关键词： 基因工程   黏性末端   小麦品种   连接酶   多倍体育种   离体培养   等位基因   抗锈病   转基因技术   杂交育种   DNA  

关键词： 牛病毒性腹泻/黏膜病病毒   伪狂犬病毒   转移载体   重组病毒   基因工程疫苗  

摘要： 牛病毒性腹泻/黏膜病是危害养牛业健康发展的重要疫病之一，世界动物卫生组织将其列入必须通报的动物传染病。牛病毒性腹泻病临床表现形式复杂、多样，使其预防和控制难度加大。虽然疫苗接种是预防该病的有效途径，但国内目前还没有商品化的牛病毒性腹泻疫苗可供使用，所以研发一种安全、高效的牛病毒性腹泻疫苗是预防和控制该病的主要发展方向。目前，以伪狂犬病毒为载体的新型活载体疫苗已在动物疫病的预防控制中得到了广泛的研究和应用，并显示出其显著的优越性。基于此，本研究在对牛病毒性腹泻病毒甘肃流行株BVDV/GS01/2010分离鉴定的基础上，开展其E2结构蛋白的二级结构、抗原表位等的预测及其同源性和遗传进化分析，重点构建猪伪狂犬病毒gE/TK基因缺失载体，旨在获得牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的gE-/TK-重组伪狂犬病毒。具体如下： 1.利用MDBK细胞从疑似患牛病毒性腹泻病牛的血液中成功分离出一株流行于甘肃省甘南藏族自治州的能致细胞病变的牛病毒性腹泻病毒株，将其命名为BVDV/GS01/2010，并用该病毒人工感染健康犊牛，成功复制出牛病毒性腹泻病例。同时应用生物信息学技术对该分离株病毒的5′-UTR核苷酸序列进行同源性比较和系统进化分析。结果表明，本研究分离的牛病毒性腹泻病毒属于具有致细胞病变效应的BVDV-1生物型，与靶动物病例复制的结论一致。 2.应用RT-PCR技术对BVDV/GS01/2010分离株编码结构蛋白的E2基因进行扩增、克隆和测序，并应用生物信息学软件对其核苷酸和氨基酸序列的同源性、蛋白质亲水性、抗原表位、二级结构等生物学特征进行预测和分析。结果表明：BVDV/GS01/2010/China株E2结构蛋白的二级结构丰富，含有较多的潜在抗原表位，包括21、134、313、586、7903、14481、22449、30216、32125、33242和36975aa区段。同源性分析表明：本实验分离的BVDV与GenBank中登陆的BVDV-1分离株E2基因序列同源性在74.1%8.0%，推导的氨基酸序列同源性在76.9%0.6%之间;系统发生分析发现本研究分离株与1-NADL、Singer-Arg、OregonC24V、Shihezi株亲缘关系较近。 3.将伪狂犬病毒BarthaK61株TK基因的左右两条同源臂TKR、TKL以及筛选标记基因EGFP分别定向插入到pQCXIX载体中，成功构建了带有筛选标记基因EGFP的pTK-/EGFP通用转移载体，这为基于伪狂犬病毒毒力缺失基因工程疫苗研制奠定了基础。 4.将BVDV/GS01/2010株的E2基因插入到伪狂犬病毒TK缺失通用转移载体pTK-/EGFP中，形成含有BVDVE2基因的转移质粒pTK-/EGFP/E2，然后将该转移质粒与PRVBarthaK61株基因组DNA共同转染BHK-21细胞，经多轮挑斑纯化以及TK、gE缺失基因和E2、EGFP基因的PCR鉴定，得到PRV/gE-/TK-/EGFP/E2重组病毒。该研究为进一步研制牛病毒性腹泻与伪狂犬病二联基因工程疫苗奠定了坚实的基础。

