫苗   抗原性分析  

摘要： 目的：腺病毒(adenovirus)是一种无包膜双链DNA病毒，分为7个组共55个血清型。该病毒可感染多种器官，能引起呼吸道疾病、结膜炎、胃肠炎、出血性膀胱炎等。国内外经常有腺病毒感染爆发流行的报道。因此，有效预防、控制及治疗腺病毒感染是亟待解决的问题。曾被使用过的腺病毒减毒疫苗和美国重新研发的减毒活疫苗存在一定危险性和局限性，临床上也尚无药物治疗腺病毒感染。为了防止类似“SARS”公共卫生突发事件的发生，保护人类生命健康，具有多种优点的基因工程疫苗研究得到重视。六邻体蛋白是腺病毒主要的结构蛋白，抗原性较其他结构蛋白强，可以刺激机体产生相应中和抗体。本实验针对腺病毒六邻体抗原性强的保守基底区域进行克隆，为研制腺病毒重组基因工程疫苗奠定基础，具有重要的社会意义及经济效益。<br>　　 方法：应用生物信息学软件，对GenBank中已收录的人3型腺病毒核酸全序列进行比对分析，找出高度保守序列，结合抗原性预测的结果和六邻体蛋白三维空间结构暴露情况，对保守序列进行评价，确定了不同型别腺病毒六邻体所共有的型间共同的特异性抗原表位，选择了六邻体单体蛋白的基因序列进行克隆。以本实验室分离的腺病毒(HAdV3)基因组DNA为模板，PCR扩增目的片段，通过T载体非定向克隆后，与PQE31定向克隆构建原核表达质粒pQE31-hexon。<br>　　 结果：通过生物信息学软件分析后确定人3型腺病毒六邻体中后段具有较好的抗原性和免疫原性，适合研发多效价的腺病毒疫苗，PCR扩增的产物长1155bp，成功构建了重组表达质粒pQE31-hexon。该重组蛋白序列在人3型腺病毒GB株的六邻体氨基酸序列上对应的位点是从540到919。<br>　　 结论：所选择的目的片段具有较高的抗原性；成功构建了重组质粒pQE31-hexon。为进一步表达、纯化该蛋白做准备，为开发研制预防多型别HAdV感染的多价腺病毒基因工程疫苗奠定了基础。

关键词： 猪圆环病毒2型   衣壳蛋白   病毒样颗粒   基因工程疫苗   免疫原性  

摘要： 猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)的感染与断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的发生密切相关。PMWS主要发生在5～18周龄仔猪,患病猪主要临床表现为生长缓慢、体重减轻、呼吸困难、黄疸、腹泻、皮炎、淋巴结肿大和病毒血症,致死率在1%～10%之间。PCV2感染呈世界性分布,已成为危害养猪业健康发展的重要病因之一。国内外相继注册了包括灭活疫苗、嵌合疫苗和亚单位疫苗,在预防PCV2感染中发挥了重要作用。由于抗原制备成本居高不下,导致市场供应的各种疫苗单头份价格在8～48元人民币之间,高昂的疫苗价格严重制约了PCV2疫苗的推广使用。根据PCV2 ORF2基因编码的主要免疫原性蛋白Cap具有在体外自我组装成病毒样颗粒(Virus-like particles, VLPs)的特点,结合SUMO蛋白表达技术,我们首次利用***表达的重组蛋白在体外制备Cap蛋白VLPs,为研制PCV2 VLPs疫苗奠定了基础。 1.将PCV2 ORF2编码完整Cap蛋白基因克隆到带有小泛素样蛋白(SUMO)和多聚组氨酸(6×His)的原核表达载体pSK中,转化克隆菌株JM109感受态细胞,将鉴定为阳性的重组质粒命名为p-SMK-Cap。将p-SMK-Cap转化到表达感受态细胞BL21-Condon plus (DE3)中表达重组蛋白。利用SDS-PAGE电泳可观察到部分重组蛋白以水溶性形式表达,亲和层析纯化目的蛋白以单一特异性条带出现,大小约为43 kDa,免疫印记试验和ELISA试验均证实重组表达的Cap蛋白具有良好的反应原性,命名为His-SUMO-Cap。 2.利用SUMO蛋白酶切除重组蛋白His-SUMO-Cap上的SUMO标签,亲和层析纯化后获得不带有任何氨基酸残基的“天然Cap蛋白(nCap)”,大小为23 kDa。利用透射电镜观察nCap蛋白能够自我组装形成直径17nm大小的VLPs,形态结构类似与亲本PCV2 Cap蛋白,它能够和PCV2血清抗体反应并形成抗原抗体复合物,说明***表达的重组蛋白能够形成正确病毒衣壳结构。 3.将His-SUMO-Cap、nCap和InvCap疫苗分别免疫小鼠。利用间接ELISA可检测到Cap蛋白特异性抗体。检测发现,外周血中的细胞因子IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ表达量有所上调,利用流式细胞仪检测三种Cap抗原免疫小鼠后21天和28天时外周血T淋巴细胞亚群的变化的结果表明,空白组CD3T淋巴细胞总数与抗原免疫组之间统计学差异显著(P<0.05),而不同抗原之间的CD3T淋巴细胞总数、CD3/CD4和CD3/CD8淋巴细胞总数和百分率差异不显著。 4.利用纳米粒度仪检测制备的PCV2 nCap VLPs大小,然后以其作为抗原接种猪,以InvCap疫苗作为免疫对照。PCV2 nCap VLPs抗原免疫猪后产生的抗体消长规律同InvCap疫苗基本一致,免疫后的猪在7天后发生抗体阳转,直到免疫后28天,抗体仍然表现为上升趋势。淋巴细胞增殖试验和流式细胞仪的检测结果表明,不同类型的Cap抗原可以刺激机体的Th1和Th2型细胞免疫反应,IL-4和IL-10和IFN-γ在外周血中的含量明显高于未免疫猪。以上研究结果证明体外制备的PCV2 Cap VLPs疫苗有确实的刺激机体体液免疫和细胞免疫反应的能力。

