关键词： 手足口病   肠道病毒71型   病理学   逆转录-聚合酶链反应   中和抗体   鼠适株   杆状病毒表达系统   类病毒颗粒   基因工程疫苗  

摘要： 手足口病（Hand,foot and mouth disease, HFMD）是由肠道病毒感染引起的一种严重的传染病，并呈现逐年高发态势。近年发现HFMD主要病原体为肠道病毒71型（Enterovirus71, EV71），儿童为EV71易感人群。儿童感染EV71后临床表现形式多样，除典型的HFMD外，还常表现出严重的中枢神经疾病及肺水肿和/或肺淤血等并发症，严重的甚至导致死亡。目前对于EV71感染引发HFMD的发生发展过程尚不清楚，且缺乏有效的预防及治疗方法，常导致临床医疗严重后果的发生，因此明确HFMD病原，全面分析EV71感染后病理改变，探讨发病机理，以及研发安全、有效的HFMD疫苗成为预防和控制HFMD疾病暴发的有效手段之一。据此，本论文从一例疑似HFMD的死亡案例出发，从法医病理学、分子病毒学、动物实验等几个方面对该病例及其致病病原EV71进行了深入的研究，具体内容有以下五个章节。 第一章以文献综述的形式介绍了HFMD及EV71的研究背景，主要包括HFMD的流行情况，其主要病原体EV71的病毒学特点，流行病学研究，致病机理研究，EV71感染的临床诊断和治疗，疫苗的研究现状，实验动物的选择以及杆状病毒表达系统的原理、技术路线及其作为基因工程疫苗载体的研究进展等。最后说明了本论文研究的内容及意义。 第二章利用常规法医病理学分析方法，对一例疑似HFMD致死案例进行了分析，发现CNS病变明显，神经细胞坏死、胶质小结形成、炎细胞呈袖套样浸润，肺水肿显著、炎症突出，确认死因为病毒性脑炎及病毒性肺炎导致的急性呼吸、循环功能衰竭。在此基础上利用RT-PCR技术，以国家CDC指导的EV71通用检测引物，证实病原体为EV71。随后针对EV71保守区设计特异性引物进行巢式PCR扩增，检测了各病理组织的病毒载量;利用抗EV71VP1蛋白的特异性多克隆抗体对石蜡切片进行免疫组织化学染色检测了病毒抗原的组织分布。结果显示此病例脑组织EV71病毒载量相对较高，其中脑干和颈髓最高;病毒抗原检测阳性主要集中在CNS的神经细胞及炎细胞，为病毒感染复制的主要部位;肺组织虽病变明显，水肿/淤血突出，但病毒核酸及抗原阴性，并非病毒主要感染复制部位;第三章自病毒载量最高的脑干组织出发，在体外RD细胞上进行病毒的分离、传代及空斑纯化，通过一步法生长曲线的方法了解不同株纯化病毒的感染性差异，同时利用EV71-VP1基因的序列对病毒株进行基因分型。筛选出一株纯化病毒，扩增出核酸序列进行分段克隆，获得EV71病毒的全基因组，并提交GenBank。结果显示：脑干组织能成功分离到EV71-xf活病毒，在RD细胞上能产生肠道病毒特异性致细胞病变效应（Cytopathic effect, CPE），透射电镜能观察到大小均匀、形态一致、直径约20～30nm的EV71病毒粒子。经空斑纯化后的四株病毒在体外RD细胞上感染性基本无差别，VP1测序结果显示均为C4亚型;完成了一株病毒的全基因组测序，基因组全长为7405bp，GenBank登录号(Accession number)为JQ804832，基因组序列提示此次感染病毒仍为国内流行株C4亚型，全基因组序列的测定将有利于后续的深入研究。 第四章对纯化的EV71-xf病毒进行了建立小动物感染模型的初步摸索。通过颅腔注射（Intracranial injection, IC）的途径使1日龄Balb/c小鼠感染EV71-xf病毒，观察其表现，隔周采血对血清特异性抗体IgG及中和抗体进行检测，同时分离鼠脑组织中病毒再次接种1日龄小鼠，获得鼠适性毒株。结果发现1日龄Balb/c小鼠能通过IC途径感染EV71-xf，但无明显的神经系统受累表现;血清抗体IgG在感染两周后较高，但仍处于亚中和抗体水平;IC二次感染可以刺激小鼠产生更高浓度IgG，并在RD细胞上表现出较好的特异性及交叉性中和保护作用;母传抗体的中和保护作用较强，但时间短暂，约4w龄时其保护作用消失;反复多次鼠脑适应，可以得到感染性增强的鼠适株EV71-xf/A/J/Q，但其毒力情况还需进一步研究。 第五章利用杆状病毒表达系统开展了EV71基因工程疫苗的初步研究。将编码EV71-xf的P1和3CD蛋白的基因分别克隆至pFastBac-Dual载体的启动子pPh和pP10下游的多克隆位点，构建重组pFastBac Dual-EV71-xf-3CD-P1质粒。重组质粒与杆状病毒Bacmid转座后获得重组Bacmid Bac-EV71-xf-3CD-P1。提取重组Bacmid DNA转染昆虫Sf9细胞，获得重组病毒，重组病毒感染昆虫细胞后，表达的前体蛋白P1在蛋白水解酶3CD的剪切后自组装为病毒样颗粒（Virus Like Particle, VLPs），经蔗糖及氯化铯密度梯度离心进行初步的