关键词： 人源化单克隆抗体   磁珠分选   巢式PCR  

摘要： 抗体技术是现代生命科学中一项不可或缺的技术，它在基因研究、蛋白质的结构与功能研究和免疫学诊断等方面起着至关重要的作用。Kohler和Milstein等于1975年利用杂交瘤技术将骨髓瘤细胞同产生抗体的B淋巴细胞融合，成功的建立了单克隆抗体制备技术。而后单克隆抗体技术的又一项重要技术，基因工程抗体技术，其代表是1994年Winter等创造建立的噬菌体抗体库技术。基因工程抗体主要包括两种，一是对已有单克隆抗体进行人源化基因工程改造得到抗体，另一种是通过抗体库技术得到的完全人源化抗体。目前，基因工程抗体已在疾病预防、诊断、治疗等方面广泛应用。 本实验将通过偶联P24抗原的磁珠分选特异性分泌P24抗体的B细胞，有限稀释后，提取总mRNA，采用逆转录和巢式PCR扩增免疫球蛋白重链和轻链基因，经测序鉴定后克隆到真核表达载体中;通过瞬时转染293T细胞得到重组抗体;使用proteinA亲和层析纯化抗体。使用该方法，建立起新型人源化单克隆抗体制备技术平台。然后将此方法用于抗EV71VP1的人源单克隆抗体的制备，使用耦联EV71VP1抗原的磁珠对手足口病人血进行特异性细胞分选，得到分泌EV71VP1特异性抗体的B淋巴细胞。同样，有限稀释后，提取总mRNA，采用逆转录和巢式PCR扩增免疫球蛋白重链和轻链基因，经测序鉴定后克隆到真核表达载体Cloning vector AbVec-hIgG1、Cloning vector AbVec-hIgKappa、Cloning vectorAbVec-hIgLambda中。通过瞬时转染293T细胞得到重组抗体。结果，成功筛选到5对抗HIV-1P24的人源单克隆抗体基因和1对抗EV71VP1的人源单克隆抗体基因，并纯化出2例有效的抗HIV-1P24抗体。 本研究初步成功地建立了人源化单克隆抗体的筛选方法，为HIV、EV71早期诊断以及筛选其他人源化单克隆抗体奠定了基础。

