关键词： 轮状病毒   基因工程疫苗   多价抗原表位  

摘要： 从北京腹泻婴儿粪便提取的轮状病毒(rotavirus,RV)(T114株)的RNA中,克隆到轮状病毒结构蛋白基因vp4,vp6和vp7的全长cDNA,对它们编码的蛋白质序列和可能的抗原表位肽进行了预测,选择了RV主要抗原蛋白VP7、VP6和VP4的4个抗原表位肽,通过人工合成DNA的方式将这些抗原表位肽基因串联融合成一个阅读框RME(rotavirus multipleepitopes,RME)并构建原核表达载体.大肠杆菌表达的RME在ELISA反应中可被RV多克隆抗体识别,纯化的RME蛋白注射免疫小鼠可诱导特异性免疫应答,产生高滴度的同源氨基酸序列特异抗体和人RV抗体,其中针对RME的IgG抗体滴度达到l∶40 000,针对单个抗原表位EV7、EV6和EV4的IgG抗体滴度达l∶10 000～l∶20 000,针对RV Wa株的IgG抗体滴度较低为l∶2 500,但能特异地中和该病毒对MAC145细胞的侵染.上述结果为新型RV基因工程疫苗的研发提供了论据和基础.

关键词： 猪圆环病毒2型   传统疫苗   基因工程疫苗  

摘要： 猪圆环病毒病2型是主要侵害哺乳仔猪、育肥猪及怀孕母猪的免疫抑制性疾病。该病毒可诱发多种病毒、细菌的混合感染和继发感染,给养猪业造成巨大的经济损失,对此病的研究特别是对其疫苗的研究正日益受到关注。到目前为止,部分疫苗已在临床试验中取得成功,有的已投入应用,其他候选疫苗也正在积极研究中。文章就近年来国内外各类猪圆环病毒疫苗2型的的应用与研究现状作一综述。

关键词： 抗对硫磷基因工程   Ω序列   四价抗体   原核表达  

摘要： 1、抗对硫磷四价抗体表达载体构建\n 根据抗对硫磷四价抗体基因序列设计对应对引物,用经优化后的PCR反应条件扩增得到抗对硫磷四价抗体基因后经酶切、PCR扩增初步验证及基因测序确认为目的基因后,将其与达载体pTO-T7连接,转化大肠杆菌rigami2(DE3),成功构建抗对硫磷四价抗体表达载体。\n 2、抗对硫磷四价抗体的表达及检测\n 抗对硫磷四价抗体表达载体经IPTG诱导目的基因表达,表达产物经SDS-PAGE检测蛋白分子量和Western Blot特异性鉴定,结果表明,虽然表达产物中仍有包涵体,但与抗体改造前相比,可溶性蛋白含量已得到显著提高,经浓度测定得知目的蛋白浓度为0.29 mg／ml。\n 3、抗对硫磷四价抗体的ELISA反应活性检测\n 改造后的基因工程抗体经纯化后用ELISA方法测定生物学活性,并与实验室保存的单克隆抗体、单链抗体、前期制备的四价抗体相比较,ELISA结果显示该抗体与对硫磷特异结合呈阳性,抗体亲和常数为3.84×108 L／mol,半数抑制浓度为0.50μg／ml,表明该抗体亲和力较好,ELISA检测灵敏度得到显著提高。\n 4.导致包涵体形成的因素很多,目前尚无明确解决的方法,本实验考虑抗体基因序列密码子偏倚性、基因调控序列、诱导条件等方面原因,通过选用合适的表达载体和宿主菌,优化表达条件后提高可溶性蛋白产量,为工程抗体在原核表达系统中实现可溶性表达作出有益探索。

