关键词： 猪圆环病毒   全病毒疫苗   基因工程疫苗  

摘要： 截至2013年12月份,已有16家企业6种不同的猪圆环病毒2型灭活疫苗获得了农业部的注册,其中有批签发的企业14家。整理了猪圆环病毒疫苗在我国的商品化情况,分类总结了该类疫苗工艺核心等基本情况,同时分析了猪圆环疫苗的优缺点,并对猪圆环病毒疫苗的发展前景进行了展望。

关键词： 乙型肝炎   疫苗   Meta分析   乙型肝炎(乙肝)基因工程疫苗   抗-HBs阳转率  

摘要： 目的探讨3针20μg与3针10μg乙型肝炎（乙肝）基因工程疫苗抗-HBs阳转率的差异。方法在中国学术期刊全文数据库（CNKI）、万方数据库、国家科技图书文献中心杭州镜像站及维普资讯中文科技期刊数据库中以“乙肝OR乙型肝炎”及“疫苗”为关键词检索2000年1月～2013年5月国内公开发表的有关3针20μg与3针10μg乙肝基因工程疫苗全程接种后1个月及1年抗HBs阳转率的文献，采用Stata10．0软件进行Meta分析。结果共纳入18篇文献，Meta分析结果显示，全程免疫后1个月，3针20μg重组酵母乙肝疫苗抗-HBs阳转率显著高于3针10μg重组酵母乙肝疫苗（Z=2．78，P=0．005），合并RR为1．045（95％C1：1．013～1．079）；3针20μgCHO细胞乙肝疫苗抗-HBs阳转率显著高于3针10μgCHO细胞乙肝疫苗（Z=5．86，P〈0．01），合并RR为1．065（95％CI：1．043～1．088）。全程免疫后1年，3针20μg与3针10μg重组酵母乙肝疫苗抗-HBs阳转率差异有统计学意义（Z=2．38，P=0．017），合并RR为1．103（95％CI：1．018-1．196）。敏感性分析结果显示结果具有较好的稳定性。未发现纳入文献存在发表偏倚（P〉0．05）。结论3针20μg乙肝基因工程疫苗免疫效果优于3针10弘g乙肝疫苗。

关键词： 疫苗种类   猪用   应用   基因工程疫苗   弱毒活疫苗   合成肽疫苗   亚单位疫苗   转基因植物  

摘要： 灭活疫苗、弱毒活疫苗、基因工程疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗与合成肽疫苗、转基因植物可饲疫苗，不同疫苗不同优缺点，一起认识猪用疫苗。

关键词： 猪细胞因子   IL-2   IL-4   IFN-γ   免疫增强剂   新型基因工程疫苗  

摘要： 通过综述猪IL-2、IL-4和IFN-γ的基因结构、作为免疫佐剂和作为构建新型基因工程疫苗方面研究进展,以了解细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ的相关研究成果,为细胞因子进行更深入的研究提供参考。

关键词： 口蹄疫病毒   防治   中兽医   接触性传染病   基因工程疫苗   口蹄疫疫苗   保护率   统计资料  

摘要： 口蹄疫，俗称“口疮”、“蹄黄”，是由口蹄疫病毒引起偶蹄兽的急性热性高度接触性传染病，由于口蹄疫病毒株型多、易变异、传染快，防治极为困难。目前，疫情时有发生，要控制口蹄疫还需一段时间。统计资料表明，口蹄疫疫苗一免的保护率为40％，二免的保护率为60％，三免的保护率才有75％，既使是最新投入应用的新型基因工程疫苗，效果也未尽如人意。