关键词： 破伤风   基因工程   免疫功能   中和抗体   BLISS法  

摘要： 破伤风是由破伤风梭状芽胞杆菌产生的破伤风外毒素引起的一种急性危重疾病。该致病菌在自然界中广泛存在,其产生的破伤风痉挛毒素毒性非常强烈,仅次于肉毒毒素。世界卫生组织报道,全世界每年约有100万人感染发病,在一些国家人感染破伤风后的死亡率仍可高达80％。联合国儿童基金会公布的文件表明在发展中国家,新生儿破伤风死亡率高达90%。任何年龄人群均可发生破伤风感染。　　由于注射破伤风疫苗后,人体不能产生持久免疫,而疫苗的运输、保存、经费等问题使加强免疫在发展中国家变得困难。即使大多数发达国家都对破伤风进行了加强免疫,但对人群的抗体水平检测结果却仍不乐观。目前破伤风的治疗仍以马血清破伤风抗毒素治疗为主,但作为异源蛋白,直到2008年我国仍有因使用该类抗毒素而引起过敏反应致死的病例。人破伤风免疫球蛋白是马血清抗毒素最好的替代品,但受血源来源限制和潜在污染病菌的威胁。　　目前随着抗体研究手段的不断发展,尤其是抗体库技术日趋成熟,为获得人源性抗破伤风毒素中和抗体提供了重要手段。本研究通过构建人破伤风免疫噬菌体单链抗体库,以TeNT-Hc为抗原对抗体库进行筛选,最终获得具有不同抗原结合表位、具有较好体内中和活性的抗体,为破伤风毒素中和表位的研究以及毒素中毒的预防、治疗提供帮助。　　实验从5名破伤风抗体滴度较高的健康献浆员外周血淋巴细胞中,提取总RNA,反转录获得cDNA。通过设计轻重链可变区框架引物,共扩增获得3组VH基因,4组Vκ基因,4组Vλ基因,采用重叠PCR法拼接扩增scFv片段,连入噬粒载体,电转构建库容为1×108的免疫噬菌体抗体库。随机挑取克隆进行菌落PCR及测序结果显示,抗体库具有很好的多样性和完整性。　　以表达纯化的TeNT-Hc蛋白为抗原,对噬菌体抗体库进行3轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选,从第3轮到第1轮抗体共富集170倍。通过阳性克隆的筛选及特异性鉴定,获得3株与TeNT-Hc具有很好特异结合活性的单链抗体27G、22D和S-4-7H。构建3株单链抗体原核表达载体并在大肠杆菌中表达。scFv均以包涵体形式表达,通过对包涵体的洗涤、纯化、复性,1L培养物经纯化后可获得4~6mgscFv蛋白。复性后的3株scFv均保持了特异结合活性。竞争ELISA法检测3株scFv抗原表位基本一致。非竞争酶免法检测scFv亲和力,3株scFv的亲和常数KD在1.25×10-7~2.31×10-7mol/L,以27G-scFv的亲和力最高KD=1.25×10-7mol/L。后续实验主要围绕27G-scFv展开。　　通过PCR定点突变的方法对27G-scFv进行二硫键稳定单链抗体的改造,获得27G-scdsFv,并构建大肠杆菌表达系统。通过对包涵体复性,27G-scdsFv保持很好的特异结合活性。SWISSMODEL三维模建结果显示,改构后的抗体二级结构与原单链形式基本相同,三维结构在VH和VL间成功引入二硫键,单链抗体由二聚体形式变为单体,达到了预期设想。稳定性检测,27G-scdsFv在储存时间和储存温度上较27G-scFv稳定性明显提高。非竞争酶免法检测27G-scdsFv的亲和常数KD(1/Ka)=0.93×10-7mol/L,略高于27G-scFv。27G-scdsFv在体外可以有效抑制TeNT-Hc与PC-12细胞的结合。　　利用哺乳动物细胞表达系统制备人源全分子抗体,构建27G全抗体的轻重链表达载体,并在CHO细胞中获得瞬时表达,表达量约100mg/L。表达的全分子抗体在非还原SDS-PAGE中表现为一条约150kD条带,在还原SDS-PAGE中表现为一条约25kD和一条约50kD条带,符合全抗体和轻重链片段大小。27G全抗体保持了与抗原TeNT-Hc特异性结合活性,亲和常数KD为2.38×10-9mol/L,与单链抗体相比,亲和力提高了约100倍。　　此外,针对TeNT-Hc与神经细胞结合的双受体多表位特点,多株具有不同表位的抗体联合使用可能发挥正协同效应。研究采用夹心法和固相竞争法筛选与27G具有不同抗原表位的抗体,最终获得了2株不同抗原表位的scFv:2-2D和S-4-7F。构建2株抗体的单链和全抗体表达载体,分别在大肠杆菌和CHO细胞中表达。表达产物均保持了与TeNT-Hc的特异结合活性。采用非竞争酶免法测定2-2D、S-4-7F全抗体的亲和常数KD分别为2.6×10-8mol/L和5.8×10-8mol/L。　　通过对TeNT-Hc与神经细胞结合原理的分析,实验初步分析了27G、2-2D和S-4-7F这3株抗体与抗原的结合表位。TeNT-Hc通过其W-pocket和R-pocket两个结合袋与神经细胞表面的神经节苷脂结合。两个pocket与神经节苷脂的不同成份结合,dotblot结果显示,TeNT-Hc与神经节苷脂GT1b和

关键词： 卡介苗   基因工程疫苗   结核病预防  

摘要： 卡介苗是一种传统的有效的预防结核病的疫苗之一.其医学价值与作用在医药界备受争议,因此对新的结核病疫苗进行研发已经成为了预防治疗结核病的主流趋势.文章主要针对传统的卡介苗以及多种基因工程疫苗在预防结核病的作用进行研究,进而分析出结核病的最佳预防方式.文章在进行科学的论证与分析之后得出结论,即基因工程疫苗是一种相对较为安全、有效的结核病疫苗.

