关键词： 口蹄疫   基因工程疫苗   杆状病毒   P1基因   α-干扰素   γ-干扰素   免疫效力  

摘要： 口蹄疫（Food and mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒引起的一种急性、高度接触性的人畜共患传染病。口蹄疫流行快，不易控制和消灭，在世界各地流行广泛，造成了严重的经济损失。P1是FMDV的主要免疫原性蛋白，能有效地刺激机体产生针对 FMDV 的免疫应答，是基因工程疫苗研制的候选免疫蛋白。干扰素IFN-α/γ具有广谱的抗病毒的作用，能够抑制病毒复制和病毒蛋白合成，能为机体在产生针对FMDV特异性的抗体之前提供一定的保护。　　鉴于此，本研究将杆状病毒表达系统介导表达口蹄疫P1基因和IFN-α/γ的微型病毒制备疫苗并在小鼠上评价其免疫效果，以期获得有效的口蹄疫新型候选疫苗。主要研究内容如下：　　（1）A型FMDV VP1蛋白的原核表达　　将A型FMDV VP1基因连入pET-30a原核表达载体，构建pET-30a-A-VP1重组原核表达质粒。转化至表达感受态细胞BL21中，诱导表达A型FMDV VP1蛋白。Western和SDS-PAGE结果均显示A型FMDV VP1蛋白以包涵体的形式得到有效的表达。利用变性复性包涵体蛋白的方式纯化 A 型 FMDV VP1蛋白后，通过ELISA方阵滴定，确定其最佳包被浓度为8μg/ml。为后续重组假型杆状病毒免疫原性动物试的检测奠定基础。　　（2）重组A型/O型FMDV P1基因和/或猪源IFN-α/γ基因的假型杆状病毒培养条件的优化　　将3株重组假型杆状病毒Ac-VSVG-IFNα-2AP1、Ac-VSVG-IFNα-2IFNγ和Ac-VSVG-IFNγ-GMP1分别接种sf9细胞，对最佳培养条件进行优化，结果表明以0.2MOI接毒贴壁sf9细胞，培养72h病毒的滴度最高。遗传稳定性实验结果显示3株重组假型杆状病毒的遗传稳定性良好，能在体外稳定增殖。Western blot和IFA结果表明重组假型杆状病毒能有效表达外源蛋白。以优化后的培养条件接种sf9细胞进行培养，将3株重组杆状病毒大量扩增并制成疫苗，每份疫苗的含量为2×106TCID50。检测结果表明所制成的疫苗较好并无交叉污染，且无细菌污染。　　（3）重组A型/O型FMDV P1基因和/或猪源IFN-α/γ基因的假型杆状病毒疫苗的免疫效果评价　　以 6-8 周龄 SPF 级昆明雌鼠为模型并采取不同的免疫方式评价Ac-VSVG-IFNα-2AP1、Ac-VSVG-IFNα-2IFNγ、Ac-VSVG-IFNγ-GMP1 3种疫苗的免疫效果。一种免疫方式为 0d 进行第一次免疫，14d 后进行第二次免疫;另一种免疫方式为0d进行第一次免疫，28d进行二免。在免疫后0d、14d、28d、42d、56d采集血清样品检测机体产生针对FMDV的抗体水平。利用间接ELISA检测针对A型FMDV VP1的抗体水平，结果表明Ac-VSVG-IFNα-2AP1能产生针对A型FMDV VP1的ELISA抗体。同时利用间接ELISA检测针对O型FMDV VP1 的抗体水平显示只有 Ac-VSVG-IFNγ-GMP1 免疫组小鼠能产生一定量的抗体水平，但是相对商品化疫苗对照组来说，抗体水平较低（p﹤0.05）。同样，中和试验结果也显示疫苗免疫组小鼠只能诱导机体产生较低水平的体液免疫应答。实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN mRNA表达结果显示试验组疫苗能够产生较高水平的细胞免疫应答。