关键词： 基因工程   小麦品种   同源染色体   连接酶   DNA   细菌质粒   离体培养   多倍体育种   转基因技术   等位基因   受体细胞   抗锈病   目的基因   杂交育种  

关键词： 基因工程   疫苗  

摘要： 基因疫苗的研制主要针对一些严重威胁人类健康的重大疾病,如癌症、艾滋病、自身免疫性疾病、心脑血管疾病、神经障碍性疾病、呼吸系统疾病、糖尿病和遗传病等.传统疫苗主要包括减毒活疫苗、灭活疫苗和用某些成分制成的亚单位疫苗.现代生物技术的发展为疫苗的研制带来了新的机遇,人们可以通过重组DNA技术克隆表达保护性抗原基因,利用表达产物或重组体制成疫苗.

关键词： PRV细菌人工染色体   猪细小病毒   猪圆环病毒2型   基因工程疫苗  

摘要： 伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)、猪细小病毒（Porcine parvovirus, PPV）、猪圆环病毒2型（Porcine circovirus Type2, PCV2）是危害当今养猪业的三种重要病原，分别引起猪的伪狂犬病、猪细小病毒病与猪圆环病毒2型病。猪伪狂犬病和猪细小病毒病是以引起猪群发生繁殖障碍为特征的传染病，在我国很多猪场流行，严重制约了养猪业的发展。猪圆环病毒2型与猪多种疾病综合征有关，尤以仔猪断奶后多系统衰弱综合征危害最大，目前呈世界性分布，给养猪业生产造成了巨大的经济损失。 伪狂犬病毒具有宿主范围广、不感染人、基因组容量大，含多个可缺失的非必需基因、重组病毒稳定的特点，加之猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗的成功应用，以PRV为载体表达其它病原主要免疫原性蛋白质构建重组伪狂犬病毒成为基因工程疫苗的研究热点，尤以PRV-Bac系统最为便捷。 本研究在TK基因缺失的PRV ZJ株Bac的基础上插入PPV VP2和PCV2Cap基因，旨在研制PRV、PPV、PCV2三联基因工程疫苗，通过口蹄疫病毒2A基因将PPV VP2基因和PCV2Cap基因串联，得到VP2-2A-Cap（V2C）基因，将其插入pEP-CMV-in转移载体构建pEP-V2C-in重组表达质粒，再通过Red E/T两步重组法构建了pPRV-V2C-ΔgE和pPRV-ΔgE突变体，该突变体用磷酸钙法转染BHK-21细胞获得重组病毒rPRV-V2C-ΔgE和rPRV-ΔgE。Western blot分析表明rPRV-V2C-ΔgE能在BHK-21细胞内表达融合蛋白VP2-2A-Cap，且目的蛋白能被2A蛋白裂解为64ku和28ku两个片段。重组病毒生长曲线和噬斑大小测定结果显示rPRV-V2C-ΔgE在BHK-21细胞中的增殖滴度与亲本株rPRV无显著差异，表明外源基因的插入不影响rPRV的增殖。本研究为PRV、PPV和PCV2三联重组活载体疫苗的研制奠定了基础。