关键词： 单链抗体   阿霉素   免疫偶联物   靶向药物   肝细胞癌  

摘要： 目的：构建全人源抗肝癌单链抗体原核表达载体,诱导表达获得有活性的单链抗体;利用葡聚糖为中介偶联单链抗体与化疗药物阿霉素以制备高效、小型化免疫偶联物;通过体内、外实验研究免疫偶联物的抗肿瘤效应,为肝癌的靶向生物治疗奠定基础。 方法：采用PCR等方法构建pET-21a(+)-SA3原核表达载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),利用诱导剂IPTG诱导单链抗体ScFv-SA3的表达,蛋白提取及纯化,Western-blot验证ScFv-SA3蛋白大小,间接ELISA验证单链抗体ScFv-SA3的抗体活性,细胞免疫化学检测ScFv-SA3对人肝癌细胞系HepG2的特异性结合作用;以氧化葡聚糖Dextran-T10为中介偶联单链抗体ScFv-SA3与阿霉素(ADM),制备ADM-Dex-ScFv-SA3免疫偶联物,间接ELISA检测偶联物的抗体活性;MTT、平板克隆及裸鼠移植瘤模型等体内、外实验研究ADM-Dex-ScFv-SA3的抗肝癌作用。 结果：成功构建pET-21a(+)-SA3重组载体,转化大肠杆菌原核表达体系后在IPTG诱导下表达可溶性单链抗体ScFv-SA3, SDS-PAGE验证蛋白大小为40KD;大量表达及纯化ScFv-SA3后,间接ELISA及细胞免疫化学检测到其具有抗体活性且对人肝癌细胞HepG2有特异性结合作用;以氧化Dextran-T10为中介介导ADM和ScFv-SA3形成稳定的免疫偶联物,其中ScFv-SA3:ADM摩尔比为1：14.21;体外实验MTT和平板克隆实验都显示偶联物ADM-Dex-ScFv-SA3对肝癌细胞生长抑制作用明显强于游离的ADM、ADM+ScFv-SA3,且对非靶细胞的毒性小于游离ADM;体内实验表明偶联物可明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,并能延长裸鼠的中位生存时间。总之,ADM-Dex-ScFv-SA3偶联物显示了较强的抗肿瘤效应。 结论： 1.成功构建了原核表达载体pET-21a(+)-SA3,诱导表达后纯化获得有活性的全人源抗肝癌单链抗体ScFv-SA3。 2.成功制备出以葡聚糖为中介的阿霉素和单链抗体免疫偶联物ADM-DEX-ScFv-SA3。 3.免疫偶联药物ADM-Dex-ScFv-SA3在体外可明显抑制肝癌细胞的生长;在体内可明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,且明显延长了裸鼠的中位生存时间。ADM-Dex-ScFv-SA3偶联物显示了较强的抗肿瘤效应。

