关键词： 传染性支气管炎病毒   基因型   进化分析   重组马立克病毒   免疫保护  

摘要： 禽传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus,IBV)属于冠状病毒科冠状病毒属中的γ-冠状病毒,由该病毒感染引起的疾病称为禽传染性支气管炎(avian infectious bronchitis,IB),是一种对鸡危害非常严重的急性、高度传染性的病毒性呼吸道疾病,可导致鸡的增重和饲料报酬降低,也能引起蛋鸡产蛋量和蛋的品质下降等,因此具有重要的经济意义,免疫预防是目前控制该病的最为有效的手段。IBV的重要特点之一就是血清型众多,不同血清型之间交叉保护性较低甚至完全不能保护,因此在生产中必须选用与流行毒株血清型一致的疫苗才能取得良好的免疫保护效果。不同血清型的IBV具有典型的地域性流行特征,而且由于病毒基因组的突变和毒株间的重组使得新的血清型不断出现,使免疫预防日益复杂化。本研究的目的旨在通过系统的流行病学监测了解近年来不同基因型IBV在我国的流行状况,通过生物信息学分析阐明不同IBV基因型间遗传演化的规律和发展趋势,并针对流行的优势基因型毒株研制新型疫苗。 1、2009-2011年间国内IBV流行病学监测与流行株的遗传进化分析 2009-2011年间,共从国内主要养鸡省份分离到IBV流行毒株54株,其中肉鸡源毒株52株,蛋鸡源毒株2株。在肉鸡源毒株中我们发现存在较高比例的IBV与H9亚型AIV的混合感染(25/52),发生混合感染的鸡群往往发病更为严重,且混合感染样品对接种的鸡胚表现出更强的致病性,该结果提示这两种病毒之间可能存在一定程度的致病协同作用。对所有分离毒株S1基因进行克隆和基因测序,共发现4种不同的S1基因长度,分别为1611bp、1617bp、1620bp和1626bp,说明S1基因中碱基的插入和缺失是一种非常普遍的现象。将54个分离株S1基因序列和近年来在国内及周边国家和地区流行的13个基因型共57个参考毒株的S1基因序列用Mega4.1软件进行遗传进化分析,结果显示54个分离株可以分为QX型(42株)、HN-08型(5株)、LSC/991型(2株)、TW-I型(2株)、Mass型(1株)、793/B型(1株)和CHⅢ型(1株)等7个基因型。在所有分离株中,QX型分离株数量最多,占总数的77.8%(42/54)。从进化树中还可以看出,QX型分离株又可以进一步细分为两个不同的基因亚群-Cluster Ⅰ(21株)和Cluster Ⅱ(21株),经典的QX型参考毒株QXIBV和LX4株均属于Cluster Ⅰ亚群,而Cluster Ⅱ亚群中的毒株均在2010年才开始出现。为了更加系统地描述同期内国内不同基因型IBV的分布情况,我们将已经在GenBank发表全长S1基因序列的所有同时期分离株共296株合并进行遗传进化分析,结果显示,350个同时期分离株可分为19个基因型,其中11个基因型均能根据现有文献报道找到同源的参考毒株,根据各基因型中包含的毒株数量多少依次为：QX型(219株)、HN-08型(26株)、LSC/99I型(22株)、LDT3/03型(12株)、TW-I型(12株)、CH Ⅲ型(11株)、Mass型(10株)、LDL/971型(3株)、CH VI型(3株)、TW-Ⅱ型(2株)和793/B型(1株),此外还有8个基因型未能归入已被正式命名的已知基因型,因此暂定名为未定型Ⅰ～未定型Ⅷ。从分型结果可以看出,我国流行的IBV基因型具有典型的地域性分布特征,大多数在周边国家和地区广泛流行的基因型在我国并未发现。 为阐明国内不同基因型毒株之间的遗传演化关系,根据遗传进化和基因分型的结果,从不同基因型中选择代表性毒株,用RDP3.31软件对S1基因进行重组分析。结果显示当前国内流行的毒株中存在广泛的重组现象,不同基因型间的重组事件不仅导致同一基因型内部发生分化,出现了不同基因亚群,而且经过多次的同源重组后可能会导致新的基因型毒株的出现。综合不同基因型间发生的系列重组事件,可以推断：QX型、LSC/991型、793/B型、LDL/971型、TW-Ⅰ型和TW-Ⅱ型是目前在我国流行的所有基因型毒株的原型毒株,除此以外的新出现的基因型均是在这6个基因型的基础上经过一次或多次的同源重组而产生的变异株。 2、Mass型H120活疫苗对当前流行的主要基因型代表毒株的免疫保护效力试验 根据遗传进化分析的结果,从当前主要流行的三个IBV基因型中挑选出4个代表毒株：AH/2009/1(QX型Cluster Ⅰ亚群)、JS/2010/12(QX型Cluster Ⅱ亚群)、JS/2009/5(LSC/99I型)和JS/2010/6(HN08型),分别用Mass型IBV活疫苗(H120株)进行免疫保护效力试验,以评价现有疫苗对流行毒株的免疫保护状况。结果显示H120疫苗株对不同基因型的IBV毒株免