关键词： 河豚毒素   单链抗体   噬菌体展示  

摘要： 河豚毒素(TTX)是一种小分子量的、胍盐神经毒素，它主要通过抑制神经或肌肉组织的钠离子(Na)电压门控通道起作用，从而导致神经麻痹、呼吸困难甚至是死亡。但是到目前为止，针对河豚毒素的有效的、快速灵敏的检测方法还没有出现，而发展针对河豚毒素的免疫学方面的检测方法是非常有必要的。在本试验中，我们首先通过一种化学方法(曼尼希反应)来制备了河豚毒素的完全人工抗原(TTX-BSA：作为检测用抗原;TTX-KLH：作为免疫用抗原)，并且采用了小量的、重复的免疫方式，实验组总共免疫了3只Balb/c小鼠。从免疫好的小鼠的脾脏中提取其全RNA，并反转录合成cDNA的第一条链，以此作为模板通过常规的PCR反应扩增了抗体的重、轻链的可变区基因(V和V)，配以适当分子数的Linker((GS))，通过重叠延伸PCR组装成了一个可以无限制编码抗河豚毒素(TTX)的重组的单链抗体(scFv)基因。通过噬菌体展示技术，构建了一个依托于噬菌体质粒载体pCANTAB-5E的噬菌体展示文库。在经过辅助噬菌体M13KO7的再感染后，单链抗体就会展示在噬菌体的表面，然后再经过六轮的淘选过程，我们获得了可以和河豚毒素(TTX)特异性结合的抗体，并通过间接ELISA对其进行了定量的分析，选定其中的一株亲和力最高的单克隆(scFv-T53)进行了单链抗体的可溶性表达和各方面性质的分析研究，通过间接ELISA测定选定的单克隆的亲和力常数为1.1×10L/mol。我们还通过生物信息学的手段，分析了scFv-T53的基因序列、氨基酸序列，预测了scFv-T53的可变区的划分、二级结构、物理化学性质等。各种分析结果表面。本实验成功的从构建的噬菌体抗体库中筛选得到了特异的抗河豚毒素(TTX)的单链抗体。

关键词： RHDV-vp60   家蚕-杆状病毒表达系统   抗原表达   基因工程疫苗  

摘要： 兔出血症(rabbit hemorrhagic disease，RHD)是由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic diseasevirus，RHDV)引起的一种高度接触传染性的急性致死病，给养兔业造成严重影响和经济损失。现行RHDV疫苗多为病兔肝脾组织制备的组织灭活疫苗或油乳剂灭活疫苗，存在诸多弊端。近年来，研究人员致力于RHD亚单位疫苗的研制。兔出血症病毒粒子的主要结构蛋白是衣壳蛋白VP60，是病毒免疫保护性抗原，在基因工程疫苗的研究中意义重大。 本文以NCBI中RHDV衣壳蛋白vp60基因序列(登录号：AF453761)为基础，对原序列进行密码子优化并人工合成。为制备检测RHDV-vp60真核表达产物所需的多克隆抗体，选取了vp60基因部分片段，PCR扩增后连接到克隆载体上pMD18-T。成功构建了原核表达使用重组质粒pET-28a-RHDV-vp60并转化表达菌BL21(DE3)，将重组菌置于37°C0.5mmol/L IPTG诱导表达4h后经SDS-PAGE分析，在分子量约为26kDa处出现目的蛋白带,与预期蛋白分子质量相符。质谱结果表明，该蛋白序列与理论相符。纯化的重组蛋白免疫兔制备多克隆抗体，ELISA结果显示在抗原浓度为2μg/mL时多抗的效价可达1：6400，可用于检测RHDV-vp60在家蚕中的表达。 将优化后的vp60序列定向连接到真核表达所用转移载体pVL1393上，鉴定后得到重组质粒pVL-RHDV-vp60，将病毒Bm-BacPAK6DNA进行线性化处理后，与pVL-RHDV-vp60共转染家蚕Bm-N细胞。成功发生同源重组后获得重组病毒reBm-RHDV，用其感染家蚕5龄幼虫，酶联免疫吸附法对家蚕中VP60蛋白进行检测并筛选表达量高的重组病毒株，用该病毒株同时感染家蚕5龄幼虫和蚕蛹，收集幼虫血淋巴，超速离心纯化后进行电镜观察，结果表明RHDV衣壳蛋白基因在家蚕中得到了较高水平的表达，真核表达蛋白形成类病毒空衣壳粒子。 将蚕蛹制成疫苗后免疫家兔，ELISA法检测免疫兔体内抗血清的变化，结果显示类病毒空衣壳粒子有效地刺激机体产生特异性抗体，病理检测结果表明免疫后家兔未出现不良副反应，疫苗安全性好。本研究为制备安全有效的RHD基因工程疫苗、研制诊断试剂盒、研究病毒粒子的形成和病毒与细胞受体的相互关系等奠定基础。

