关键词： 虹鳟鱼传染性造血器官坏死病   免疫   攻毒   注射   浸泡  

摘要： 虹鳟鱼传染性造血器官坏死病(IHN)是一种死亡率高、危害性极大的鲑科鱼类病毒性传染病。于2009年侵入甘肃省,对甘肃省虹鳟鱼产业造成毁灭性打击,使永登、永昌等地虹鳟鱼养殖场被迫停产。本试验使用兰州市威特森生物科技有限公司和兰州市渔业技术推广中心联合研制的一种IHN基因工程疫苗开展虹鳟鱼注射免疫和浸泡免疫试验,同时将免疫完成后的苗种投放到疫区开展攻毒试验。结果表明,虹鳟鱼传染性造血器官坏死病疫苗接种,采用浸泡接种的方法较注射接种更适合在生产实践中推广应用;且适宜采用二次浸泡接种的方法,第一次浸泡免疫的苗种规格为4g,第二次浸泡免疫的苗种规格为10g;该基因工程苗采用1‰浓度进行免疫效果最佳,免疫虹鳟鱼苗种成活率可达80%以上。

关键词： 猪圆环病毒(PCV)   基因工程抗体   猪源化改造   真核表达  

摘要： 猪圆环病毒2d型(Porcine circovirus type 2d, PCV2d)是猪圆环病毒的一个主流亚型，是引起断奶仔猪(Sus scrofa)多系统衰竭综合征等猪免疫抑制相关疾病的重要病原，严重危害着我国养猪业的健康发展。目前报道的PCV2d中和表位均位于衣壳蛋白(capsid protein, Cap)上，Cap是产生中和抗体的关键蛋白，其中和抗体能够与病毒结合，从而阻止PCV2d的感染。本研究首先通过原核表达、纯化获得PCV2d Cap重组蛋白，并免疫BALB/c小鼠(Mus musculus)，筛选得到了2株鼠源抗PCV2d Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1B3和1B4，其中1B3具有中和活性且不与其他病毒发生交叉反应。将1B3抗体可变区基因与猪源恒定区基因嵌合后克隆至真核表达载体中，利用中国仓鼠(Cricetulus griseus)卵巢CHO-S细胞制备1株PCV2d Cap蛋白重组猪源化嵌合抗体r1B3swine稳定表达细胞系。抗体功能验证和Western blot结果显示，r1B3swine与PCV2d病毒结合反应良好，并且不与抗鼠二抗发生交叉反应。综上所述，本研究构建的猪源化抗PCV2d Cap蛋白的单克隆抗体r1B3swine的真核表达体系，为研究PCV2d Cap蛋白的结构、功能及为PCV2研发新的治疗和诊断制剂提供物质基础。

