关键词：
有机磷农药
半抗原
分子模拟对接
突变改造
基因工程抗体
摘要：
有机磷农药(Organophosphorus pesticide,OPs)指含有磷元素的有机化合物农药,在农业生产中被广泛用于作物病虫、草的防治,由于有机磷农药种类多且易于在果蔬中残留,因此容易造成累积毒性危害。目前对有机磷农药残留的检测分为定性与定量检测方法。主要为仪器分析方法和免疫检测方法。仪器分析方法检测灵敏度高、适用于基于标准品的定量检测,而免疫检测方法简便、快速、检测成本低,适用于现场的快速定性检测。免疫学检测方法是基于抗原抗体特异性反应实现对目标物的识别检测,制备高灵敏的抗体是实现有效检测的前提。本研究首先通过计算分析小分子半抗原结构,筛选、设计最优的半抗原结构作为抗原表位;对获得的单克隆抗体可变区进行三维结构建模与分子模拟对接,找出关键氨基酸与分子间作用力,为抗体的体外进化与突变改造提供理论基础;而后对抗体进行了突变表达,获得了重组基因抗体,并验证分析突变前后抗体的活性变化情况。主要研究结果如下:(1)有机磷农药半抗原结构设计:有机磷农药小分子基本结构通过Pub Chem获得。使用高斯软件对小分子进行量化计算并进行最优构型比对、分子表面静电势分析、红外光谱表征。结果表明,有机磷共性结构部位(乙氧基)的静电势能表面极值点的分布范围为-27.86～23.18 kcal/mol:半抗原1在共性结构静电表面与有机磷的区域性相似度更高,且HOMO-LUMO Gap的值较低(5.30948817),红外光谱杂峰少,为最优半抗原结构。(2)抗体活性结构建模及其识别机制理论分析:采用I-TASSER对所获得的单克隆抗体可变区氨基酸序列进行三维结构建模,并使用Autodock vina和CB-DOCK2两种对接软件对抗体和十三种小分子(含半抗原)进行分子模拟对接,对不同药剂活性分析结果表明,抗原在抗体口袋区的结合姿态,抗原抗体间不同的分子间作用力和静电表面,是抗体对不同药物识别差异的理论基础。(3)抗体识别活性结构关键结合氨基酸位点突变分析:在抗体结合抗原的口袋区域,从提升抗体静电引力,同时增强抗体结合抗原有机磷的共性结构部分的分子间作用力的两个角度进行关键识别氨基酸的突变,两种突变方向均采用了氨基酸单点突变和双位点突变,并对突变后的结果进行了分子模拟对接验证,筛选出了四种突变方式进行基因工程抗体表达。抗体可变区的突变方式如下:ILE95→GLU95、ILE95→GLU95&GLY164→ASP164、PRO41→GLN41、PRO41→GLN41&95 ILE→GLN95。上述突变抗体依次命名为突变抗体1、突变抗体2、突变抗体3、突变抗体4。(4)基因工程抗体的表达及活性验证:使用CHO-K1真核细胞表达体系对突变抗体进行真核表达,经引物PCR、基因重组、菌落筛选、质粒抽提和细胞的电转表达,表达共获得了4个突变抗体。经试验验证,四种突变抗体对半抗原、三唑磷、苯硫磷、乙拌磷、甲基对硫磷、除线磷和伏杀硫磷等7种有机磷小分子的识别灵敏度有整体性提升效果,IC提升范围为1.57～6.28倍。对辛硫磷、甲拌磷、喹硫磷的识别灵敏度无明显提升。结果表明,本研究所采用的抗体突变策略可有效提升有机磷广谱型识别抗体对多种农药的识别灵敏度。(5)蔬菜中的检测应用:选用突变抗体3与白菜和茄子两种蔬菜基质,采用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)对蔬菜真实样本中的有机磷农药进行检测。在优化有机溶剂含量以及提取液稀释倍数的基础上,对蔬菜样本进行加标回收率和变异系数计算。结果表明,方法在白菜和茄子蔬菜样本中的添加回收率分别为71.2%～129.7%、78.4%～122.2%,变异系数分别为1.3%～7.5%、0.8%～6.2%,说明建立的方法在实际样本检测中有较好的效果。综上所述,本研究通过所采用的半抗原量化计算模拟分析方法,综合分析十余种有机磷类化合物的相关性质,并基于此,分析四种有机磷半抗原的结构性质,筛选出最优结构的半抗原。再利用此半抗原所免疫获得的单克隆抗体进行氨基酸位点定点突变,提高了抗体对农药的识别灵敏度。实现了对蔬菜中多种有机磷农药的检测。本研究所采用的半抗原筛选策略与抗体突变策略均有良好的效果。
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