关键词： 猪圆环病毒2型   分离鉴定   基因工程疫苗   免疫保护   荧光定量PCR检测  

摘要： 腺病毒载体是目前应用比较广泛的载体,由于其宿主范围广、感染性强、安全性高、外源病毒能游离表达等特点,被广泛用于制药、基因工程疫苗、基因治疗以及肿瘤治疗等领域。本实验室刘根梅等将PCV2 ORF2基因和猪IFN-γ基因经15个氨基酸的连接序列(Gly4Ser)3接头连接后转移至腺病毒骨架载体pAdEasy-1,构建出了重组腺病毒rAd-ORF2-γ-IFN(简称tAd-OI),免疫小鼠后产牛了较高水平的抗体。\n 鉴于此,本研究对重组腺病毒rAd-OI的免疫效力进行了探讨。通过攻毒试验检测rAd-OI的保护效力,为rAd-OI重组腺病毒疫苗的研发提供了理论基础。主要研究内容如下:\n 1.猪圆环病毒2型福建株的分离鉴定及全基因组序列分析采集临床表现为PMWS仔猪的腹股沟淋巴结、肺脏、脾脏等组织,充分研磨后反复冻融3次离心收集上清液进行PCR检测。经PCR检测为阳性的病料上清过滤后接种PK-15细胞连续传代,每代次均检测PCV2的扩增情况,并通过间接免疫荧光方法检测病毒的扩增情况。扩增得到的PCV2病毒液用间接免疫荧光方法测定其TCID50,结果为10-4.622/0.1mL,由此分离出了一株PCV2毒株,命名为PCV2(FJ)。设计两对特异性引物,ORF2-P1和ORF2-P2用以扩增PCV2 ORF2基因702bp,PCV2-P1和PCV2-P2用以扩增PCV2全长基因1767bp,PCR扩增产物经纯化回收后连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性菌落在LB培养基(Amp+)培养过夜,碱裂解法抽提质粒。分别进行菌液和质粒的PCR检测和质粒的双酶切鉴定,将检测阳性的菌液送上海生工生物工程有限公司测序鉴定。PCR检测结果表明PCV2全基因组均得以扩增,测序结果表明PCV2(FJ)与GenBank上PCV2FJGT0602株(GenBank:G12247991.1)同源性最高,达99.1%,在进化树上亲缘关系最近。\n 2.猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立和临床应用以分离出的PCV2(FJ)ORF2为目的基因,设计合成了特异性的引物和探针。PCR扩增得到目的基因,经纯化回收克隆到pMD18-T。载体,转化DH5a感受态细胞,挑取阳性菌落在LB培养基(Amp+)培养过夜,碱裂解法抽提质粒后经PCR鉴定、质粒双酶切鉴定和测序鉴定为阳性,即得到标准阳性质粒。标准阳性质粒用紫外分光光度计测定浓度并换算为拷贝数。通过对荧光定量PCR引物和探针浓度的优化、反应条件的优化,建立了PCV2实时TaqMan荧光定量PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异性强,对猪伪狂犬病毒(PRV),猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),猪瘟病毒(CSFV)等猪常见病原的检测结果均为阴性。与普通PCR方法相比,其敏感性高出1000倍,可达102拷贝/μL。对临床样品的检测表明,该方法可有效检测出淋巴结、肺脏、脾等组织中的PCV2病毒。\n 3.表达PCV2 ORF2和猪IFN-γ基因重组腺病毒的免疫保护作用以构建的重组腺病毒rAd-OI为免疫原免疫30日龄、母源抗体为阴性的三元杂商品仔猪。25头猪随机分为5组,每组5头。A组肌注免疫tAd-OI106.3TCID50/头,B组肌注免疫rAd-OI107.3 TCID50/头,C组肌注免疫rAd-OI108.3TCID50/头,D组肌注免疫rAd-OI109.3TCID50/头,E组不作免疫,留作攻毒对照。一免后21天进行二免,二免后21天进行第三次免疫,免疫后每周采血检测抗体水平。免疫后56天(即第二次免疫后14天)所有猪攻毒PCV2(FJ),剂量为5×104.622TCID50/头。攻毒前后每周采血检测抗体水平及病毒血症情况,观察猪只的反应情况。攻毒21天后剖杀所有猪,检测组织中的病毒含量。结果显示C组的抗体水平一直显著高于其他各组,攻毒后的病毒血症也低于其他各组。结合抗体水平、免疫和攻毒后的临床症状以及病毒血症水平得出,C组的免疫剂量较为理想。\n 购买25头PCV2母源抗体为阴性的三元杂仔猪。试验猪随机分为5组,每组5头。A组肌注免疫rAd-OI108.3TCID50/头,B组肌注免疫重组腺病毒rAd-ORF2(简称rAd-O)108.3TCID50/头,C组肌注免疫某公司生产的猪圆环病毒灭活疫苗(圆健)1mL/头,D组不做免疫,留作攻毒对照,E组不作免疫,也不做攻毒,留作空白对照。一免后21天加强免疫一次,剂量同第一次,一免开始后每周采血检测抗体水平。免疫后42天(即第二次免疫后21天)所有组攻毒PCV2(FJ),剂量为5×104.622TCID50/头。攻毒前后每周采血检测抗体水平及病毒血症情况,观察猪只的临床反应情况。攻毒21