关键词： 基因工程抗体   (CP)3   二聚体F(ab')2   靶向性   结合活性  

摘要： 背景与目的:随单克隆抗体技术愈发成熟,用于治疗疾病的商业单抗被深入研究,但全长抗体逐渐显露的不足之处限制了在临床中的应用,如全抗分子量大,难以穿透肿瘤组织到达肿瘤内部,且Fc端易引起非特异性结合带来的副作用等。因此构建表达活性小分子抗体或许成为新的治疗方向,如单链可变区scfv、抗原结合片段Fab等。与单价的小分子抗体相比,构建双价或多价抗体可以增强与抗原的结合能力,增加分子量大小可延长药物的半衰期,减缓在体内的清除速率等,常见的双价或多价抗体如F(ab')2、Triabodies、Tetrabodies等。基于本实验室前期筛选的Anti-CD19、Anti-CD20及Anti-BCMA的单克隆抗体,在其人鼠嵌合的Fab片段抗体的CH1末端引入半胱氨酸(Cys)和脯氨酸(Pro)的组合序列,构成Fab',再通过半胱氨酸的巯基氧化成二硫键以期构成双价或多价抗体,达到增强与靶抗原的亲和力的目的。此外,抗体偶联药物(ADC)是抗体药物的重要分支,因抗体具有靶向性可降低毒副作用,偶联毒素药物可降低最低有效剂量,本论文亦探究该基因工程改造形式用于构建二聚化的融合蛋白,以期形成二聚化的抗体偶联物,检测二聚化后的抗体偶联物与靶细胞的结合活性是否得到显著的增强。方法:在已有原核表达载体PAYZ-Anti-CD19Fab的基础上,构建(CPP)3、(CPP)2、(CPP)、(CP)3、(CP)2、(CP)六种基因工程改构形式的质粒,经热激法转化至大肠杆菌16C9,采用低磷诱导表达培养基表达目的蛋白,经Protein G亲和层析柱纯化,通过SDS-PAGE鉴定各种蛋白及质谱鉴定Anti-CD19Fab-(CP)3分子量及主要组分相对含量,通过流式细胞术检测不同改构形式的蛋白与靶抗原的结合活性,确定了最优的改构形式(CP)3结构。为验证此改构方式是否具有通用性,将(CP)3结构与现有的改构技术(CPP)3结构以同样方式构建于Anti-CD20及Anti-BCMA靶点的Fab片段抗体的CH1末端,通过电泳鉴定二聚体相对含量及流式检测与靶细胞结合活性。为进一步探究该改构形式是否适用于抗体偶联物,构建了 Anti-CD19Fab偶联辅基蛋白(LDP)的原核表达质粒,融合蛋白表达纯化后经电泳鉴定二聚体相对含量及流式检测融合蛋白对靶抗原的结合活性。结果:成功构建并表达了靶向CD19的不同改构形式的蛋白,经凝胶电泳鉴定及流式活性检测结果显示,相比于Fab单体蛋白及引入现有的改构技术(CPP)3结构的抗体,引入(CP)3结构对构建二聚化抗体更优,与靶细胞的结合活性更高。成功构建并表达了靶向CD20、BCMA的二聚化抗体,电泳结果显示引入(CP)3结构相比引入(CPP)3结构可形成更高比例的二聚体,流式检测结果显示与靶细胞的结合活性更强。成功构建并表达了靶向CD19的Fab段抗体与LDP的偶联物,结果显示引入(CP)3结构可形成更高比例的二聚化融合蛋白,与靶细胞的结合活性更强。结论:在 Anti-CD19Fab、Anti-CD20Fab、及 Anti-BCMAFab 段抗体的 CH1 末端引入(CP)3结构比引入(CPP)3结构可形成更高比例的二聚体,流式检测引入(CP)3结构的抗体与靶细胞的结合活性更高,此结论在靶向CD19的抗体偶联药物中依然适用。与单体Fab片段抗体相比,经过基因工程改造后,形成二聚体比例越高的抗体,对靶抗原的亲和力也越强。

关键词： 灵芝   灵芝酸   积累   基因工程   杂交育种  

