关键词： 噬菌体展示   人源化抗体Fab   TLR4   LPS   活性分析  

摘要： TLR4是Toll样受体家族成员之一，在对TLR4的研究中发现TLR4通过依耐MyD88途径或不依耐MyD88途径介导LPS的信号传导，从而在病原体入侵机体的早期即可启动免疫，其在抗感染治疗中起非常关键的作用[1-4]。阻断TLR4介导的内毒素信号向细胞内的传导，是减轻内毒素生物学效应的有效的方法。本课题前期进行的鼠源性的抗TLR4抗体的研究中，获得鼠抗人TLR4的单克隆抗体，体外细胞试验显示其对LPS刺激产生的a-TNF有明显的抑制作用[5]。但人体对鼠源性抗体会产生HAMA（human anti-mouse antibody），产生强烈的免疫反应，限制了其临床应用。噬菌体抗体库展示技术是近年发展的单克隆抗体制备的一项新技术，它改变了单克隆抗体制备的传统途径，它模拟机体产生抗体的过程，从而使得在体外就可以获得特异性的单克隆抗体[6]。本课题运用噬菌体抗体库技术在人体库中进行筛选，成功获得了人源抗TLR4抗体的Fab的基因片段，并构建该Fab的原核表达载体，对其表达的蛋白进行活性分析。 方法： 1、采用抗原固相筛选法：以纯化的重组hTLR4蛋白为靶抗原，从人源噬菌体Fab抗体库中筛选，经“吸附、洗脱和扩增”三个环节，经五轮筛选后，随机挑取的80个克隆，经phage ELISA验证，获得11株阳性克隆，对阳性克隆进行测序，发现11株阳性克隆的抗体可变区基因序列相同，最终获得一株人源抗TLR4抗体Fab，将其命名为抗hTLR4Fab-1。 2、将筛选获得的阳性克隆质粒经PCR扩增后获得VL和Fd，构建pET-Duet1表达载体，将重新构建的质粒转入大肠杆菌Origami2（DE3），诱导其表达抗hTLR4Fab-1。 3、将诱导表达的抗hTLR4Fab-1包涵体蛋白经变性、复性后，用Protein L柱纯化，纯化后抗体Fab经SDS-PAGE、Western-bolt及ELISA分析鉴定。 4、通过细胞学检测抗hTLR4Fab-1对LPS诱导的人PBMC的TNF-α表达的影响，观察该抗体是否能阻断hTLR4对LPS的信号传导，减轻LPS诱导的炎症反应，判断其活性。 结果： 1、将筛选获得的11株阳性克隆扩增后，进行核酸序列测定和比对分析，结果显示，所得到的阳性克隆的抗体可变区基因相同，其可变区基因序列正确。通过五轮筛选，获得一株人源抗TLR4抗体Fab，命名为抗hTLR4Fab-1。 2、抗hTLR4Fab-1表达载体转化大肠杆菌，抗体以包涵体的形式大量表达，经变性、复性后，VL及Fd能正确的组装;经Protein L柱纯化后，可获得纯度较高的抗体。 3、ELISA结果显示，本实验方法获得的抗体能够与hTLR4特异性结合。 4、体外细胞学研究结果实验表明：人源抗体hTLR4Fab-1能够明显阻断LPS诱导的人PBMC细胞表达TNF-α，抑制率达76.25%。 结论： 1、通过噬菌体抗体库技术，采用固相筛选方法可获得抗hTLR4的特异性基因工程抗体Fab。 2、应用原核表达技术，该Fab在大肠杆菌Origami2（DE3）中以包涵体的形式大量表达。通过优选条件，对包涵体蛋白进行变性、复性、纯化，最终获得高纯度、有生物学活性的抗体。 3、抗hTLR4抗体片段Fab能与hTLR4特异性结合，并可抑制LPS诱导的人PBMC细胞表达TNF-α，减轻LPS诱导的炎症反应。 本研究制备的人源抗体TLR4抗体Fab可与hTLR4特异性结合，并能有效阻断LPS诱导的人PBMC细胞表达TNF-α，减轻LPS诱导的炎症反应，从而达到保护机体的作用。

关键词： 猪囊尾蚴病   重组抗原   基因工程疫苗  

摘要： 猪囊尾蚴病(Cysticercosis Cellulosae)是由猪带绦虫的幼虫囊尾蚴寄生于人或猪等而引起的人畜共患寄生虫病,是公认的世界经济病之一,严重威胁着人体健康,并给畜牧业造成重大经济损失,猪囊尾蚴病的免疫防治势在必行。然而在猪囊尾蚴病疫苗研究中,疫苗抗原的选择和来源一直困扰着兽医工作者。该文就近年来猪囊尾蚴病诊断重组抗原和基因工程疫苗的分子生物学研究进展进行了综述。