关键词： PCV2   Cap   基因工程疫苗  

摘要： 猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)近年来在我国呈高发态势，给我养猪业造成了严重的经济损失。PCV2主要入侵淋巴系统引起免疫抑制，临床上多为隐性感染，常常并发或继发其他病毒或细菌病。目前，有关PCV2的疫苗的研究国内外多有报道。商品化疫苗仍以灭活疫苗为主，当前PCV2的灭活疫苗和弱毒活疫苗在抗原制备、抗体滴度、安全性等方面仍存在一定的不足，PCV2亚单位疫苗和重组疫苗因其安全性、经济性和良好的免疫诱导效果成为近年来成为研究热点。 本研究首先开展我国猪圆环病毒的流行状况研究，10个省市300个样品的检测结果显示，PCV2的阳性率平均为85%（65%～92%），这一结果表明我国猪群PCV2的感染非常普遍。进一步开展分子流行病学研究发现，我国近年来流行的主要毒株基本为PCV2b亚型。本研究检测的28株毒株中，属于PCV2b亚型的有27株，占96.4%，属于PCV2a的有1株，占3.6%。同源进化分析显示，毒株之间同源性为97.6%～100%，与参考毒株的同源性为88.3%～100%。 鉴于此，本研究以分离的2b亚型毒株PCV2-SL13为参考毒株，采用真核表达质粒和人腺病毒载体分别重组猪圆环病毒2型Cap基因制备基因工程疫苗。首先，通过PCR扩增出PCV2Cap基因。其次，将扩增的Cap基因片段与空质粒载体pcDNA4/HisMax连接，获得了可表达Cap基因的真核表达重组质粒pcDNA4/HisMax-Cap。将30只4～6周龄Balb/c小鼠随机分成3组，每组10只，第I组注射pcDNA4/HisMax-Cap重组质粒，第Ⅱ组注射pcDNA4/HisMax，第Ⅲ组是注射PBS溶液，每只肌肉接种100uL，共免疫3次，每次间隔2周，分别于免疫第0、7、14、28、35、49天采集小鼠血清，用间接ELISA方法检测血清中的IgG抗体。结果显示，在第49天，重组质粒组的抗体滴度可达0.44，空白质粒组和PBS组的抗体滴度分别为0.28和0.20。 再次，本研究将PCV2b亚型毒株PCV2-SL13的Cap基因片段连接到人5型腺病毒穿梭载体pacAd5CMVK-NpA上，并同腺病毒骨架载体RAPAd Ad Backbone vector共转染293细胞获得重组腺病毒rAd-Cap，测定其TCID50为1010.6。 本研究成功构建了真核表达重组质粒pcDNA4/HisMax-Cap和重组腺病毒rAd-Cap。动物试验表明，真核表达重组质粒pcDNA4/HisMax-Cap可诱导产生猪圆环病毒的抗体，可以作为疫苗的有效候选基因。构建的重组腺病毒rAd-Cap，大大提高了病毒的生产滴度。本研究初步研制了2种猪圆环病毒基因工程疫苗，为下一步猪圆环病毒2型Cap基因亚单位疫苗和重组腺病毒疫苗的生产应用研究奠定了基础。

关键词： 基因工程疫苗   核酸疫苗   免疫  

摘要： 近年来,基因工程及DNA重组技术发展迅速,应用基因工程方法开发新疫苗是解决传统疫苗诸多缺点的重要途径。基因工程疫苗主要有基因工程亚单位疫苗、基因工程活载体疫苗、核酸疫苗等,本文拟就基因工程疫苗研究进展展开综述。

关键词： 单链抗体   蛋白   植物抗病   基因工程   福建省  

摘要： 笔者日前从福建农林大学获悉,该校生命科学学院承担的省杰青项目'基于基因工程单链抗体的植物抗病改良研究'(项目编号:2009J06008)通过了福建省科技厅组织的专家验收。项目组通过基因工程抗体技术首次筛选到抗细菌HrpA蛋白高亲和力的单链抗体(scFv),并通过体外分子进化技术进一步提高了scFv的亲和力;率先将该scFv基因插入到植物表达载体并转化模式植物拟南芥,成功表达了抗HrpA蛋白