关键词： HBsAg   乙肝病毒表面抗原   人源基因工程抗体   噬菌体抗体库   非竞争性ELISA   BIAcore  

摘要： 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)属嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)正嗜肝DNA病毒属,HBV感染严重威胁人类生命健康,可引起急、慢性肝炎、肝衰竭、肝硬化、肝癌以致死亡。全球约有30亿人曾经感染过HBV,将近3.5亿人为慢性HBV感染者。我国1992年和2006年全国HBV感染血清流行病学结果显示,随着乙肝疫苗预防接种纳入新生儿计划免疫后,一般人群的HBsAg阳性率已经明显下降,从92年的9.75%下降到06年的7.18%,使我国由原来的高流行区降为中度流行区,但仍可推算出约9300万乙肝携带者,其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者约有2000万例。在《中国病毒性肝炎的流行现状及其相关问题分析报告》中估算出我国每年因慢性乙肝(包括肝硬化、肝癌)的直接和间接医疗费用约6000亿元,给患者和国家造成了巨大的经济负担。 乙型肝炎治疗任重而道远,在针对乙型肝炎的治疗药物中,诸如干扰素、胸腺肽α1、核苷类似物、多肽类药物、治疗性疫苗及中草药等,到目前为止,尚未发现能够根除乙肝病毒的药物。目前应用于临床的高效价免疫球蛋白(HBIG)采用健康人即抗-HBsAg阳性的人血制备的,可以中和并清除侵入人体的乙肝病毒,使机体免受乙肝病毒的感染。由于血源来源有限、制备成本高且存在病原体潜在感染的危险,限制了其在临床上的应用。抗体库技术能够筛选出高亲和力的特异性单克隆抗体,从而使大规模生产人源化乙肝抗体成为可能。基于此,本研究中筛选人源抗HBsAg抗体包括以下三部分内容： 一、人源抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌体抗体库的构建和筛选 选取5名乙肝表面抗体(HBsAb+)阳性的健康志愿者,接种国产乙肝疫苗进行加强免疫,两周后采集志愿者外周血并分离出淋巴细胞,提取细胞总RNA,使用Oligo dT引物逆转录合成cDNA,利用特异性的8对Lambda轻链子库引物、5对Kappa轻链子库引物和8对重链引物扩增出轻重链Fd片段,轻链和重链分别通过SacⅠ/XbaⅠ和Xhol/SpeⅠ酶切位点克隆到pComb3H载体中,成功电转构建4个Kappa子库和Lambda子库,细菌抗体库鉴定结果表明所构建Fab噬菌体抗体库库容量达到3×108以上,抗体基因插入率接近100%,符合筛库的标准。 在成功构建了噬菌体抗体库的基础上,采用辅助噬菌体VCSM13包装成Fab噬菌体抗体库,利用商品化的乙肝表面抗原蛋白对抗体库进行富集筛选。并通过序列测定确定所获各株抗体的基因序列,与v-base database中抗体序列信息进行比较,确定其CDR区。序列测定结果显示共有20株轻重链系列均不相同的克隆株,通过ELISA实验证明这些抗体均为特异性HBsAg抗体,通过竞争性ELISA发现20株抗体可以竞争结合3个不同表位。 二、人源抗乙型肝炎病毒表面抗原全抗体表达及功能鉴定 在利用原核细胞XL1-Blue表达Fab抗体的基础上,分别利用哺乳动物瞬时表达系统和杆状病毒-昆虫细胞技术平台实现了全抗体的真核分泌表达。将筛选出的20株抗体中具有高滴度6株Fab抗体的轻链和重链Fd段基因插入杆状病毒载体pAc-L-FcR中,然后将构建完成的重组质粒与杆状病毒重组后转染昆虫细胞,同时将其轻重链可变区基因插入HL51-14哺乳动物细胞表达载体后,转染293T细胞。通过直接免疫荧光检测真核表达效果,收集昆虫细胞和哺乳动物细胞表达上清进行亲和层析纯化。利用SDS-PAGE检测纯化后抗体的纯度、ELISA方法检测纯化后的抗HBsAgIgG全抗体的功能活性,结果表明纯化后的人源HBsAg单克隆抗体抗体纯度达到98%以上,并且具有良好的生物活性。 三、人源抗乙型肝炎病毒表面抗原IgG全抗体亲和力研究 将纯化后的抗HBsAg IgG全抗体分别利用非竞争性ELISA方法和BIAcoreSPR检测方法检测其亲和力,结果显示含有同一重链基因的各株抗体的亲和力较高,KD值达到10-9mol/L(abbr.M),而两种表达系统表达的同一株抗体的亲和力活性无明显差异。 综上所述,本研究通过基因工程抗体制备技术平台,运用噬菌体表面呈现技术,从乙肝疫苗加强免疫后的HBsAb+志愿者的外周血中获得Fab段抗体基因,成功构建了人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体文库,容量为2×107克隆/ml,轻、重链基因插入率均接近100%。用商品化的乙肝病毒表面抗原对Fab噬菌体抗体库进行富集筛选,经过特异性ELISA、序列测定证实共获得了20株特异性针对乙肝病毒表面抗原的人源Fab单抗,滴度测定后选取6株滴度较高的抗体进行全抗体表达。将重链基因不同的3株Fab抗体的轻链和重链Fd段基因,分别克隆入昆虫细胞全抗体表达载体pAC-L-FcR,转染Sf9细胞,利用杆状病毒/昆虫