摘要： 灵芝是我国名贵的药用真菌,可以生产多种活性成分,如灵芝酸、灵芝多糖等。灵芝酸是灵芝中主要的次级代谢产物,具有抗HIV、抗癌细胞转移、抗肿瘤等重要药理作用,但目前灵芝酸的产量仍不能满足临床及商业需求。在水稻、玉米等作物研究中发现采用基因工程结合杂交育种的方法可以提高其次级代谢产物的含量,并可减少育种的盲目性。但在担子菌中,基因工程结合杂交育种对次级代谢产物积累及育种的影响还未有研究。在本研究中,我们使用原生质体单核化技术将双核菌株CGMCC5.0026分离,通过锁状联合和SNP测序验证成功获得单核菌株G.260125和G.260124。随后,采用转基因技术在G.260124菌株中转入透明颤菌血红蛋白基因(vgb)获得过表达工程菌株24+vgb,在G.260125菌株中转入鲨烯合成酶基因(sqs)获得过表达工程菌株25+sqs。使用杂交育种的手段,将两个工程菌株进行杂交,通过PCR、锁状联合和SNP测序验证成功获得了v+s杂交双核菌株。对比CGMCC5.0026菌株和v+s杂交菌株在液体静置发酵培养中灵芝酸的生产情况。研究发现CGMCC5.0026菌株和v+s菌株的细胞生长无显著差异。v+s菌株单体灵芝酸GA-T、GA-S、GA-Me的最大含量分别为124.876±14.322、27.945±2.672、68.154±1.775μg/100 mg细胞干重,分别是对照CGMCC5.0026菌株的1.24、1.52、1.28倍。为了初步探究其影响灵芝酸合成的机制,我们检测了灵芝酸合成途径的中间代谢产物羊毛甾醇和鲨烯的含量及合成相关基因sqs和羊毛甾醇合成酶基因(ls)的表达水平。v+s菌株的鲨烯和羊毛甾醇的最大含量分别为0.866±0.097、10.638±0.50μg/100 mg细胞干重,分别是对照CGMCC5.0026菌株的2.04、1.89倍。v+s菌株的sqs、ls的最大转录水平分别是对照CGMCC5.0026菌株的3.07、2.42倍。结果表明,基因工程结合杂交育种可能是通过提高灵芝酸合成途径的中间代谢产物含量和灵芝酸合成相关基因的转录水平来提高液体静置培养菌丝中灵芝酸的积累。将CGMCC5.0026双核菌株和v+s杂交菌株进行栽培,分析子实体发育不同阶段:菌包中的菌丝-菌皮、原基、成熟子实体中灵芝酸的含量。研究发现,v+s菌株菌皮中单体灵芝酸GA-T、GA-S、GA-Me含量分别为21.456±5.659、2.045±0.929、7.124±0.491μg/100 mg细胞干重,分别是对照CGMCC5.0026菌株的3.38、8.78、1.73倍。v+s菌株原基中单体灵芝酸GA-N、GEA-E、GA-A、GEA-D、GA-F含量分别为66.481±6.26、6.864±0.883、126.993±33.241、57.972±10.554、34.96±3.236μg/100 mg细胞干重,分别是对照CGMCC5.0026菌株的1.52、1.66、1.43、1.53、1.57倍。v+s菌株成熟子实体中单体灵芝酸GA-I、GA-B、GA-K、GA-A、GAH、GA-F含量分别为31.147±2.167、20.719±0.687、22.446±2.94、43.654±1.924、47.677±5.369、60.568±3.281μg/100 mg细胞干重,分别是对照CGMCC5.0026菌株的1.8、2.5、2.12、1.8、1.99、1.61倍。结果表明,基因工程结合杂交育种不仅可以提高菌丝中灵芝酸的含量,也可提高子实体中灵芝酸的含量。我们首次使用基因工程结合杂交育种的方法提高灵芝菌丝和子实体中灵芝酸的含量,发现灵芝酸含量的提高可能与中间代谢产物的积累和相关基因转录水平的上调密切相关。本研究为灵芝和其他担子菌的育种提供了一种新的方法,对于高效生产灵芝酸也具有重要的意义。