关键词： 猪伪狂犬病毒   猪博卡病毒   猪细小病毒   重组伪狂犬病毒   单克隆抗体  

摘要： 疫苗免疫是预防猪病毒性疾病的重要手段,而且随着诊断技术的进步,发现混合感染是猪发病的一种常见形式,因此“一针防多病”是对疫苗研究提出的新要求。已报道利用PRV作为活病毒载体,将外源基因插入到PRV基因组中是多价苗研制的一种重要方法,并且取得了一定的防治效果。PRV和PPV都是导致母猪繁殖障碍性疾病的重要病原,给养猪业造成巨大经济损失。已知PPV对PCV-2导致的PMWS在临床症状表现上具有明显的增强作用,而PBoV’恰好又是在患有PMWS的仔猪中被发现的,同时有报道称PBoV与仔猪呼吸道感染以及仔猪腹泻等症状有关,但关于PBoV在疫苗研制上的研究还是空白。因此,以弱毒株伪狂犬病毒为载体,构建一株可以同时预防PRV、PBoV、PPV的重组病毒,是非常具有研究与应用价值的。而且目前在PBoV的诊断上方法较单一,主要集中在PCR检测,因此本实验还制备PBoV结构蛋白VP2的单克隆抗体,为后续研制PBoV的ELISA诊断试剂盒打下一定基础。1. PBoV结构蛋白VP2单克隆抗体的研制从PBoV阳性病料中成功克隆出VP2基因,并连接到pET-30a载体中,鉴定正确后转化到感受态细胞BL21中诱导表达,发现在48kDa左右处有明显表达条带。纯化后免疫小鼠,对免疫效价予以检测,达到融合要求后与SP2/0融合,经过ELISA, Western-blot等实验筛选,成功获得了4株单克隆抗体。2.三价重组病毒的构建以TK-/gE-/lacZ+作为亲本毒株,以pIECMV作为中间转移载体。分别将PBoV、PPV的VP2基因以及相对的CMV启动子和PloyA终止子插入到转移载体中,在IBRS-2细胞中共转染重组转移载体以及用EcoR I酶切后的亲本株病毒基因组。36h-54h收获病变细胞,通过PCR检测、空斑实验筛选纯化,成功筛选到重组伪狂犬病毒,Western-blot实验证明PPV、PBoV的VP2蛋白都得到了表达,其中PPV的VP2蛋白约为64kDa, PBoV的VP2蛋白约为62kDa。最后通过测定病毒生长曲线以及连续传代培养等实验证明外源基因的插入并没有影响PRV的增殖。3.三价重组病毒的免疫效果评估分别将105.0TCID50的亲本株病毒、重组病毒以及同体积的MEM免疫小鼠,首免后第四周二免,分别采集0、14、28、42、56天的血清进行ELISA抗体水平检测以及PRV中和抗体水平检测。发现实验组可以诱导小鼠产生针对PPV和PBoV的ELISA抗体;在PRV中和抗体结果上,重组病毒组与亲本株病毒组相近。