关键词： 法氏囊病   VP2   多表位肽   杂合肽囊素   β干扰素  

摘要： 传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）是指由传染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）感染禽法氏囊（Bursa of Fabricius,BF）而引起的一种急性、接触性的传染病,其主要以侵害未成年家禽免疫器官（法氏囊）为特征。目前,IBD在世界范围内分布广泛,其给养殖业带来的危害主要体现为IBDV感染鸡群后导致鸡群死亡所带来的直接经济损失和发病鸡群产肉、产蛋等生产性能下降带来的间接经济损失。传统的IBD灭活苗和活疫苗免疫动物后产生的抗体对IBD经典毒株的感染具有很好的预防作用,但是,其在生产或使用过程中有散毒的危险,且不能预防法氏囊病毒超强毒株（Very viru1ent infectious bursa1 disease virus,vvIBDV）和变异毒株对禽类的感染。因此,我们将通过探索以下三种基因工程生物制品的研究,旨在（1）通过给鸡群注射IBD基因工程疫苗使其产生抵抗IBDV的抗体,预防IBD的发生,减少因使用传统的IBD活疫苗导致的疫苗毒的散播;（2）使用具有免疫佐剂效应的基因工程杂合肽囊素,来增加商品化IBD疫苗免疫后鸡群产生抗体的效价和提高鸡群抵御IBD感染的能力;（3）把具有抗病毒活性的重组鸡β干扰素应用于鸡群,借以增强鸡群抵抗IBDV在其体内的繁殖能力。具体内容如下:***基因工程疫苗的研究（1）mVP2疫苗抗原的研究目前关于IBD基因工程疫苗相关的研究比较多,我们设计了IBDVmVP2序列（在鸡vvIBDVVP2基因的5’端和3’端各添加了一个IBDVVP2蛋白的中和性B细胞抗原表位核酸序列）。我们首先选择在巴士德毕赤氏酵母中表达mVP2的核酸序列,实验结果表明酵母系统实现了对mVP2序列的表达和翻译后的糖基化修饰。但是,由于mVP2在酵母中表达水平比较低（约0.06mg/ml）,不符合禽用产品成本低的要求,因此,我们又探索利用大肠杆菌系统来表达mVP2的核酸序列。实验结果表明,其在大肠杆菌的表达量可占总蛋白的8%左右,这比在酵母中的表达水平提高了近20倍。免疫琼扩实验结果表明重组大肠杆菌mVP2蛋白的琼扩效价可以达到1:16,这说明大肠杆菌表达的mVP2具有较好的体外免疫学活性。以mVP2为疫苗抗原制备的基因工程IBD疫苗免疫SPF鸡群,实验结果表明:免疫后鸡群中,有一部分鸡只产生了抗体,用标准鸡法氏囊强毒BC6/85毒株攻毒后,各免疫组鸡群法氏囊细胞坏死的情况和淋巴小结完整性等情况均比阳性对照组鸡群法氏囊的病理分析结果要好。但是,各免疫组与阴性对照组相比,其淋巴小结出现结构不完整,皮质和髓质界限模糊的病理特点,这说明以mVP2为疫苗抗原制备的基因工程IBD疫苗的免疫效果欠佳。我们尝试了使用基因工程杂合肽囊素和基因工程鸡β干扰素等来提高其免疫效果。实验结果显示:虽然产生抗体的鸡群比例有所提高,但其并不能完全保护法氏囊免受IBDV感染。因此,我们需要在以后的研究中进一步提高mVP2的免疫性能。（2）IBDVSOE多表位肽疫苗抗原的研究目前已经有许多研究报道人工合成的多肽疫苗和基因工程表达的肽疫苗可以成功地诱导动物机体产生抗体。本研究通过SOE PCR的方法把4个IBDV的抗原表位串联之后,获得了 IBDVSOE多表位肽的核酸序列,其在大肠杆菌的表达量占总蛋白的18%左右。体外免疫学实验证实:大肠杆菌表达的IBDV SOE多表位肽的琼扩实验效价高达1:32,这说明其具有很高的体外免疫学活性。但动物实验证实其作为疫苗抗原免疫效果比较低,我们试图从改变佐剂的种类和使用免疫增强剂及抗病毒细胞因子等各方面来提高其体内免疫效果,虽然免疫后鸡群的抗体效价从1:2提高至1:4,但攻毒后鸡群法氏囊的病理损伤仍然比较明显。因此,如果要把IBDVSOE制备成为具有理想免疫效果的疫苗,这还需要以后的实验进一步探索。不过,由于IBDV SOE具有很好的体外免疫反应性（比标准IBD琼扩抗原的效价高16倍）,所以,其具有作为鸡法氏囊琼扩检测抗原的潜力。2.免疫增强剂--基因工程杂合肽囊素的研制研究表明天然的囊素三肽（Lys-His-Gly-NH2）和B淋巴四肽（Lys-Asn-Pro-Tyr）刺激物均具有诱导B淋巴细胞的分化,提高机体免疫能力,增强疫苗免疫效果的能力。因此,在前人研究的基础上,本实验合成了 14个囊素三肽的重复序列和2个四肽序列的串联物,形成了杂合肽囊素的核酸序列,并在大肠杆菌系统中进行表达,期望表达的基因工程杂合肽囊素能提高商品化疫苗的免疫效果。实验结果显示:杂合肽囊素的核酸序列在大肠杆菌中的表达量占总蛋白量的20%,之后我们纯化了基因工程杂合肽囊素,并分析了其在体外刺激B淋巴细胞增殖能力。我们发现0.9mg/ml的基因工程杂