关键词： 柱状黄杆菌   外膜蛋白   免疫原性   疫苗  

摘要： 柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)是一种革兰氏阴性细菌,是引起鱼类柱形病(Columnaris disease)的病原。该菌能感染多种淡水性鱼类,给水产养殖业造成重大的经济损失。目前,主要依靠使用化学药物对柱形病进行预防和治疗,然而药物的大量使用会导致水产品药物残留的食品安全问题,以及对水生态系统的影响和耐药菌株的出现等问题。开展柱状黄杆菌基因工程疫苗的研究将为柱形病的防治提供新思路和更为有效的方法。细菌的外膜蛋白是细菌与宿主相互作用的界面,容易被宿主识别而引起机体的免疫反应,因此被认为是制备抗原的良好材料。利用双向电泳(2-DE)并结合免疫印迹的方法,在柱状黄杆菌外膜蛋白中筛选到5个免疫原性蛋白,经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)鉴定,它们是:gliding motility lipoprotein Gld J(Gld J)、hypothetical protein FCOL9735(fcol)、F0F1 ATP synthase subunit beta(f0f1)、lipoprotein(lip)和outer membrane efflux protein precursor(omepp)。将这5个免疫原性蛋白基因进行PCR扩增后,与原核表达载体p ET28a连接,分别构建了原核表达质粒p ET28a-gld J、p ET28a-fcol、p ET28a-lip、p ET28a-f0f1和p ET28a-omepp。然后,将这些质粒分别转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21感受态细胞,并通过IPTG诱导表达相应的蛋白。将纯化后的蛋白免疫草鱼,草鱼体内产生了特异性的抗体,而且一些免疫相关基因的表达也有上调,这些基因包括Interleukin 1β(IL-1β)、IL-8和IL-10,IFN-I和IFN-γ、Immunoglobulin M(Ig M)、Ig D、Ig Z、Major histocompatibility complex I(MHC Iα)和MHC IIβ、C-reactive protein(CRP)。这5个重组蛋白,rgld J、rfcol、rf0f1、rlip和romepp对用柱状黄杆菌攻毒后草鱼的免疫保护率依次为72%、8%、32%、64%和68%。且rgld J、rlip和romepp蛋白免疫组的草鱼血清对柱状黄杆菌的生长有显著的抑制作用。这些实验结果表明这3个基因是柱状黄杆菌的保护性抗原基因,可以作为制备柱状黄杆菌基因工程疫苗的候选抗原。另一方面,毒力因子被认为是很好的疫苗候选基因。为了提高免疫原性和增强保护效果,将柱状黄杆菌的5个可能的毒力因子基因,锌蛋白酶、脯氨酸寡肽酶、嗜热蛋白酶、胶原酶和硫酸软骨素AC裂解酶的抗原片段进行融合,构建了它们的融合复合体的原核表达质粒p ET32a-zptcc,并表达了相应的融合蛋白。将纯化后的融合蛋白免疫草鱼,发现草鱼血清中出现了特异性抗体,且免疫后草鱼血清中IL-1β、IL-8、IL-10、Ig M、IFN-I、CRP和MHC Iα等基因出现显著上调,而且该融合蛋白对用柱状黄杆菌攻毒后草鱼的免疫保护率为39%,说明该融合蛋白有一定的免疫保护效果。

关键词： 札幌病毒   衣壳蛋白   病毒样颗粒   酶联免疫吸附试验  

摘要： 札幌病毒(sapovirus,Sa V)属于杯状病毒科(Caliciviridae)、札幌样病毒属(Sappora-like virus),是单股正链的一种RNA病毒。可以引起人和动物的急性病毒性胃肠炎及腹泻,通常通过粪便和口腔交叉感染。猪札幌病毒(Porcine Sapovirus,Po Sa V)能够引起仔猪腹泻并广泛存在于世界范围内。近年来,Sa V的研究内容相对较少,最新研究显示,Sa V能够感染多种物种,不同基因型的Sa V在遗传进化方面和抗原表位上有很多相似之处,并且已发现来自于人源和猪源重组的Sa V毒株,说明Sa V存在一定的跨种传播能力,严重时会对公共卫生安全构成潜在的威胁。因此,研究较方便的ELISA诊断方法和免疫原性较好、安全性较高的预防性疫苗抗击病毒感染是一个紧迫的任务。VP1序列为猪Sa V(Porcine Sapovirus,Po Sa V)的主要衣壳蛋白组成成分,可分为S区和P区。以Sa V(CH430株)的RNA作为扩增模板得到目的基因并将其克隆到p ET-30a载体中,并将成功构建的阳性质粒转入BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达。纯化出Po Sa V的VP1以及S区和P区蛋白,分别将S蛋白和P蛋白进行HRP标记,通过优化ELISA包被浓度和封闭时间,一抗二抗稀释度,封闭时间等条件成功建立了Po Sa V双抗原夹心ELISA,为Sa V的血清学诊断提供了依据。同时将原核表达的VP1、P、S蛋白纯化后分别免疫了家兔和仔猪,制备了两种动物源的高免血清,为研究免疫原性和蛋白检测等提供了实验基础。VP1是Po Sa V virus-like particles(VLPs)组装的必需区,将Po Sa V VP1编码蛋白的基因序列插入p Fast BacTM HTB载体中,转入DH10BACTM感受态细胞构成阳性重组杆粒;用重组阳性的杆粒转染sf9细胞得到重组杆状病毒,将其感染细胞至第三代杆状病毒,提取杆状病毒RNA和DNA,经PCR扩增鉴定外源基因没有丢失;采用TCID50方法确定重组病毒滴度;将重组病毒感染sf9细胞进行蛋白表达。表达的蛋白通过共聚焦显微镜以及Western-blots试验证明外源基因成功在昆虫细胞内表达,相对分子质量为58-61k Da,与预测蛋白大小一致,并且为非分泌型蛋白,主要分布在细胞核周围以及细胞质中。蛋白经过浓缩处理后,进行蔗糖密度梯度离心纯化,通过电子显微镜观察VLPs大小和形态均模拟天然病毒结构。同时,将Po Sa V VLPs免疫仔猪,通过建立的双抗原夹心ELISA方法检测抗体的生成并且稳定后,进行了攻毒试验,免疫组的仔猪可以有效地抑制病毒在肠道内的复制,而对照组不能抑制病毒的复制。证明VLPs刺激机体产生的抗体能够阻止机体组织与病毒表面的抗原结合,阻止病毒黏附靶细胞受体,防止侵入细胞,从而起到保护的作用。Sa V-VLP疫苗对于猪Sa V的防治具有良好的前景,可作为预防猪Sa V的疫苗之一,本研究为Po Sa V基因工程亚单位疫苗的研究奠定了基础。