关键词： 基因工程抗体   真菌毒素   新烟碱类杀虫剂   免疫层析   双特异性抗体  

摘要： 农药残留和真菌毒素污染是农产品在生产、储藏、加工和销售过程中的重要隐患。噻虫啉(Thiacloprid,TCL)因其广谱、高效的性质,在农产品生产中应用广,残留高。赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)作为典型真菌毒素,危害性强,污染范围广,在谷物和果蔬类农产品中均有残留。但是对于同时检测这两种有害物的研究较少,因此,建立能够快速检测这两种污染物的方法非常重要。目前较为常见的快检产品多为基于传统免疫抗体的单一组分检测,无法实现对农药和毒素的同时检测,且抗体制备复杂、周期长。基于基因工程重组技术制备的双特异性抗体识别元件很好地解决了上述问题,可以在体外快速表达,实现跨类有害物同步检测。本论文基于大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115表达了噻虫啉单链抗体(single-chain variable fragment,scFv),基于哺乳动物细胞Expi293F表达了噻虫啉单链抗体、全长抗体(immunoglobulin,IgG)、噻虫啉和赭曲霉毒素A双特异性抗体(bispecific antibodies,Bs Abs),对比了不同宿主和抗体形式对抗体产量和活性的影响。制备了基于IgG抗体的时间分辨荧光免疫检测试纸条,基于双特异性抗体建立了噻虫啉和赭曲霉毒素A竞争ELISA检测方法。主要研究和结论内容如下:(1)基于不同表达系统制备噻虫啉的scFv和IgG抗体,并比较抗体产量和活性。分别设计了大肠杆菌表达载体p ET-28a-scFv、毕赤酵母表达载体p PIC9K-scFv、哺乳动物细胞表达载体p CMV-scFv、哺乳动物细胞重链表达载体p CMV-HC和哺乳动物细胞轻链表达载体p CMV-LC,将质粒分别在大肠杆菌BL21、毕赤酵母GS115和哺乳动物细胞Expi293F中表达。结果表明在大肠杆菌BL21、毕赤酵母GS115和哺乳动物细胞Expi293F中表达的scFv抗体产量分别为7、3.2和1.6 mg/L。基于BL21生产的scFv抗体几乎无活性,基于GS115生产的scFv抗体活性较差,基于Expi293F表达的scFv抗体构建ELISA标准曲线,IC为14.87 ng/m L。通过Expi293F表达的IgG抗体产量约35mg/L,活性最佳,亲和常数为1.2 x 10 L/mol,在最佳条件下基于IgG抗体构建的ELISA检测标准曲线IC为2.63 ng/m L。通过比较三种表达系统及抗体形式对抗体产量和活性的影响,得出哺乳动物细胞Expi293F中表达的IgG抗体产量最高,活性最好。(2)基于前面构建的基因工程IgG抗体,合成制备抗原,创新时间分辨荧光免疫检测方法,并在食品中进行应用。研发噻虫啉荧光免疫检测试纸条,在0.01-10 ng/m L线性范围内,线性方程为y=-19.113log X+62.038,IC为4.268 ng/m L,检测限(limit of detection,LOD)为0.003 ng/m L。批内和批间的变异系数分别为0.40%和5.18%,具有高灵敏度和稳定性。与结构类似物啶虫脒的交叉反应率为19.27%,分子对接结果表明啶虫脒和噻虫啉结构中的氰基会与抗体的ILE-100残基形成氢键。应用于果蔬食品的检测回收率为79.4%-118.6%,高效液相色谱串联质谱(High Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry,HPLC-MS)回收率为92.1%-107.6%,该方法具有良好准确性。(3)设计双特异性抗体表达载体,建立噻虫啉和赭曲霉毒素A同步ELISA检测方法。设计大肠杆菌BL21表达载体p ET-28a-OTA和哺乳动物细胞Expi293F表达载体pc DNA3.1-OTA-TCL,分别在BL21和Expi293F中表达,通过分子对接探究赭曲霉毒素A、噻虫啉与双特异性抗体间的识别作用。结果发现,表达的OTA纳米抗体产量约为8.6mg/L,亲和常数为2.3 x 10 L/mol,竞争ELISA标准曲线的IC为22.65 ng/m L。双特异性抗体产量约为2 mg/L。检测噻虫啉的线性范围为0.05-1000 ng/m L,LOD和IC分别为0.337和17.10 ng/m L。在0.05-500 ng/m L线性范围内,检测赭曲霉毒素A的ELISA试剂盒IC为16.69 ng/m L,LOD值为0.788 ng/m L。在葡萄样品中检测TCL和OTA的加标回收率分别为77.9%-125.5%和76.2%-87.0%,方法准确性较好。综上,本研究通过三种表达系统,比较分析了不同宿主和抗体形式对抗体产量和活性的影响,获得了噻虫啉scFv、IgG抗体和双特异性抗体。并构建快速检测试纸条和同步检测试剂盒,实现污染物跨类同步检