关键词： 口蹄疫病毒   绵羊   包虫病   石河子大学   生产线   转基因   鼻病毒   基因转移   肌肉生长抑制素基因   羔羊   科技前沿   基因克隆   基因工程疫苗   羊包虫   家畜防疫   病牛  

摘要： 英研究称应对口蹄疫或无须大量宰杀牲畜口蹄疫疫情出现后,人们出于预防常宰杀大量牲畜。英国一项新研究说,牲畜从表现出口蹄疫症状到开始传

关键词： 空肠弯曲菌   吉兰-巴雷综合征   真核表达   分子生物学   基因工程疫苗  

摘要： 空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,***)作为人类的食源性病原菌,是引起急性胃肠道感染的主要病原菌之一。同时,空肠弯曲菌还与人类急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病,即吉兰-巴雷综合征(Guillain Barrésyndrome,GBS)的发生密切相关,是导致人类发生急性迟缓性瘫痪的重要病因。近年,分子生物学技术以及基因工程技术得到了长足的发展,使得人们对空肠弯曲菌在分子生物学方面的机制有了深入的研究,特别是2000年公布了*** NCTC11168 (penner O:2血清型)的全基因组序列以来,使得研究***在分子水平的致病机制方面有了新的前景。空肠弯曲菌的致病机制主要包括侵袭、粘附、定植、产毒素,以及分子模拟等方面。已有研究表明,多种毒力因子共同参与空肠弯曲菌的致病过程。 目的:本研究从基因水平出发,应用本地区已经证实的具有致吉兰-巴雷综合症特性的空肠弯曲菌血清型penner O:19 lulei菌株,选择该菌株中具有侵袭、粘附、定植及产毒素等特性的14个致病相关基因进行TA克隆,经测序后,与Genebank中*** NCTC11168中的相应基因进行比对分析,观察相似性。再选择14个基因中,保守性、免疫原性相对较强的4个基因进行克隆,并插入真核表达载体pEF neo-myc,获得真核表达,为空肠弯曲菌基因工程疫苗的研制打下基础。 方法:扩增目的基因以*** penner O:19 lulei菌株为模板,用PCR的方法分别扩增grpE、dnaK、cheW、cheY、cheV、flaA、cdtA、cdtB、cdtC、peb2、pebC、ciaB、dnaJ、cfrA 14个目的基因。 TA克隆将14个目的基因分别连接到pGEM-T Easy载体,完成TA克隆。转化至大肠杆菌感受态Top10或DH5a。经培养后获得质粒,对质粒进行酶切后凝胶电泳检测及测序鉴定。应用DNASTAR软件与*** penner O:19 lulei菌株DNA序列及NCTC11168中的相应基因进行比对分析,得到相似指数。 构建真核表达载体选择14个目的基因中,保守性、免疫原性较强的4个基因cheY、ciaB、dnaJ、cfrA,用Pyrobest PCR的方法扩增4个基因后,应用真核质粒载体pEF neo-myc,以KpnⅠ和EcoRⅤ,或KpnⅠ和SpeⅠ为酶切位点,分别构建真核表达载体。经转化大肠杆菌感受态,得到质粒并测序成功后,转染293T细胞。转染成功后用Western Blotting的方法检测蛋白的表达。 结果:成功扩增并TA克隆出目的基因grpE、dnaK、cheW、cheY、cheV、flaA、cdtA、cdtB、cdtC、peb2、pebC、ciaB、dnaJ,由于基因cfrA片段长度太大,将其分成两段进行扩增并TA克隆。转化大肠杆菌感受态并培养后,所得质粒经凝胶电泳检测,并测序鉴定后,应用DNASTAR软件与*** penner O:19 lulei菌株DNA序列及NCTC11168中的相应基因进行比对分析。所得目的基因与*** penner O:19 lulei菌株DNA序列相同;与*** NCTC11168比对,得出结果:基因dnaK、cheW、cheY、cheV、cdtA、cdtB、cdtC、peb2、pebC、ciaB、dnaJ、cfrA-1的相似指数分别在95.1%-100%,flaA的相似指数为92.6%,grpE的相似指数为89.9%,cfrA-2的相似指数<50%。应用真核质粒载体pEF neo-myc,成功构建了基因cheY、ciaB、dnaJ及cfrA的真核表达载体。用Western Blotting的方法检测到CheY′,CiaB′及DanJ′蛋白的表达,但未检测到CfrA-1′,CfrA-2′蛋白的表达。 结论:成功扩增并TA克隆出与空肠弯曲菌侵袭、粘附、定植及产毒素等特性相关的14个致病相关基因。应用DNASTAR软件与*** penner O:19 lulei菌株DNA序列及NCTC11168中的相应基因进行比对分析,大部分基因相似指数较高,说明基因相对保守。对保守性、免疫原性相对较强的4个基因进行真核表达,获得真核表达载体,为后续空肠弯曲菌基因工程疫苗的研制打下基础。