关键词： 猪链球菌   副猪嗜血杆菌   保护性抗原   重组伪狂犬病毒   免疫保护力  

摘要： 猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype2,SS2)是一种重要的人兽共患病病原,不仅给我国养猪业带来巨大损失,还为人类公共卫生带来一定的安全隐患。副猪嗜血杆菌病(Glasser’s disease)也是猪场的一种常发疾病,以高死亡率为特征,严重制约着全球养猪业的发展。 本研究的临床调查也表明,猪链球菌和副猪嗜血杆菌为目前猪场分离的两大主要细菌病原,给猪场的正常生产带来较大危害,因此临床预防这两种病原具有重要意义。目前临床预防细菌病原,应用较多的为灭活苗,灭活苗具有安全性好、免疫持续期长等优点,但也存在着接种剂量大,接种次数多,猪的应激反应大等缺点,而且针对不同病原还需进行分批多次免疫,加大了人力物力成本。因此研究出一种廉价高效同时能预防多种病原的新型疫苗具有重要意义。 本研究采用目前运用比较成熟的伪狂犬基因缺失株TK-/gE-/LacZ+为载体,利用同源重组的原理,选取实验室前期筛选的针对猪链球菌和副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)具有良好保护力的新型抗原基因Sao、HP0197、HPS6257以及palA,以期构建出携带有SS和HPS抗原基因的重组伪狂犬病毒,然后对其进行动物免疫评价,为更好的预防这两种病原提供新思路。 1.猪链球菌和副猪嗜血杆菌的临床调查 本研究在中国南方的大型猪场针对猪链球菌和副猪嗜血杆菌的分离情况及发病情况进行了调查。调查结果表明,2012年猪链球菌和副猪嗜血杆菌在临床的分离比例分别为25%和14.9%,为危害猪场的两大主要病原;临床的发病情况也表明,两种病原菌对于不同日龄的猪群均有不同程度的危害,给猪场的正常生产带来较大危害。因此做好这两种病原的预防具有重要意义。 2.表达猪链球菌、副猪嗜血杆菌保护性抗原的重组伪狂犬疫苗毒株的构建与鉴定 根据公布的猪链球菌2型的Sao、HP0197基因以及副猪嗜血杆菌5型的HPS6257、palA基因序列,以猪链球菌2型SC19株及副猪嗜血杆菌SH0165株的基因组为模板,通过PCR扩增,并先后克隆到载体pIECMV’上,构建出转移载体pIE/06257/0197及pIE/palA/Sao。 在PK-15细胞上共转染PRV基因组TK-/gE-/LacZ+和转移载体,经过数轮空斑筛选纯化获得PRV/06257/0197和口PRV/palA/Sao两株重组病毒。通过间接免疫荧光实验和VWestern Blot,表明两株重组病毒中的外源基因均有表达。重组病毒的生物学特性试验显示重组毒与亲本毒在PK-15细胞上的增殖能力无异,且经过在细胞上的连续18次传代,外源基因能够稳定遗传表达。以上结果表明,本试验已成功构建出能表达保护性抗原SAO、0197、06257、palA,并且增殖特性与遗传稳定性良好的重组伪狂犬疫苗毒株。 3.重组疫苗毒株在Balb/c小鼠上的免疫评价 本研究对重组毒株在Balb/c小鼠上的免疫效果进行了评价。实验中每只小鼠分别以106TCID50的剂量进行首次免疫,并间隔28天后以相同剂量进行加强免疫,每隔两周断尾取血,对伪狂犬中和抗体以及针对各蛋白的ELISA抗体进行测定。最后分别以致死剂量的猪链球菌2型以及副猪嗜血杆菌5型强毒菌株(SC19和SH0165)攻毒,进行免疫保护力评价。结果表明：(1)重组毒株能诱导小鼠产生较高的针对06257、***蛋白的ELISA抗体以及较高的伪狂犬的中和抗体;(2)重组毒株PRV/06257/0197和口PRV/pa1A/Sao分别能提供小鼠对猪链球菌强毒株的66.6%及50%的保护力。 小鼠免疫性评价实验表明,本研究构建的重组疫苗毒株有一定的免疫效果,为下一步进行本体动物的研究提供了基础,从而为进一步的新型猪链球菌、副猪嗜血杆菌的疫苗的开发研究提供一定的依据。 4.重组病毒疫苗的猪场应用实验 本研究制定了猪场应用方案,对疫苗的效果进行评价。对于仔猪进行了疫苗接种安全性试验。安全性试验结果表明：(1)本研究以伪狂犬病毒为载体,插入病菌外源蛋白的重组病毒疫苗的安全性好,超量免疫接种安全性达100%;(2)重组病毒的免疫对猪瘟弱毒疫苗的接种未产生负协同作用,免疫仔猪未出现异常状况,每日平均采食量正常,且在1-7天内体温保持在正常水平。