关键词： 禽流感   疫苗   原核表达   蛋白质纯化   蛋白质复性   H5N1   免疫效力   小鼠  

摘要： 目的设计并获得一种安全、高效,并能对以H5N1亚型为主的多种禽流感病毒亚型产生保护的复合基因工程疫苗。方法利用分子生物学和分子免疫学方法对国内以及周边国家流行的禽流感毒株进行全面分析,利用生物信息学技术合理设计亚单位加表位的全新复合结构疫苗的氨基酸序列;利用大肠杆菌密码子优化技术根据疫苗氨基酸序列获得基因序列;通过全基因合成的方法获得该疫苗的基因,并通过大肠杆菌表达系统对该疫苗进行表达;目的蛋白经过包涵体洗涤和色谱纯化后复性;通过ELISA评价其抗原特异性,并乳化制备成禽流感蛋白疫苗,通过小鼠体内免疫试验检测其免疫效力。结果设计了包含通用性的辅助性T细胞表位、B细胞表位以及CTL表位的串接疫苗结构;全基因合成获得了该复合疫苗的基因序列;该基因在大肠杆菌表达系统中得到了高效表达,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白30%;经过粗纯和精纯后的目的蛋白纯度达到95.5%,复性后获得可溶性蛋白溶液,浓度可达2.4 mg/mL。结论通过小鼠实验,验证了该H5N1亚型基因工程疫苗的抗原性,证实该基因工程疫苗在免疫小鼠体内激发体液免疫的同时调动了细胞免疫。小鼠免疫试验证明,该疫苗可以在小鼠体内有效诱发免疫应答。

关键词： 人干扰素   生物制品   研究所   重组   上市   长春   基因工程疫苗   人白细胞介素  

摘要： 作为我国第一个干扰素中试基地，第一个乙肝基因工程疫苗工业化生产基地，第一个获得重组人白细胞介素一2生产文号的企业，长春生物制品研究所经过多年努力研制成功的防治宫颈癌新药——重组人干扰素a2b栓日前上市，该药是吉林省科学技术发展项目，获得国家发明专利。

关键词： 肠道病毒71型   反向遗传学技术   基因工程疫苗   病毒基因组   基因组结构   人工操作   分子水平   基因治疗  

摘要： 反向遗传学技术实现了在DNA分子水平上对RNA病毒基因组的人工操作，在深入阐明基因组结构与功能、筛选研制新型基因工程疫苗及基因治疗等方面显示出良好的应用前景。本文对反向遗传学技术及在肠道病毒71型病毒中的应用进行了综述。

关键词： B-CELL LYMPHOMAS   IBRITUMOMAB TIUXETAN RADIOIMMUNOTHERAPY   REFRACTORY LOW-GRADE   MONOCLONAL-ANTIBODY   I-131 TOSITUMOMAB   BIOTIN REAGENTS   PHASE I/II   ANTI-CD20   THERAPY   SYSTEM  