关键词： 减蛋综合症病毒   基因工程疫苗   分泌表达   枯草芽孢杆菌  

摘要： 采用PCR技术扩增了减蛋综合症病毒纤维蛋白C-末端的编码基因,并将其克隆到表达载体pET-15b上构建了表达载体pET-15b-EDSC。将该重组质粒转化*** BL21(DE3)菌株构建工程菌,SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导了纤维蛋白C-末端在工程菌中表达,并且目的蛋白主要以包涵体的形式存在。离心获得包涵体,洗涤后,用8mol/L尿素对其进行溶解。采用Ni2+-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,将目的蛋白液透析过夜,冷冻干燥。 为提高可溶性重组蛋白的量,将减蛋综合症病毒纤维蛋白C-末端的编码基因克隆到组成型分泌表达载体pUC18ompAcat上构建pUC18ompA-EDSC。将该重组质粒转化*** BL21(DE3)菌株构建工程菌,培养工程菌以表达目的蛋白,SDS-PAGE分析表明,纤维蛋白C-末端在大肠杆菌中成功实现了表达,且部分重组蛋白分泌到了周质空间和胞外的培养基中,Ni2+-NTA树脂分离纯化后,Western blot对其免疫原性的分析表明,重组蛋白可与鸡抗EDSV血清发生特异反应,说明获得的纤维蛋白的C-末端具有明显的抗原性,该研究对于开发预防EDSV的基因工程疫苗的研究具有一定参考作用。 为研究可溶性蛋白产量的提高,本文还对外源基因在枯草芽孢杆菌中的表达做了初步的探讨,将重组质粒pUC18ompA-EDSC转化枯草芽孢杆菌构建工程菌,培养工程菌以表达目的蛋白,SDS-PAGE分析表明,纤维蛋白C-末端在枯草芽孢杆菌中成功的实现了表达,进一步证明了减蛋综合症病毒在其他工程菌中表达。