关键词： 志贺氏菌   多克隆抗体   单克隆抗体   基因工程抗体   胶体金免疫层析试纸条  

摘要： 志贺氏菌又称痢疾杆菌,是引发我国感染性腹泻、严重危害人类健康的食源性致病菌。它主要侵害结肠,引发溃疡、粘液性血性腹泻,对婴幼儿有较高的感染率和死亡率。加强对志贺氏菌的监测,有助于预防和控制大规模感染疫情的爆发。目前,针对食源性致病菌的检测方法主要有传统的生化培养、PCR检测和免疫学方法等。免疫学方法因其简单、快速、成本低廉等优点而备受青睐。本文旨在制备多种抗志贺氏菌的抗体,建立一种快速、简便筛查志贺氏菌的胶体金免疫试纸条检测方法,用于其临床诊断及食品卫生监测。 采用志贺氏菌混合菌体碎片作为免疫原免疫家兔,制备获得了效价为1：1280000的抗血清。经菌体逆向吸附法和辛酸硫酸铵沉淀法纯化后,有效去除了与大肠杆菌和阪崎肠杆菌等杂菌的交叉反应,获得了抗志贺氏菌的多克隆抗体。通过细胞融合技术,筛选得到4株能稳定分泌抗志贺氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用辛酸硫酸铵沉淀法对单克隆细胞株4G9的腹水进行纯化,获得单克隆抗体,可与纯化多抗配对使用。用胶体金标记单克隆抗体,将多克隆抗体和驴抗鼠IgG分别喷涂于硝酸纤维素膜作为检测线和质控线,制备了志贺氏菌的胶体金免疫层析试纸条。检测志贺氏菌纯培养物的灵敏度为105CFU/mL:在添加108CFU/mL的长双歧杆菌和阪崎肠杆菌的干扰下,其牛奶样品中的志贺氏菌的灵敏度为106CFU/mL.本文从制备的志贺氏菌单抗细胞株4G9中获得了VL、VH基因的序列,发现其分别属于κ链和γ链。由于VL经比对发现存在终止密码子,因此只把VH分别构建到pET-lic、pGEX-4T-1载体中,转入大肠杆菌中表达,通过ELISA方法验证了两种表达产物均能与志贺氏菌结合,但亲和力较低,不适合用于制备检测志贺氏菌的免疫层析试纸条。 本文研究结果将为建立其它食源性致病菌的快速检测方法,提供可借鉴的研究模式。

关键词： PEDV   序列分析   COE基因   乳酸乳球菌  

摘要： 本论文选择乳酸乳球菌NZ9000作为宿主菌，pMG36n为表达载体，以猪流行性腹泻病毒纤突蛋白（S蛋白）部分保护性抗原基因（COE基因）为抗原基因，在大肠杆菌中以红霉素抗性作为选择标记构建重组质粒，确定阳性质粒后电转入乳酸乳球菌NZ9000，以nisin作为诱导剂诱导目的蛋白表达。以期获得PEDV基因工程疫苗，依靠S蛋白抗原刺激特异性粘膜免疫作用及乳酸菌天然抗菌、抗腹泻作用，达到预防猪流行性腹泻病的目的。 本研究主要研究内容如下：1.将5份疑似猪流行性腹泻的病猪肠或粪便病料，进行RT-PCR扩增、获得包括部分Spike基因（S基因）和ORF3基因在内的3016bp核苷酸的DNA片段，将其与pMD18-T载体连接后测序，并利用DNAStar软件与CV777、DR13等病毒株进行序列对比及进化分析，了解新发PED病毒分子变异特性。实验结果表明，5个新发PEDV毒株与比利时经典毒株CV777相比存在较大差异，都存在点突变;CH-GZH毒株在S基因3581-3583bp处存在3个核苷酸的缺失，CH-ZJ毒株分别在ORF3基因245-293bp处缺失49个核苷酸。从新发毒株中选取CH-GZH毒株进行人工感染动物实验，感染组在40小时内全部发病死亡，对照组正常生长。对实验动物剖检发现，感染组的动物肠壁变薄并且肠腔有大量黄色液体，含有凝乳块，通过RT-PCR鉴定确认为PEDV阳性，猪感染性肠炎病毒（TGEV）检测为阴性。 2.根据Genebank中登陆的PEDV基因特征，设计了3对不同的线性中和抗原表位特异性引物，上游引物引入SalⅠ酶切位点，下游引物引入SphⅠ酶切位点，采用RT-PCR方法对CH-GZH毒株S基因上的3段抗原表位基因进行扩增，将PCR产物连接到pMG36n载体上，以Em作为选择标记将连接物转入大肠杆菌JM109，阳性质粒送测序。将重组载体pMG36n/COE电转入到乳酸乳球菌NZ9000中，经nisin诱导后，用SDS-PAGE凝胶电泳进行检测分析。分析结果表明，以nisin作为诱导剂、表达PEDV部分S蛋白的重组乳酸乳球菌得到成功构建，为研制PED基因工程疫苗奠定了前期基础。