摘要： Purpose: Pretargeted radioimmunotherapy (PRIT) using streptavidin (SAv)-biotin technology can deliver higher therapeutic doses of radioactivity to tumors than conventional RIT. However, "endogenous" biotin can interfere with the effectiveness of this approach by blocking binding of radiolabeled biotin to SAv. We engineered a series of SAv FPs that downmodulate the affinity of SAv for biotin, while retaining high avidity for divalent DOTA-bis-biotin to circumvent this problem. Experimental Design: The single-chain variable region gene of the murine 1F5 anti-CD20 antibody was fused to the wild-type (WT) SAv gene and to mutant SAv genes, Y43A-SAv and S45A-SAv. FPs were expressed, purified, and compared in studies using athymic mice bearing Ramos lymphoma xenografts. Results: Biodistribution studies showed delivery of more radioactivity to tumors of mice pretargeted with mutant SAv FPs followed by In-111-DOTA-bis-biotin [6.2 +/- 1.7% of the injected dose per gram (%ID/gm) of tumor 24 hours after Y43A-SAv FP and 5.6 +/- 2.2%ID/g with S45A-SAv FP] than in mice on normal diets pretargeted with WT-SAv FP (2.5 +/- 1.6%ID/g; P = 0.01). These superior biodistributions translated into superior antitumor efficacy in mice treated with mutant FPs and Y-90-DOTA-bis-biotin [tumor volumes after 11 days: 237 +/- 66 mm(3) with Y43A-SAv, 543 +/- 320 mm(3) with S45A-SAv, 1129 +/- 322 mm(3) with WT-SAv, and 1435 +/- 212 mm(3) with control FP (P < 0.0001)]. Conclusions: Genetically engineered mutant-SAv FPs and bis-biotin reagents provide an attractive alternative to current SAv-biotin PRIT methods in settings where endogenous biotin levels are high. Clin Cancer Res; 17(23); 7373-82. (C)2011 AACR.

关键词： 畜牧兽医研究所   免疫学   北京市农林科学院   预防   畜牧兽医学会   免疫抑制性疾病   专家   基因工程疫苗  

摘要： 杨兵，女，副研究员，博士，北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽生物制剂高新技术研究室副主任。现任北京市畜牧兽医学会副秘书长及北京小动物学会秘书长。研究方向为预防兽医及免疫学。主要从事畜禽病毒病防制及诊断技术及相关分子生物学研究，包括诊断试剂、基因工程疫苗以及免疫抑制性疾病发病机理的研究。

关键词： 肿瘤   基因工程抗体   免疫治疗  

摘要： 单克隆抗体（Abs）是新一类抗癌方法，可以提高某些恶性肿瘤如乳腺癌、结肠癌等的治愈率，缓解肿瘤进展时间，但其抗肿瘤的疗效还不十分理想。采用基因工程技术将Abs进行重组，并克隆到表达载体中，在适当的宿主细胞中表达为所需的抗体分子，可提高其抗肿瘤疗效。该法具有免疫原性低、效价高、成本低等优点。现结合文献就近年来几种新型基因工程抗体的特性及临床应用综述如下。

关键词： 育种方法   生物育种   现代生物工程技术   细胞工程育种   基因工程育种   细胞生物学   单倍体育种   多倍体育种  

摘要： 生物育种是利用遗传学、细胞生物学、现代生物工程技术等原理与方法培育生物新品种的过程。本文分析杂交育种、诱变育种、单倍体育种、多倍体育种、营养体繁殖、细胞工程育种、基因工程育种、植物激素育种等方法。

关键词： O型口蹄疫病毒   基因工程疫苗   猪口蹄疫   免疫原性   候选株   O型口蹄疫疫苗   感染性克隆   致病性试验  

摘要： 近年来．O型口蹄疫病毒已演化出多种谱系。目前应用的疫苗已不能有效保护多谱系口蹄疫的流行，这给我国猪口蹄疫的防控带来了极大的困难。为了进一步发展免疫原性好、抗原谱广的猪O型口蹄疫疫苗候选株．本研究以O／HN／93现用疫苗毒株的感染性克隆为骨架，构建了含VP3（58位）和VPl（43、48、137、139、140、141和142位）氨基酸改造的全长克隆。线性化的全长cDNA和盯RNA聚合酶质粒共转染BHK细胞后获得拯救病毒。RTPCR和乳鼠致病性试验表明拯救病毒遗传稳定，具有与亲本病毒相似的致病性。用拯救的基因工程病毒灭活疫苗免疫猪28d后分别用中国谱系、泛亚谱系和缅甸98谱系猪源毒的流行毒攻击，结果均获得了完全保护（16／16）。O／HN／93灭活疫苗免疫猪能完全保护泛亚谱系和缅甸98谱系猪源病毒的攻击（16／16）。但不能完全保护（12116）中国谱系猪源病毒的攻击。结果表明基因工程病毒制备的灭活疫苗提高了对中国型猪源谱系病毒的免疫保护，拓展了抗原谱，是具有良好开发前景的疫苗候选株。