关键词： 猪繁殖与呼吸综合征   ORF3基因   ORF5基因   核酸疫苗   亚单位疫苗   免疫评价  

摘要： 猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是以怀孕母猪繁殖障碍和猪呼吸系统疾病为特征的传染性疾病。PRRSV具有较强的变异性，亚洲许多国家和地区均出现了高致病性的美洲型PRRSV，而且东欧地区也出出现了致病力和传染性力更强的欧洲型毒株。随着PRRSV的传播打破原有的地域限制，中国不仅存在高致病性美洲型PRRSV，同时也出现了欧洲型PRRSV，导致该病的防控更加复杂。为了更好的防控欧洲型PRRSV，本研究以欧洲型代表株LV株ORF3、ORF5基因为研究对象，构建了ORF3和ORF5基因的原核表达质粒pET-28a-ORF3、pGEX-4T-ORF5和3个重组真核表达质粒pVAX-ORF3、pVAX-ORF5和pVAX-ORF3-ORF5，并对其表达产物进行小鼠及猪的免疫评价。 将LV株ORF3、ORF5基因分别构建了原核表达质粒pET-28a-ORF3、pGEX-4T-ORF5，经IPTG诱导表达，显示目的蛋白能够以包涵体形式正确表达。免疫印迹实验表明，目的蛋白均具有良好的反应原性。ORF3和ORF5亚单位疫苗免疫仔猪实验表明，ORF3和ORF5蛋白均能刺激仔猪产生特异性抗体。细胞因子水平方面能诱导机体产生Th2类体液免疫反应。病毒载量检测结果表明，大肠杆菌表达的ORF3和ORF5亚单位疫苗对仔猪有一定水平的保护力。 将LV株PRRSV ORF3、ORF5基因插入到pVAX1真核表达载体，构建了3个重组真核表达质粒pVAX-ORF3、pVAX-ORF5和pVAX-ORF3-ORF5，转染BHK细胞进行表达。经RT-PCR、间接免疫荧光鉴定，目的基因在BHK细胞中分别得到正确表达。免疫小鼠实验表明，免疫后小鼠体内开始出现PRRSV特异性抗体，二次免疫后抗体水平继续升高，在35d达到高峰，显著高于免疫pVAX和PBS对照组。细胞免疫结果发现，核酸疫苗组刺激小鼠T淋巴细胞亚群的增殖和分化显著高于pVAX和PBS对照组。细胞因子结果表明，在14-35d细胞因子IFN-γ、IL-2增长明显，能较好的介导细胞和体液免疫。 仔猪免疫实验表明，核酸疫苗能明显刺激仔猪产生PRRSV体液免疫反应，中和抗体效价随时间推移呈不断上升趋势。仔猪细胞免疫效果表明：CD4+、CD8+T淋巴细胞SI（刺激指数）均显著高于pVAX对照组。细胞因子水平显著提高，表明核酸疫苗能够显著刺激仔猪产生Thl类细胞免疫反应，Th2类体液免疫反应。攻毒保护实验发现重组核酸疫苗能对仔猪具很好的保护力，pVAX-ORF3-ORF5免疫效果最佳。 本研究利用LV株ORF3和ORF5基因构建了核酸疫苗，同时利用原核表达系统表达了ORF3和ORF5蛋白作为亚单位疫苗，为进一步基因工程疫苗的研究发展奠定了基础。

关键词： 拟除虫菊酯   噬菌体抗体库   单链抗体   重组表达   间接竞争酶联免疫分析  

摘要： 抗体作为免疫分析的核心试剂,其制备技术一直是制约免疫分析法在农药残留分析中应用的瓶颈因素,因此寻求一种新的抗体制备方法对农残免疫分析具有重要的意义。 本研究利用噬菌体抗体库技术和基因工程技术,制备了拟除虫菊酯单链抗体,并对抗体的结构特点及其与抗原的特异性作用进行了分析。首先,从分泌拟除虫菊酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株2G2E7中提取总RNA,并反转录成cDNA。以cDNA为模板,利用兼并引物进行PCR扩增,获得了长度约350bp的重链可变区基因和约325bp的轻链可变区基因,再经重叠延伸PCR获得了750bp左右的单链抗体(scFv)基因。经过内切酶SfiⅠ和NotⅠ对scFv和pCANTAB5E载体进行酶切、连接和热激法转化大肠杆菌TG1,最终获得了库容大小2.3×107的拟除虫菊酯初级抗体库,阳性率为100%。利用抗原对抗体库进行淘选,通过五轮淘选,有效地富集了拟除虫菊酯特异性噬菌体抗体,第五轮淘选后的噬菌体阳性率为95%;随机挑取五轮淘选后的单克隆进行测序,得到3个scFv基因。将3个基因进行PCR扩增、EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后,与pET-26b载体进行连接,成功构建重组表达载体scFv-pET26b。将重组质粒转入表达菌株BL21,最终得到3个scFv-pET26b重组表达菌株。对表达条件进行优化,经超声破碎及SDS-PAGE检测,结果显示在0.1mM IPTG,200rpm,25℃低温诱导12h条件下,3个scFv蛋白能成功表达,重组蛋白主要以包涵体的形式存在于细胞内,少量以可溶形式存在。利用间接竞争ELISA初步鉴定3个scFv的活性,结果表明：拟除虫菊酯2号单链抗体(PBAscFv2)对氰戊菊酯具有一定的结合活性,10μg/mL标品浓度下抑制率约为20%。序列分析结果显示PBAscFv2蛋白共245个氨基酸,重链123个氨基酸,轻链107个氨基酸,柔性连接肽15个氨基酸;经SOPMA软件分析,PBAscFv2二级结构中含α螺旋21处,p折叠109处,p转角23处,随机卷曲92处;利用CPH models3.2Server对PBAscFv2的空间结构进行模拟,并利用Discovery Studio2.5软件将PBAscFv2与氰戊菊酯分子进行对接,结果显示抗原抗体结合区域由三部分构成：①抗体重链高可变区CDR3区(VH-CDR3)残基Met106、Asp107、Tyr108和Trp109;②轻链框架Ⅲ区(VL-FR3)残基Thr91和Ser92;③轻链高可变区CDR2区(VL-CDR2)残基Ala41、Ser42和Pro43。 本研究的开展为拟除虫菊酯类农药基因工程抗体的制备、及其在ELISA检测方法中的应用奠定了基础。