关键词： ASFV   免疫逃逸   基因工程疫苗   防控   抗病育种  

摘要： 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的猪的一种高度接触性、致死性传染病,病理特征明显,致死率高,对全世界养猪业和经济发展构成严重威胁。由于ASFV基因组庞大,免疫逃逸机制复杂,至今还没有研发出安全有效的商业化疫苗用于防控疫病。该综述分别介绍了ASF的流行背景、病原学特性、临床和实验室诊断方法以及相关防控措施。总结了6种ASF疫苗如灭活疫苗、减毒活疫苗、病毒活载体疫苗、DNA疫苗、亚单位疫苗以及单周期病毒疫苗的研究进展和免疫机理,并叙述了用于防控疫病的可行性。在此基础上,提出了纳米疫苗和抗病育种2个新的研究方向,归纳出了目前防控遇到的难题及解决办法,以期为后续疫病防控和ASF疫苗研究提供参考和新途径。

关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒   GP5   生物信息学   感染与复制   毒力与中和   基因工程疫苗  

摘要： 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV引起的一种高度接触性传染病。作为一种RNA病毒,PRRSV的基因组存在广泛变异,其中以NSP2和ORF5基因变异为主。由于不同谱系毒株的ORF5有特征性的核苷酸序列,因此ORF5可用于PRRSV的分型。ORF5编码GP5蛋白,GP5蛋白含有多个表位,可与细胞受体作用,从而影响病毒的感染、复制。近年来,关于PRRSV的分子流行病学调查倾向于揭示不同毒株所特有的氨基酸突变。这些突变通常发生在GP5蛋白的信号肽编码区、非中和表位、中和表位和跨膜区。因此有研究将这些突变数据与病毒的毒力强弱、中和能力关联起来。而研究者尝试通过突变来推测GP5蛋白的构象或功能改变,从蛋白互作的结构基础层面来解释这种联系。由于GP5的三级结构并不能用传统的高分辨率冷冻电镜以及X射线晶体学方法观测,因此生物信息学方法成为相关研究的唯一选择。此外,GP5可用于基因工程疫苗的研制。综述了近年来关于GP5蛋白的生物信息学研究,并总结了GP5蛋白对病毒感染、复制、毒力、中和的影响,汇总了基于GP5的基因工程疫苗性能评测。

关键词： 牛流行热   牛流行热病毒   聚合酶链式反应   等温扩增技术   基因工程疫苗  

摘要： 牛流行热(BEF)是由牛流行热病毒(BEFV)引起的一种急性、热性、非接触性疾病。BEF发病率高,在世界范围内流行,严重阻碍了各国养牛业的快速发展。迄今为止尚无针对BEF的有效治疗方法,检测和疫苗接种成为防控该病的关键环节。文章对近年来国内外在BEF血清学、分子生物学诊断方法以及灭活疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗等方面的研究成果进行综述,并对不同检测方法和疫苗进行比较,旨在为快速诊断和有效防控BEF提供参考。

关键词： 动物疾病防治   基因工程疫苗   实践应用要点  

摘要： 在动物疾病的防治实践工作中,基因工程疫苗目前已经得到了普遍的采用。相比于传统类型的动物疫苗而言,基因工程疫苗具有治疗效率提升、疫苗批量生产、可靠性以及安全性更高等显著技术优势。现阶段的养殖动物感染疾病潜在风险因素正在不断增多,客观上体现了深入探索研究基因工程疫苗技术的必要性。因此,本文重点探析了基因工程疫苗运用于动物疾病防治领域的技术实施优势,结合动物疾病防治的实践需求来促进现有技术完善。