关键词： EV71病毒   人源基因工程抗体   噬菌体展示技术   昆虫-杆状病毒表达系统  

摘要： 肠道病毒71型（Enterovirus 71, EV71）属于小RNA病毒科肠道病毒A属,主要引起婴幼儿的手足口病,重症者出现病毒性脑炎、脑膜炎、肺水肿、肺出血,个别病例进展快速,迅速导致死亡。EV71病毒从1969年在美国加尼福尼亚最早被发现以来,至今一共引起了10多次的世界范围的爆发和流行,其中又有四次大的流行。从2008年安徽阜阳爆发EV71以来,卫生部发布《手足口病预防控制指南》并将手足口病纳入丙类传染病来管理。在丙类传染病中手足口病发病数位于第三,而死亡数为第一位。对EV71的感染临床上主要采用广谱抗病毒药物以及对症治疗,但目前没有针对EV71特效抗病毒药物,疫苗正处于研制阶段。所以研究EV71作为一种微生物致病原所引发的机体免疫应答,对明确发病机制、制定预防诊治策略具有重要意义。 在EV71抗体的研究方面,目前仅有鼠源的单克隆中和性抗体的报道,而鼠源抗体本身就存在很多缺陷,从而限制了其很多的应用。本文采用了pHAL14系统,构建了人源抗EV71病毒sc-Fv单链抗体基困库,并利用原核表达纯化的VP1蛋白筛选获得了1株抗EV71病毒特异性人源sc-Fv单克隆抗体,并将其分别构建表达成为单链-Fc和IgG形式的全抗体,为进一步研究病毒免疫和抗体结合表位奠定了基础。本研究以噬菌体表面展示技术为平台,筛选人源抗EV71病毒抗体,实验有以下两部分： 一,人源抗EV71病毒scFV（?）笨菌体抗体库的构建与筛选 采集9位EV71引起的手足口病患儿恢复期外周全血,分离淋巴细胞,然后提取总RNA并反转录成cDNA,接着用特异性的PCR引物经过两轮扩增特异性轻链和重链可变区基因,在对PCR产物鉴定和纯化后,用轻链基因与噬菌粒pHAL14构建了轻链库,随后将重链基因克隆入轻链库中构建scFv噬菌体抗体库。最后使用辅助噬菌体对scFv噬菌体抗体库进行包装,检测库容量,结果表明我们所构建scFV（?）噬菌体抗体库的容量为4.0×108,轻链插入率和重链插入率均为100%,满足筛库的需要。 在成功构建scFv噬菌体抗体库的基础上,用原核表达纯化的VP1蛋白对噬菌体抗体库进行富集筛选,利用ELISA、IFA以及Western Blot对所获人源单克隆抗体的功能特性进行鉴定,并通过序列测定确定所获抗体的基因序列,然后与Genebank报道的抗体序列进行比较,根据抗体基因序列推断出其氨基酸序列,与vbase database中抗体序列信息比较,确定其CDR区。结果获得1株scFv抗体,一系列功能试验均证明该抗体是特异针对EV71 VP1蛋白。 二,人源抗EV71病毒全抗体表达及功能鉴定 在原核表达scFv抗体的基础上,分别利用哺乳动物瞬时表达系统和昆虫杆状病毒载体技术平台实现了全抗体的真核分泌表达。将该EV71抗体的轻链和重链的可变区基因插入杆状病毒载体pCMX2.51和pAc-L-CH3R,然后将构建好的重组质粒转染293T细胞和与杆状病毒重组后转染昆虫细胞,通过IFA检测转染效果,接着对昆虫细胞表达上清进行纯化。利用SDS-PAGE、ELISA、IFA、Western Blot等方法检测纯化的抗EV71病毒IgG全抗的功能活性,结果表明该人源单克隆抗体特异性针对EV71病毒VP1蛋白。在和A型以及两株C4亚型EV71病毒进行中和试验,结果显示该抗体没有中和活性。 综上所述,本研究运用噬菌体抗体库技术,成功构建了人源抗EV71病毒scFv噬菌体抗体库,筛选获得了1株特异性针对EV71病毒VP1蛋白的人源单链抗体。将该抗体构建为IgG全抗体,经IFA、Western Blot检测显示具有功能活性,与A型和C4亚型的病毒中和试验结果显示没有中和活性。