关键词： 甲型H1N1流感病毒   重组杆状病毒   疫苗  

摘要： 流感是一种急性的经呼吸道传染的疾病,无论是对动物养殖业还是人类健康均造成严重的危害。2009年4月,墨西哥、美国等国家相继爆发了猪源甲型H1N1流感的疫情,之后迅速蔓延至全球范围内的许多国家和地区。同年6月,世界卫生组织将此次流感流行的预警级别提升至6级。针对如此大的疫情,疫苗接种是预防和控制流感流行最有效的方法,流感病毒灭活疫苗是目前用于预防流感最为广泛的疫苗。尽管灭活疫苗保护率较好,但仍存在着不足,如制备周期较长、需要大量鸡胚,另外少数个体在疫苗接种后会产生不良反应。因此,科研工作者一直在试图研制一种更安全、更高效的流感疫苗。 杆状病毒一直被用于在昆虫细胞中表达外源蛋白。最近的研究报道,表明杆状病毒载体在真核生物启动子的驱动下可以转导不同类型的哺乳动物细胞并表达外源基因,同样基因在不同启动子的控制下,其表达水平也会有很大的差异,且经水泡性口膜炎病毒G蛋白(VSV/G)修饰的杆状病毒,其宿主范围更广,在哺乳动物细胞中的转导效率更高。 鉴于此,本研究对甲型H1N1流感基因工程疫苗进行新的探索,构建了两种启动子驱动甲型H1N1流感免疫原性蛋白表达的重组杆状病毒疫苗,并在小鼠模型上对所构建的疫苗进行免疫效力评价,主要研究内容如下： 1重组杆状病毒BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA的构建 利用对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus, WSSV)的iel启动子和人巨细胞病毒的CMV启动子分别构建了囊膜表面展示有VSV-G蛋白重组杆状病毒,两种启动子驱动的重组杆状病毒都介导甲型H1N1流感新型基因工程疫苗BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA。 2多克隆抗体的制备和重组杆状病毒BV-CMV-HA/M1/NA、BV-ie1-HA/M1/NA的体外表达分析 在HA序列的基础上,设计引物扩增HA的亚基(tHA1),用基因工程方法,构建原核表达质粒pET28a-tHA1,将原核表达质粒pET28a-tHA1转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞,通过IPTG诱导获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白tHA1进行SDS-PAGE电泳,将目的蛋白从蛋白胶上割下,称量,用研钵研磨至糊状后在小鼠背部多点皮下注射,注射剂量为200uL。间隔两周,再次同上方法注射,后每周加强免疫一次,并每周采血检测抗体,至抗体符合要求时,即对小鼠进行眼眶采血大量收集血清,即为鼠源多克隆抗体。 为证实重组杆状病毒在体内能否有效表达外源蛋白,将重组杆状病毒BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA转导BHK-21细胞,IFA试验表明,重组杆状病毒BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA均能够在体外表达外源蛋白。 