关键词： 虹鳟鱼传染性造血器官坏死病   免疫   攻毒   注射   浸泡  

摘要： 虹鳟鱼传染性造血器官坏死病(IHN)是一种死亡率高、危害性极大的鲑科鱼类病毒性传染病。于2009年侵入甘肃省,对甘肃省虹鳟鱼产业造成毁灭性打击,使永登、永昌等地虹鳟鱼养殖场被迫停产。本试验使用兰州市威特森生物科技有限公司和兰州市渔业技术推广中心联合研制的一种IHN基因工程疫苗开展虹鳟鱼注射免疫和浸泡免疫试验,同时将免疫完成后的苗种投放到疫区开展攻毒试验。结果表明,虹鳟鱼传染性造血器官坏死病疫苗接种,采用浸泡接种的方法较注射接种更适合在生产实践中推广应用;且适宜采用二次浸泡接种的方法,第一次浸泡免疫的苗种规格为4g,第二次浸泡免疫的苗种规格为10g;该基因工程苗采用1‰浓度进行免疫效果最佳,免疫虹鳟鱼苗种成活率可达80%以上。

关键词： 猪圆环病毒(PCV)   基因工程抗体   猪源化改造   真核表达  

摘要： 猪圆环病毒2d型(Porcine circovirus type 2d, PCV2d)是猪圆环病毒的一个主流亚型，是引起断奶仔猪(Sus scrofa)多系统衰竭综合征等猪免疫抑制相关疾病的重要病原，严重危害着我国养猪业的健康发展。目前报道的PCV2d中和表位均位于衣壳蛋白(capsid protein, Cap)上，Cap是产生中和抗体的关键蛋白，其中和抗体能够与病毒结合，从而阻止PCV2d的感染。本研究首先通过原核表达、纯化获得PCV2d Cap重组蛋白，并免疫BALB/c小鼠(Mus musculus)，筛选得到了2株鼠源抗PCV2d Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1B3和1B4，其中1B3具有中和活性且不与其他病毒发生交叉反应。将1B3抗体可变区基因与猪源恒定区基因嵌合后克隆至真核表达载体中，利用中国仓鼠(Cricetulus griseus)卵巢CHO-S细胞制备1株PCV2d Cap蛋白重组猪源化嵌合抗体r1B3swine稳定表达细胞系。抗体功能验证和Western blot结果显示，r1B3swine与PCV2d病毒结合反应良好，并且不与抗鼠二抗发生交叉反应。综上所述，本研究构建的猪源化抗PCV2d Cap蛋白的单克隆抗体r1B3swine的真核表达体系，为研究PCV2d Cap蛋白的结构、功能及为PCV2研发新的治疗和诊断制剂提供物质基础。