关键词： mChIL18基因   IBDV VP2基因   H5亚型AIV HA1基因   共表达   基因工程疫苗   免疫增强  

摘要： 白细胞介素18(Interleukine-18, IL-18)是一种多效细胞因子,具有强烈的IFN-γ诱生能力,对机体起着重要的免疫调节和保护作用,在抗微生物感染、抗肿瘤免疫中具有应用潜力,因此IL-18可作为免疫佐剂与一些病原微生物的保护性基因共表达,从而加强疫苗的免疫效果或制备基因工程疫苗;由于鸡IL-18(ChIL-18)基因发现得比较晚,而对人和哺乳动物IL-18的研究已有许多报道,且其具有与人和哺乳动物相似的生物学功能,因此ChIL-18在比较免疫学研究和禽病治疗中具有重要意义。pFastBac Dual载体含有PH启动子和p10启动子,可以同时表达两个具有独立活性的外源蛋白。His标签的引入为重组蛋白的纯化提供可能,为获得大量有生物活性的蛋白开辟了新途径。 传染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是由IBD病毒(IBDV)感染雏鸡引起的以淋巴组织,特别是中枢免疫器官-法氏囊为主要特征的高度接触性传染病。该病主要导致机体免疫抑制,使机体的免疫能力降低和疫苗免疫接种失败。虽然灭活疫苗和减毒活疫苗是相当成熟的,但由于IBDV强毒株和抗原变异的出现使其免疫效价降低。VP2是IBDV的主要保护性抗原,已经鉴定的IBDV中和表位主要在VP2上,并且多为构象依赖性,这意味着VP2的立体结构对其中和表位的形成至关重要,与病毒中和抗体的诱导、抗原和毒力的变异以及细胞凋亡的诱导等有关。 禽流感(Avian influenza, AI)是由AI病毒(AIV)感染引起的一种高度接触性人畜共患传染病。HPAI的暴发给养禽业带来了一定的经济损失,H5N1亚型AI的出现不仅产生经济损失,还带来了恐慌。AIV的主要抗原决定簇都位于HA1区域。体外表达HA1涵盖了所有的HA空间中和表位,故其完全可以替代HA作为抗原。所以HA1蛋白是研制基因工程亚单位苗的理想候选抗原。 本试验分别以pMD18-T-VP2、pMD18-T-HA1和pMD18-T-mChIL18质粒为模板,以杆状病毒pFastBac Dual为载体,将mChIL18基因与VP2基因或HA1基因分别插入到载体的PH启动子和P10启动子的下游,构建重组转移载体质粒pF-IL18、pF-VP2、pF-IL18-VP2、pF-HA1、pF-IL18-HA1。将其转化DH10Bac感受态细胞,经三重抗性(含卡那霉素、庆大霉素和四环素)与蓝白斑筛选,用小量法提取重组杆状病毒质粒rBac-IL18、rBac-VP2、rBac-IL18-VP2、rBac-HA1、rBac-IL18-HA1,通过一对通用引物M13(Bacmid含有该引物Forward和Reverse两个引物位点,能够从两侧扩增LacZα互补区域内的mini-attTn7位点,有利于PCR分析)进行PCR扩增鉴定。在转染试剂CellfectinII的作用下,通过脂质体介导法将纯化的rBac-IL18、rBac-VP2、rBac-IL18-VP2、rBac-HA1、rBac-IL18-HA1转染至草地贪夜蛾细胞(Spodoptera frugiperda 9,sf9)获得P1代重组杆状病毒,用P1代病毒感染sf9来扩增病毒滴度,将达到一定滴度(100pfu/mL)的P3代重组杆状病毒感染sf9,感染72h后收获sf9细胞及培养上清,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测和间接免疫荧光试验(IFA)检测。SDS-PAGE检测显示,mChIL-18、VP2、HA1基因均在sf9中的裂解上清中得到了高效表达,即表达的蛋白是可溶性的,表达的目的条带分子量分别约为19.5 KD, 48.4 KD, 37.4 KD。IFA检测显示mChIL18基因与VP2基因或HA1基因分别同时在同一细胞中独立表达。 采用鸡脾淋巴细胞增殖试验(MTT法)、IFN-γ诱导实验和水疱性口炎病毒(VSV)抑制试验对表达的蛋白进行生物学活性测定。鸡脾淋巴细胞增殖试验表明,不同浓度的pIL18、pVP2-IL18和pHA1-IL18均能够明显促进淋巴细胞的增殖,随着蛋白浓度的增加刺激转化作用逐渐增强,均当浓度为200ng/mL时,刺激转化效果最佳,增殖指数可达4.13、4.35、4.09,但随着蛋白浓度的增大淋巴细胞的增殖指数逐渐降低。VSV病毒活性抑制试验表明,当蛋白浓度大于100ng/mL时能刺激脾淋巴细胞产生IFN-γ,并且随着pIL18、pVP2-IL18和pHA1-IL18浓度的增加诱导产生IFN-γ的量随之增加;将不同稀释度的IFN-γ分别作用于VSV,在IFN-γ≥1×10U/mL时,具有较强的抑制效果,当IFN-γ为10 U/mL时,只能达到约50%的保护。该结果说明pIL18、pVP2-IL18和pHA1-IL1