关键词： 血凝素   核酸疫苗   免疫应答反应   真核表达质粒   糖基化   基因工程疫苗   血清学调查   内源性表达   流感大流行   保护性抗原   种属特性   疫苗接种   位点   外源基因   宿主   免疫状态   免疫系统   免疫反应   机体   构建  

摘要： 核酸疫苗是利用病原的保护性抗原构建真核表达质粒,再将质粒DNA导入机体细胞,使外源基因借助于机体内源性表达系统表达并提呈给宿主免疫系统,诱导产生特异性的免疫应答反应的新型基因工程疫苗.1.3.1 Kodi血凝素lli等文中构建了编码H5N1人流感分离株A/HK/156/97血凝素的核酸疫苗,动物实验表明该疫苗诱导小鼠产生了抗H5N1感染的免疫反应,对在血凝素第154位没有糖基化位点的人A/HK/156/97(H5N1)病毒和在血凝素第154位具有糖基化位点的鸡A/Ck/HK/156/97(HSN1)病毒均具有抗性[11].DNA免疫还具有高度安全稳定,不受宿主种属特性及免疫状态限制和不干扰血清学调查的特点,而且DNA疫苗接种还被认为是消灭和控制流感大流行的一种快速、有效的方法[12].

关键词： IBDV   重组Vp2蛋白   基因工程疫苗   免疫保护试验  

摘要： 传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是引起我国及世界养禽业经济损失严重的主要传染病之一。目前,使用的常规弱毒疫苗和灭活疫苗的安全性和制造工艺存在缺陷,而为预防变异毒株采用的中强毒力活疫苗存在着较大的生物安全问题。因此,在当前IBD防控工作中,亟需免疫效力强、生物安全性高,并且针对当前流行毒株的新型IBD基因工程疫苗的问世。本试验内容包括两个部分： 试验1：重组IBDVVp2蛋白的制备 将本实验室前期构建的高效表达IBDVVp2的重组杆状病毒vBacA-Vp2(P3代)接种Sf9昆虫细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)检测,出现特异性荧光;用IBDV抗体夹心ELISA检测,呈阳性反应;用Western-blotting分析,在53ku处有一条特异蛋白条带;电镜观察,重组Vp2蛋白能组装成病毒样颗粒。优化重组Vp2蛋白的表达条件,在感染前一天预铺Sf9细胞,待细胞密度达90%时,接种不同接毒量的vBacA-Vp2,分别于72、96和120h收集细胞培养物,用IBDV双抗体夹心ELISA测定细胞培养物效价。结果表明接种vBacA-Vp2的接毒量为0.01,表达时间为72h,收集的细胞培养物中重组Vp2蛋白含量最高,抗原效价达3.2×103。用优化的重组Vp2蛋白表达条件,接种vBacA-Vp2,收集细胞培养物,大量制备重组Vp2蛋白,为研制新型高效IBD病毒样颗粒基因工程疫苗制备抗原。 试验2：重组IBDVVp2蛋白的免疫保护试验 将重组杆状病毒vBacA-Vp2感染的昆虫细胞裂解物分别与ISA206、ISA50和白油三种佐剂乳化制成抗原,免疫2周龄SPF鸡,一次免疫14d后,ELISA方法检测抗体效价,结果ISA206和IBDV B87株免疫组之间无显著差异(P>0.05),但均显著高于其他组(ISA50、白油和空白对照组)(P<0.01),细胞中和试验测定,ISA206组中和抗体效价显著高于其它4组(B87、ISA50.白油和空白对照组)(P<0.01)：二次免疫14d后,ELISA方法检测抗体效价,结果ISA206组显著高于其他组(B87、ISA50、白油和空白对照组)(P<0.01),而白油、ISA50和B87株免疫组之间没有显著性差异(P>0.05),细胞中和试验测定,ISA206组中和抗体效价显著高于其它4组(B87、ISA50、白油和空白对照组)(P<0.01)：用IBDVAH1强毒株对各免疫保护组进行攻毒试验,ISA206、白油和B87株免疫组攻毒存活率为1000%,ISA50组攻毒存活率为80%,空白对照组全部死亡。实验观察7d内,ISA206、白油组免疫保护鸡未显任何临床症状和病理变化。本实验制备的病毒样颗粒重组Vp2蛋白在研制新型IBD基因工程疫苗方面显示出了应用前景。