关键词： 基因工程抗体   (CP)3   二聚体F(ab')2   靶向性   结合活性  

摘要： 背景与目的:随单克隆抗体技术愈发成熟,用于治疗疾病的商业单抗被深入研究,但全长抗体逐渐显露的不足之处限制了在临床中的应用,如全抗分子量大,难以穿透肿瘤组织到达肿瘤内部,且Fc端易引起非特异性结合带来的副作用等。因此构建表达活性小分子抗体或许成为新的治疗方向,如单链可变区scfv、抗原结合片段Fab等。与单价的小分子抗体相比,构建双价或多价抗体可以增强与抗原的结合能力,增加分子量大小可延长药物的半衰期,减缓在体内的清除速率等,常见的双价或多价抗体如F(ab')2、Triabodies、Tetrabodies等。基于本实验室前期筛选的Anti-CD19、Anti-CD20及Anti-BCMA的单克隆抗体,在其人鼠嵌合的Fab片段抗体的CH1末端引入半胱氨酸(Cys)和脯氨酸(Pro)的组合序列,构成Fab',再通过半胱氨酸的巯基氧化成二硫键以期构成双价或多价抗体,达到增强与靶抗原的亲和力的目的。此外,抗体偶联药物(ADC)是抗体药物的重要分支,因抗体具有靶向性可降低毒副作用,偶联毒素药物可降低最低有效剂量,本论文亦探究该基因工程改造形式用于构建二聚化的融合蛋白,以期形成二聚化的抗体偶联物,检测二聚化后的抗体偶联物与靶细胞的结合活性是否得到显著的增强。方法:在已有原核表达载体PAYZ-Anti-CD19Fab的基础上,构建(CPP)3、(CPP)2、(CPP)、(CP)3、(CP)2、(CP)六种基因工程改构形式的质粒,经热激法转化至大肠杆菌16C9,采用低磷诱导表达培养基表达目的蛋白,经Protein G亲和层析柱纯化,通过SDS-PAGE鉴定各种蛋白及质谱鉴定Anti-CD19Fab-(CP)3分子量及主要组分相对含量,通过流式细胞术检测不同改构形式的蛋白与靶抗原的结合活性,确定了最优的改构形式(CP)3结构。为验证此改构方式是否具有通用性,将(CP)3结构与现有的改构技术(CPP)3结构以同样方式构建于Anti-CD20及Anti-BCMA靶点的Fab片段抗体的CH1末端,通过电泳鉴定二聚体相对含量及流式检测与靶细胞结合活性。为进一步探究该改构形式是否适用于抗体偶联物,构建了 Anti-CD19Fab偶联辅基蛋白(LDP)的原核表达质粒,融合蛋白表达纯化后经电泳鉴定二聚体相对含量及流式检测融合蛋白对靶抗原的结合活性。结果:成功构建并表达了靶向CD19的不同改构形式的蛋白,经凝胶电泳鉴定及流式活性检测结果显示,相比于Fab单体蛋白及引入现有的改构技术(CPP)3结构的抗体,引入(CP)3结构对构建二聚化抗体更优,与靶细胞的结合活性更高。成功构建并表达了靶向CD20、BCMA的二聚化抗体,电泳结果显示引入(CP)3结构相比引入(CPP)3结构可形成更高比例的二聚体,流式检测结果显示与靶细胞的结合活性更强。成功构建并表达了靶向CD19的Fab段抗体与LDP的偶联物,结果显示引入(CP)3结构可形成更高比例的二聚化融合蛋白,与靶细胞的结合活性更强。结论:在 Anti-CD19Fab、Anti-CD20Fab、及 Anti-BCMAFab 段抗体的 CH1 末端引入(CP)3结构比引入(CPP)3结构可形成更高比例的二聚体,流式检测引入(CP)3结构的抗体与靶细胞的结合活性更高,此结论在靶向CD19的抗体偶联药物中依然适用。与单体Fab片段抗体相比,经过基因工程改造后,形成二聚体比例越高的抗体,对靶抗原的亲和力也越强。