关键词： 猪细小病毒   猪圆环病毒2型   猪伪狂犬病病毒   VP2基因   ORF2基因   核酸疫苗   基因工程疫苗   重组病毒  

摘要： 猪细小病毒(Porcine Parvovims, PPV)是引起猪繁殖障碍的主要病原之一,猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2, PCV2)引起以断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)为代表的系列疾病。该两种疾病在世界范围内广泛流行,造成了巨大的经济损失,目前,对这两种疾病的防制主要靠预防接种。然而,目前广泛使用的猪细小病毒灭活疫苗存在灭活不完全的风险,而且由于PPV体外培养较困难,病毒增殖滴度较低,这给灭活疫苗的生产带来一定困难;同时PCV2在细胞上增殖滴度很低,发展传统疫苗都存在一定障碍,因此有必要发展新型疫苗来防制这两种疾病。这两种疾病常发生混合感染,并具有协同性,如果能研发一种可同时预防这两种疾病的疫苗,将具有重要意义。据此,本研究展开了对四川省PPV和PCV2的抗原流行病学调查,以掌握其流行现状;对PPV VP2基因和PCV2 ORF2基因及其串联基因设计核酸疫苗;并以猪伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus, PRV)为活病毒载体,构建了PRV-PPV-PCV2三价基因工程疫苗,为进一步预防和控制PRV、PPV和PCV2及其混合感染打下坚实的基础。具体如下： 1.四川省猪细小病毒、猪圆环病毒2型流行病学调查 从四川省21个规模化猪场共采集273份样品,通过PCR诊断技术进行了PPV、PCV2病原流行病学调查,结果检出PPV抗原阳性样品47份(17.22%)、PPV阳性猪场8个(38.1%),具有种猪的感染率较高,而在仔猪感染率相对较低的特点：检出PCV2抗原阳性样品143份(52.38%)、PCV2阳性猪场18个(85.7%),具有PCV2感染随猪年龄的增长而升高的趋势;检出PPV和PCV2混合感染样品29份(10.62%)、同时混合感染PPV和PCV2的猪场6个(28.7%),混合感染主要集中在母猪和保育仔猪阶段。 2.猪细小病毒和猪圆环病毒2型核酸疫苗的构建 通过PCR方法扩增PPV VP2基因和PCV2 ORF2基因,并分别插入真核表达载体pCI-neo中,成功构建了真核表达质粒pCI-VP2和pCI-ORF2,同时,将PPV VP2基因和PCV2 ORF2基因进行串联,两基因间以高亲水性氨基酸(Gly-Gly-Gly-Ser)编码核苷酸连接,插入到PCI-neo中构建真核表达质粒pCI-VP2-ORF2。将pCI-VP2. pCI-ORF2和pCI-VP2-ORF2转染Vero细胞后,通过RT-PCR法检测目的基因转录、SDS-PAGE电泳、Western blotting分析和间接免疫荧光分析蛋白表达,结果表明,3种真核表达质粒转染哺乳动物细胞后,既可扩增到目的基因,也可检测到特异性蛋白的表达,成功地表达了外源基因。 3.猪细小病毒和猪圆环病毒2型核酸疫苗对小鼠免疫效果研究 将84核酸疫苗pCI-VP2、pCI-ORF2和pCI-VP2-ORF2以100μg/只剂量免疫健康昆明小白鼠,2周后相同剂量加强免疫一次,于首免后O d、7 d、14 d、21 d、28 d、42 d、56 d断尾采血并分离血清进行抗体检测,发现首免后14d,可检测到PPV和PCV2特异性抗体的出现,加强免疫后7d,其抗体转化为阳性,但其诱导抗体水平均低于疫苗组所诱导的抗体水平：于首免后0 d、21 d、56 d分离血清进行细胞因子检测,发现其均可诱导较高水平的IL-2、IL-4、IFN-y;于首免后56d,采集抗凝血一份,进行T淋巴细胞亚群检测,发现CD4+/CD8+比例明显下降;首免后56d在每组随机挑选一只小鼠颈椎脱臼处死,取脾脏制备单个脾细胞悬液,用ConA进行刺激并测定刺激指数,发现能够诱导较强的脾细胞增殖;首免后56d采集小鼠的实质器官,进行安全性检测,均未检测到3种核酸疫苗的外源基因与小鼠基因组DNA整合的情况,表明3种核酸疫苗是安全的。这些结果说明,3种核酸疫苗均能够诱导小鼠产生较强的细胞免疫应答和体液免疫应答,并具有良好的安全性。 4. PPV-PCV2-PRV三价基因工程疫苗PRV SA215(D1)的构建 将VP2-ORF2融合基因从真核表达载体pCI-VP2-ORF2切下,连接到PRV通用转移载体***中,成功构建了转移载体***-VP2-ORF2。将PRV SA215基因组DNA与转移质粒***-VP2-ORF2共转染Vero细胞,通过同源重组,构建重组病毒。挑斑筛选后,通过绿色荧光检测和PCR检测表明成功构建了PRV-PPV-PCV2三价基因工程疫苗株PRV SA215 (Dl);通过SDS-PAGE电泳、Western blotting分析和间接免疫荧光分析,结果表明,VP2基因和ORF2基因在重组PRV SA215 (D1)