关键词： 有机磷农药   半抗原   分子模拟对接   突变改造   基因工程抗体  

摘要： 有机磷农药(Organophosphorus pesticide,OPs)指含有磷元素的有机化合物农药,在农业生产中被广泛用于作物病虫、草的防治,由于有机磷农药种类多且易于在果蔬中残留,因此容易造成累积毒性危害。目前对有机磷农药残留的检测分为定性与定量检测方法。主要为仪器分析方法和免疫检测方法。仪器分析方法检测灵敏度高、适用于基于标准品的定量检测,而免疫检测方法简便、快速、检测成本低,适用于现场的快速定性检测。免疫学检测方法是基于抗原抗体特异性反应实现对目标物的识别检测,制备高灵敏的抗体是实现有效检测的前提。本研究首先通过计算分析小分子半抗原结构,筛选、设计最优的半抗原结构作为抗原表位;对获得的单克隆抗体可变区进行三维结构建模与分子模拟对接,找出关键氨基酸与分子间作用力,为抗体的体外进化与突变改造提供理论基础;而后对抗体进行了突变表达,获得了重组基因抗体,并验证分析突变前后抗体的活性变化情况。主要研究结果如下:(1)有机磷农药半抗原结构设计:有机磷农药小分子基本结构通过Pub Chem获得。使用高斯软件对小分子进行量化计算并进行最优构型比对、分子表面静电势分析、红外光谱表征。结果表明,有机磷共性结构部位(乙氧基)的静电势能表面极值点的分布范围为-27.86～23.18 kcal/mol:半抗原1在共性结构静电表面与有机磷的区域性相似度更高,且HOMO-LUMO Gap的值较低(5.30948817),红外光谱杂峰少,为最优半抗原结构。(2)抗体活性结构建模及其识别机制理论分析:采用I-TASSER对所获得的单克隆抗体可变区氨基酸序列进行三维结构建模,并使用Autodock vina和CB-DOCK2两种对接软件对抗体和十三种小分子(含半抗原)进行分子模拟对接,对不同药剂活性分析结果表明,抗原在抗体口袋区的结合姿态,抗原抗体间不同的分子间作用力和静电表面,是抗体对不同药物识别差异的理论基础。(3)抗体识别活性结构关键结合氨基酸位点突变分析:在抗体结合抗原的口袋区域,从提升抗体静电引力,同时增强抗体结合抗原有机磷的共性结构部分的分子间作用力的两个角度进行关键识别氨基酸的突变,两种突变方向均采用了氨基酸单点突变和双位点突变,并对突变后的结果进行了分子模拟对接验证,筛选出了四种突变方式进行基因工程抗体表达。抗体可变区的突变方式如下:ILE95→GLU95、ILE95→GLU95&GLY164→ASP164、PRO41→GLN41、PRO41→GLN41&95 ILE→GLN95。上述突变抗体依次命名为突变抗体1、突变抗体2、突变抗体3、突变抗体4。(4)基因工程抗体的表达及活性验证:使用CHO-K1真核细胞表达体系对突变抗体进行真核表达,经引物PCR、基因重组、菌落筛选、质粒抽提和细胞的电转表达,表达共获得了4个突变抗体。经试验验证,四种突变抗体对半抗原、三唑磷、苯硫磷、乙拌磷、甲基对硫磷、除线磷和伏杀硫磷等7种有机磷小分子的识别灵敏度有整体性提升效果,IC提升范围为1.57～6.28倍。对辛硫磷、甲拌磷、喹硫磷的识别灵敏度无明显提升。结果表明,本研究所采用的抗体突变策略可有效提升有机磷广谱型识别抗体对多种农药的识别灵敏度。(5)蔬菜中的检测应用:选用突变抗体3与白菜和茄子两种蔬菜基质,采用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)对蔬菜真实样本中的有机磷农药进行检测。在优化有机溶剂含量以及提取液稀释倍数的基础上,对蔬菜样本进行加标回收率和变异系数计算。结果表明,方法在白菜和茄子蔬菜样本中的添加回收率分别为71.2%～129.7%、78.4%～122.2%,变异系数分别为1.3%～7.5%、0.8%～6.2%,说明建立的方法在实际样本检测中有较好的效果。综上所述,本研究通过所采用的半抗原量化计算模拟分析方法,综合分析十余种有机磷类化合物的相关性质,并基于此,分析四种有机磷半抗原的结构性质,筛选出最优结构的半抗原。再利用此半抗原所免疫获得的单克隆抗体进行氨基酸位点定点突变,提高了抗体对农药的识别灵敏度。实现了对蔬菜中多种有机磷农药的检测。本研究所采用的半抗原筛选策略与抗体突变策略均有良好的效果。

关键词： ASFV   防控   减毒疫苗   基因工程疫苗  

摘要： 非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的影响家猪和野猪最具破坏性的出血性传染病之一。自2018年在中国暴发以来,给我国的养猪业造成巨大的经济损失。非洲猪瘟病毒(ASFV)属于大型双链DNA基因组,其中包含167个阅读框,可以编码多种蛋白质。目前我国的ASF防控形势不容乐观,疫苗研究对ASF的整体防控具有重要意义,而市场也急需安全有效的ASF疫苗。一直以来关于ASF疫苗研究从未间断,在科研人员的不断努力下,一些试验性疫苗开始表现出效果。本文主要对近年来非洲猪瘟的疫苗研究展开综述,旨在为ASFV的深入了解与ASF防控提供参考。

关键词： 病毒样颗粒   表达系统   免疫机制   纳米颗粒   基因工程疫苗  

摘要： 病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)是由一个或多个病毒衣壳蛋白(capsid protein,CP)自组装形成的多聚体纳米颗粒,其结构类似于天然病毒颗粒,但因缺乏病毒复制的基因组而不具有传染性。VLP免疫原性高,即使在没有佐剂的情况下也能诱导机体产生高效的免疫反应,因此出现了一系列基于VLP为抗原的候选疫苗,用于预防多种传染性疾病,被认为是国际上最安全、最有效的理想疫苗。现就VLP的类型、结构、免疫机制、表达纯化及其在疫苗中的应用等方面作一概述。

关键词： 小反刍兽疫   基因工程   疫苗  

摘要： 小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种高度接触性传染病,发病率和死亡率极高,给世界各国养殖业发展带来严峻的挑战。目前,疫苗接种是控制该病的关键策略,随着生命科学研究的不断发展,基因工程苗的研究逐渐成熟,优点也不断显现出来。因此本文对PPR基因工程疫苗的最新研究进展进行了综述,以期为今后的科研提供新的视角和方向。