关键词： 灵芝   灵芝酸   积累   基因工程   杂交育种  

摘要： 灵芝是我国名贵的药用真菌,可以生产多种活性成分,如灵芝酸、灵芝多糖等。灵芝酸是灵芝中主要的次级代谢产物,具有抗HIV、抗癌细胞转移、抗肿瘤等重要药理作用,但目前灵芝酸的产量仍不能满足临床及商业需求。在水稻、玉米等作物研究中发现采用基因工程结合杂交育种的方法可以提高其次级代谢产物的含量,并可减少育种的盲目性。但在担子菌中,基因工程结合杂交育种对次级代谢产物积累及育种的影响还未有研究。在本研究中,我们使用原生质体单核化技术将双核菌株CGMCC5.0026分离,通过锁状联合和SNP测序验证成功获得单核菌株G.260125和G.260124。随后,采用转基因技术在G.260124菌株中转入透明颤菌血红蛋白基因(vgb)获得过表达工程菌株24+vgb,在G.260125菌株中转入鲨烯合成酶基因(sqs)获得过表达工程菌株25+sqs。使用杂交育种的手段,将两个工程菌株进行杂交,通过PCR、锁状联合和SNP测序验证成功获得了v+s杂交双核菌株。对比CGMCC5.0026菌株和v+s杂交菌株在液体静置发酵培养中灵芝酸的生产情况。研究发现CGMCC5.0026菌株和v+s菌株的细胞生长无显著差异。v+s菌株单体灵芝酸GA-T、GA-S、GA-Me的最大含量分别为124.876±14.322、27.945±2.672、68.154±1.775μg/100 mg细胞干重,分别是对照CGMCC5.0026菌株的1.24、1.52、1.28倍。为了初步探究其影响灵芝酸合成的机制,我们检测了灵芝酸合成途径的中间代谢产物羊毛甾醇和鲨烯的含量及合成相关基因sqs和羊毛甾醇合成酶基因(ls)的表达水平。v+s菌株的鲨烯和羊毛甾醇的最大含量分别为0.866±0.097、10.638±0.50μg/100 mg细胞干重,分别是对照CGMCC5.0026菌株的2.04、1.89倍。v+s菌株的sqs、ls的最大转录水平分别是对照CGMCC5.0026菌株的3.07、2.42倍。结果表明,基因工程结合杂交育种可能是通过提高灵芝酸合成途径的中间代谢产物含量和灵芝酸合成相关基因的转录水平来提高液体静置培养菌丝中灵芝酸的积累。将CGMCC5.0026双核菌株和v+s杂交菌株进行栽培,分析子实体发育不同阶段:菌包中的菌丝-菌皮、原基、成熟子实体中灵芝酸的含量。研究发现,v+s菌株菌皮中单体灵芝酸GA-T、GA-S、GA-Me含量分别为21.456±5.659、2.045±0.929、7.124±0.491μg/100 mg细胞干重,分别是对照CGMCC5.0026菌株的3.38、8.78、1.73倍。v+s菌株原基中单体灵芝酸GA-N、GEA-E、GA-A、GEA-D、GA-F含量分别为66.481±6.26、6.864±0.883、126.993±33.241、57.972±10.554、34.96±3.236μg/100 mg细胞干重,分别是对照CGMCC5.0026菌株的1.52、1.66、1.43、1.53、1.57倍。v+s菌株成熟子实体中单体灵芝酸GA-I、GA-B、GA-K、GA-A、GAH、GA-F含量分别为31.147±2.167、20.719±0.687、22.446±2.94、43.654±1.924、47.677±5.369、60.568±3.281μg/100 mg细胞干重,分别是对照CGMCC5.0026菌株的1.8、2.5、2.12、1.8、1.99、1.61倍。结果表明,基因工程结合杂交育种不仅可以提高菌丝中灵芝酸的含量,也可提高子实体中灵芝酸的含量。我们首次使用基因工程结合杂交育种的方法提高灵芝菌丝和子实体中灵芝酸的含量,发现灵芝酸含量的提高可能与中间代谢产物的积累和相关基因转录水平的上调密切相关。本研究为灵芝和其他担子菌的育种提供了一种新的方法,对于高效生产灵芝酸也具有重要的意义。