关键词： 牛传染性鼻气管炎   牛疱疹病毒Ⅰ型   GM-CSF   重组病毒   基因工程疫苗  

摘要： 通过引入免疫增强因子GM-CSF,提高重组病毒的免疫原性。将牛GM-CSF克隆到pcDNA3.1载体中,构建GM-CSF基因表达盒;将tk基因上游同源臂、GM-CSF基因表达盒、tk基因下游同源臂克隆到pcDNA3.1载体中,得到转移载体pTK-GM-CSF。将亲本病毒BHV-1 gG-/TK-/EGFP+基因组与转移载体pTK-GM-CSF采用磷酸钙法共转染MDBK细胞,得到重组病毒BHV-1 gG-/TK-/GM-CSF+。并对重组病毒的生物学特性和对日本大耳白兔的免疫原性进行了评价。利用PCR和RT-PCR证实GM-CSF基因表达盒已正确插入重组病毒的tk基因位置,并具有转录活性。亲本株和重组株的空斑形态、空斑直径大小无明显差异;两者病毒滴度无明显变化,生长曲线相似;体外遗传稳定性良好。兔体试验表明,在免疫早期重组毒株能产生较亲本株更高水平的IFN-β(P<0.05)。但中和抗体水平、攻毒后的临床症状及病毒排毒时间等各项指标检测表明,亲本株和重组毒株之间无明显差异。在免疫早期重组株刺激机体产生的IFN-β高于亲本株,具有一定的应用前景。

关键词： 基因工程   重组药物   基因工程疫苗   基因诊断   基因治疗  

摘要： 目的:为了了解基因工程技术在医学中的应用及其利弊。方法:通过查阅相关文献,了解基因工程技术在重组药物、疫苗、诊断和治疗等方面的应用,并分析其利弊。结果:基因工程技术的快速发展使其在医学中得到了广泛的应用,但同时也存在着不利的一面。结论:发展基因工程技术的造福功能,抑制其危害功能。

关键词： 玉米   遗传育种   基因工程   概论  

摘要： 本文介绍了转基因玉米的转化途径,主要有农杆菌介导转化法、基因枪法、花粉管通道法、碳化硅纤维介导法等,并分析了抗虫转基因玉米、抗除草剂玉米、利用转基因玉米作载体生产特殊蛋白等转基因玉米的种类。

关键词： 鸭病毒性肝炎   活疫苗   灭活疫苗   基因工程疫苗  

摘要： 目前使用的鸭病毒性肝炎疫苗主要是弱毒活疫苗和灭活疫苗,基因工程疫苗的研究也取得了一定进展。就鸭病毒性肝炎疫苗的研究进展进行了综述,以期为进一步深入研究提供参考。

关键词： CD19   力达霉素   B性恶性淋巴瘤   基因工程抗体   DNA损伤   强化融合蛋白  

摘要： 目的构建及表达抗CD19(Fab)-LDP(LDP为LDM辅基蛋白)融合蛋白,制备强化融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDM,进行体外生物活性的研究。方法采用基因克隆技术,构建基因重组质粒pAZYanti-CD19(Fab)-LDP,测序进行鉴定,转化至大肠杆菌进行表达,表达产物经Protein G亲和层析柱纯化后,进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定;采用流式细胞检测技术(FACS)和激光共聚焦显微镜技术,检测融合蛋白与B淋巴瘤Raji细胞的结合活性;采用间接免疫荧光法,检测CD19介导细胞内化的情况;采用MTT法检测强化融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDM对CD19+Raji细胞的靶向杀伤活性;采用彗星电泳的方法,检测强化融合蛋白对Raji细胞DNA的损伤程度。结果用基因工程方法成功的构建、表达融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDP,Protein G亲和层析柱纯化后在SDS-PAGE上表现为相对分子质量约60 ku蛋白条带,且融合蛋白可与Raji细胞特异结合,并能介导细胞的内化;强化融合蛋白对Raji细胞具有较强的细胞毒性,并能引起细胞DNA损伤。结论强化融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDM可以靶向作用于B淋巴瘤细胞,并具有较强的抗肿瘤活性,在恶性B淋巴瘤生物治疗中具有潜在的应用价值。

关键词： 新城疫病毒   形态和分子结构   致病力分子基础   分子流行病学   基因工程疫苗  

摘要： 新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一种急性、高度接触性禽类传染病,被世界动物卫生组织(OIE)定为法定必报传染病,我国也将其列为一类动物疫病,本文从新城疫病毒的形态及分子结构、致病力的分子基础、分子流行病学特征和基因工程疫苗等分子生物学相关研究进展进行了综述。

关键词： 酿酒酵母   乙醇   育种技术   基因工程育种  

摘要： 由于酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)具有发酵速度快和乙醇产量高等特性,所以一直是生物乙醇和酿酒业主要的发酵菌株,本文归纳总结了酿酒酵母育种技术的研究进展,重点介绍了基因工程育种技术,并对其应用前景进行了展望。

关键词： 抗体   基因工程   抗体片段   寄生虫病  

摘要： 抗体在生物医学领域具有广泛的应用前景。传统多克隆抗体及单克隆抗体由于其固有的缺点使其应用价值受到限制。抗体的人源化与片段化改造催生出一系列基因工程抗体变体。本文就基因工程抗体及其在寄生虫病防治中的应用研究进展作一综述。