3重组杆状病毒BV-CMV-HA/Ml/NA和BV-iel-HA/Ml/NA在小鼠体内诱导的免疫原性评价 为探讨重组杆状病毒疫苗的免疫效果,以1×109PFU/只的剂量免疫BLAB/c小鼠,同时用甲型H1N1流感病毒灭活疫苗做对照。结果表明：在细胞免疫方面,两种重组杆状病毒均产生了较好的体液免疫水平,另外灭活疫苗也产生了较好的体液免疫水平。在细胞免疫方面,检测了IFN-y的转录和蛋白表达水平,实验结果表明,重组杆状病毒疫苗诱导了较好的细胞免疫,灭活疫苗诱导的细胞免疫水平相对于重组杆状病毒疫苗组则较低。 4鼠肺适应甲型H1N1流感病毒株的制备和重组杆状病毒BV-CMV-HA/M1/NA、BV-ie1-HA/Ml/NA在小鼠体内诱发的保护性免疫 用乙醚将小鼠麻醉,将甲型H1N1流感病毒(A/wuhan/10/2010)在小鼠肺脏中传代,使之成为能致死小鼠的鼠肺适应甲型H1N1流感病毒株。 攻毒结果进一步表明,重组杆状病毒疫苗和灭活疫苗在小鼠体内诱导的免疫反应均能有效抵抗致死剂量的甲型H1N1流感病毒的攻击。为发展安全有效的甲型H1N1流感疫苗奠定了基础。

关键词： 猪瘟   灭活苗   弱毒苗   基因工程疫苗  

摘要： 猪瘟是猪的一种重要传染病,给世界养猪业造成了巨大的经济损失.猪瘟疫苗的接种是控制猪瘟的重要手段.猪瘟疫苗包括传统疫苗(灭活苗和弱毒苗)及新型基因工程疫苗.基因工程疫苗是目前猪瘟疫苗研究的热点领域,其包括亚单位疫苗、活载体苗、核酸疫苗、病毒标记疫苗等.本文就猪瘟疫苗的发展及应用作了简要介绍.

关键词： 猪流感病毒   猪流行性感冒病毒   包虫病疫苗   动物卫生   兽医研究所   动物疫病防控   实验室能力   中国农业科学院   猪群   种猪   OIE   集中免疫   基因工程疫苗   猪肉品质   口蹄疫   牲畜五号病   病毒病   资讯  

摘要： 农业部:大力加强兽医实验室能力建设近日世界动物卫生组织(OIE)第79届年会在法国巴黎召开。大会通过决议,认定中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所马传染性贫血实验室、中国水产科学研究院黄海水产研究所对虾白斑病实验室和

关键词： 四价抗体   制备   连接肽   寡聚化  

摘要： 近年来基因工程抗体技术发展迅速,将单价小分子抗体改建为双价或多价,成为抗体工程中活跃的领域之一.四价抗体相比于单价或双价抗体在增加抗体亲和力、降低解离率、延长半寿期等药代动力学,受体交联效应等方面具有优势.因此,具有较好的研究和临床应用前景.制备四价抗体的方法主要有化学偶联法和基因工程法,后者主要包括：①通过改变单链抗体VH和VL之间的连接肽的长短对单链抗体之间的聚合作用产生影响;②利用连接肽将scFv进行连接而形成多价抗体分子;③通过寡聚化的结构域,如亮氨酸拉链结构、链亲和素、人p53四聚化功能域、子宫球蛋白等介导多价抗体的形成.