关键词： 基因工程抗体   真菌毒素   新烟碱类杀虫剂   免疫层析   双特异性抗体  

摘要： 农药残留和真菌毒素污染是农产品在生产、储藏、加工和销售过程中的重要隐患。噻虫啉(Thiacloprid,TCL)因其广谱、高效的性质,在农产品生产中应用广,残留高。赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)作为典型真菌毒素,危害性强,污染范围广,在谷物和果蔬类农产品中均有残留。但是对于同时检测这两种有害物的研究较少,因此,建立能够快速检测这两种污染物的方法非常重要。目前较为常见的快检产品多为基于传统免疫抗体的单一组分检测,无法实现对农药和毒素的同时检测,且抗体制备复杂、周期长。基于基因工程重组技术制备的双特异性抗体识别元件很好地解决了上述问题,可以在体外快速表达,实现跨类有害物同步检测。本论文基于大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115表达了噻虫啉单链抗体(single-chain variable fragment,scFv),基于哺乳动物细胞Expi293F表达了噻虫啉单链抗体、全长抗体(immunoglobulin,IgG)、噻虫啉和赭曲霉毒素A双特异性抗体(bispecific antibodies,Bs Abs),对比了不同宿主和抗体形式对抗体产量和活性的影响。制备了基于IgG抗体的时间分辨荧光免疫检测试纸条,基于双特异性抗体建立了噻虫啉和赭曲霉毒素A竞争ELISA检测方法。主要研究和结论内容如下:(1)基于不同表达系统制备噻虫啉的scFv和IgG抗体,并比较抗体产量和活性。分别设计了大肠杆菌表达载体p ET-28a-scFv、毕赤酵母表达载体p PIC9K-scFv、哺乳动物细胞表达载体p CMV-scFv、哺乳动物细胞重链表达载体p CMV-HC和哺乳动物细胞轻链表达载体p CMV-LC,将质粒分别在大肠杆菌BL21、毕赤酵母GS115和哺乳动物细胞Expi293F中表达。结果表明在大肠杆菌BL21、毕赤酵母GS115和哺乳动物细胞Expi293F中表达的scFv抗体产量分别为7、3.2和1.6 mg/L。基于BL21生产的scFv抗体几乎无活性,基于GS115生产的scFv抗体活性较差,基于Expi293F表达的scFv抗体构建ELISA标准曲线,IC为14.87 ng/m L。通过Expi293F表达的IgG抗体产量约35mg/L,活性最佳,亲和常数为1.2 x 10 L/mol,在最佳条件下基于IgG抗体构建的ELISA检测标准曲线IC为2.63 ng/m L。通过比较三种表达系统及抗体形式对抗体产量和活性的影响,得出哺乳动物细胞Expi293F中表达的IgG抗体产量最高,活性最好。(2)基于前面构建的基因工程IgG抗体,合成制备抗原,创新时间分辨荧光免疫检测方法,并在食品中进行应用。研发噻虫啉荧光免疫检测试纸条,在0.01-10 ng/m L线性范围内,线性方程为y=-19.113log X+62.038,IC为4.268 ng/m L,检测限(limit of detection,LOD)为0.003 ng/m L。批内和批间的变异系数分别为0.40%和5.18%,具有高灵敏度和稳定性。与结构类似物啶虫脒的交叉反应率为19.27%,分子对接结果表明啶虫脒和噻虫啉结构中的氰基会与抗体的ILE-100残基形成氢键。应用于果蔬食品的检测回收率为79.4%-118.6%,高效液相色谱串联质谱(High Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry,HPLC-MS)回收率为92.1%-107.6%,该方法具有良好准确性。(3)设计双特异性抗体表达载体,建立噻虫啉和赭曲霉毒素A同步ELISA检测方法。设计大肠杆菌BL21表达载体p ET-28a-OTA和哺乳动物细胞Expi293F表达载体pc DNA3.1-OTA-TCL,分别在BL21和Expi293F中表达,通过分子对接探究赭曲霉毒素A、噻虫啉与双特异性抗体间的识别作用。结果发现,表达的OTA纳米抗体产量约为8.6mg/L,亲和常数为2.3 x 10 L/mol,竞争ELISA标准曲线的IC为22.65 ng/m L。双特异性抗体产量约为2 mg/L。检测噻虫啉的线性范围为0.05-1000 ng/m L,LOD和IC分别为0.337和17.10 ng/m L。在0.05-500 ng/m L线性范围内,检测赭曲霉毒素A的ELISA试剂盒IC为16.69 ng/m L,LOD值为0.788 ng/m L。在葡萄样品中检测TCL和OTA的加标回收率分别为77.9%-125.5%和76.2%-87.0%,方法准确性较好。综上,本研究通过三种表达系统,比较分析了不同宿主和抗体形式对抗体产量和活性的影响,获得了噻虫啉scFv、IgG抗体和双特异性抗体。并构建快速检测试纸条和同步检测试剂盒,实现污染物跨类同步检