关键词： 动物医学   多克隆抗体技术   单克隆抗体技术   基因工程抗体   研究进展  

摘要： 人类自发现抗体来，就有规律的将抗体基因的序列加以改变，让抗体和与之有关联的产品能够在大多数动物诊断疾病与治疗过程中发挥出巨大的作用。近些年来，随着我国现代生物技术的快速发展，我国的抗体工程技术也取得了较大的进步，同时在动物医学顿域占有非常重要的地位，是其它技术所不能取代的。本文将通过多克隆抗体技术、单克隆抗体技术、基因工程抗体技术等进一步来研究抗体在动物医学中的研究进展。

关键词： 葡萄球菌肠毒素   胚系可变区基因   基因工程抗体   二硫键稳定  

摘要： 葡萄球菌肠毒素（Staphylococcal enterotoxins,SEs）是由血浆凝固酶、耐热核酸酶阳性葡萄球菌产生的一组结构相关、毒力相似、具有超抗原活性的单链可溶性胞外毒蛋白，可引发食物中毒和部分免疫性疾病。目前，已发现21种不同血清型葡萄球菌肠毒素，但对新型肠毒素蛋白的结构及功能尚缺乏深入认知，尤其受到传统抗体制备技术的制约，使得在葡萄球菌肠毒素超抗原活性分析、分型检测、预防治疗等方面的研究进展缓慢。本研究设计并构建Anti-SEs抗体轻重链可变区基因的单启动子真核共表达载体，分别于轻重链C-端引入半胱氨酸残基，结合细胞内肽段自组装原理形成链间二硫键，模拟天然抗体的抗原结合域空间构象，从而成功制备特异性高、亲和力强的Anti-SEs新型基因工程重构抗体。 克隆6株Anti-SEs单抗杂交瘤细胞轻重链可变区基因，测序结果表明，所获基因均符合小鼠抗体轻重链可变区经典结构特征，且为功能性V（D）J基因重组模式，但2C2株抗体重链可变区D-gene与IMGT数据库现有序列家族不同，为未定型的新家族成员。经同源性分析比较，六种轻链可变区氨基酸序列完全相同，而重链可变区序列亲缘关系较远，推测重链可变区在葡萄球菌肠毒素抗原识别特异性、亲和力方面占主导作用，不同型葡萄球菌肠毒素更易刺激重链基因重排而形成主要抗原结合位点。另外，超抗原抗体在特征氨基酸数量及位置上有别于普通抗体。 通过重叠PCR，拼接ivs-IRES及轻链可变区序列，插入pcDNA3.1-VH重组载体质粒，构建轻重链可变区基因单启动子真核共表达载体p2C2HILO、p5C12HILO，经Lipo2000脂质体介导转染BHK-21细胞后，筛选获得两株稳定分泌Anti-SEs二硫键稳定抗体的哺乳动物细胞系。利用直接ELISA分别检测转染细胞培养上清和细胞裂解液，结果表明两株重构抗体主要为胞内可溶性表达;通过细胞间接免疫荧光及流式细胞术鉴定，重构抗体均能够识别天然肠毒素SEA及重组肠毒素SEA-his、SEG-his、SEK-his、SEO-his、SEQ-his、SEU-his。所获基因工程重构抗体可在葡萄球菌肠毒素的功能分析与检测鉴定、新型疫苗的研制、肿瘤细胞的靶向性治疗等领域发挥积极作用。