关键词： 毕赤酵母   CD25   达利珠单抗   biscfv   白喉毒素  

摘要： 目的和意义CD25表达于活化T细胞表面,静息T细胞不表达,这为靶向治疗以活化T细胞介导的疾病如T细胞淋巴瘤、自身免疫病、移植排斥反应等提供了科学依据。采用毕赤酵母表达系统,以Daclizumab(人源化抗CD25单抗隆抗体)为基础,构建重组表达载体pPICZalpha A-biscfv (Daclizumab)和pPICZalpha A-dmDT390-biscfv (Daclizumab),在重组毕赤酵母GS115菌株中诱导表达biscfv (Daclizumab)和dmDT390-biscfv (Daclizumab)重组蛋白,为淋巴瘤、急性排斥反应、自身免疫病等疾病提供新的药物治疗方案。研究方法合成目的基因及构建表达载体：利用DNAWorks软件,获得具有互补末端的寡核苷酸引物,采用装配PCR法,合成四条短的基因片段scfv (1)、scfv (2)、scfv (3)、 dmDT390并连接至pMD19-T载体,测序正确后,四条短的基因片段酶切拼接后最终连入毕赤酵母表达载体pPICZalpha A。采用毕赤酵母系统表达蛋白：线性化的表达载体通过氯化锂转化方法转至毕赤酵母GS1 15,在含有博来霉素的YPDS平板中筛选阳性克隆子。采用BMGY培养基增殖培养,BMMY培养基诱导蛋白表达。SDS-PAGE和Western blot:蛋白样品经SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜上,采用鼠抗组氨酸尾抗体作为一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体作为二抗,采用化学发光试剂盒观察结果。蛋白纯化：采用镍柱纯化蛋白,纯化出的蛋白采用高效液相色谱仪(HPLC)进行分析。结果1.通过DNAWorks软件设计出合成scfv (1)、scfv (2)、scfv (3)的24条寡核苷酸引物,以及合成dmDT390的44条寡核苷酸引物,通过装配PCR将合成的基因片段连入pMD19-T载体,测序获得插入正确基因片段的pMD19-scfv(1)、pMD19-scfv (2)、pMD19-scfv (3) 和 pMD19-dmDT390载体。pMD19-scfv (1)和pMD19-scfv(2)经酶切拼接后最终连入pPICZalpha A载体形成了pPICZalpha A-biscfv表达载体;pMD 19-scfv(2)、pMD 19-scfv(3)和pMD19-dmDT390经酶切拼接后最终连入pPICZalphaA载体形成了pPICZalpha A-dmDT390-biscfv表达载体。2.经氯化锂转化法获得了稳定整合目的基因的毕赤酵母菌株。3.整合了biscfv目的基因的毕赤酵母菌,表达产物经SDS-PAGE(还原性)电泳分析,得到分子量约为55kd表达产物,western blot验证含组氨酸尾,为目的蛋白。4.整合了dmDT390-biscfv目的基因的毕赤酵母菌,表达产物经SDS-PAGE(非还原性)电泳分析,得到分子量约为95kd表达产物,western blot验证含组氨酸尾,为目的蛋白。5.经镍柱纯化的蛋白经高效液相色谱仪检测纯度大于99%。结论重组毕赤酵母GS115能稳定表达biscfv和dmDT390-biscfv蛋白,蛋白经镍柱纯化后能获得高纯度的蛋白。

关键词： 诺如病毒   单克隆抗体   抗病毒药物   中和活性  

摘要： 人诺如病毒(Human Norovirus，HuNoV)是导致急性肠胃炎的主要病原体之一。流行病学调查表明，NoV基因组(Genogroup，G)Ⅰ和NoVGⅡ是世界范围内流行最主要的基因组。但目前尚无针对NoV的疫苗和治疗性药物。因此，本研究以开发针对NoV的有效干预策略为目的，开展了三部分研究工作:(1)NoV病毒样颗粒(Virus-like Particle，VLP)的重组表达及鉴定;(2)NoV单克隆抗体的筛选、鉴定及特性分析;(3)NoVVLP免疫原性的评价。　　在第一部分工作中，我们首先按照昆虫细胞密码子的偏好性分别对GⅠ.1VP1和GⅡ.4 VP1的核酸序列进行优化，序列合成后分别插入到杆状病毒的重组表达载体中，并在昆虫细胞中表达。SDS-PAGE结果显示,GⅠ.1和GⅡ.4 VP1蛋白大小约为58KD。经蔗糖密度梯度和电镜分析表明，NoVGⅠ.1VP1和NoVGⅡ.4VP1蛋白都可以自发组装成直径约为38nm病毒样颗粒，分别命名为GⅠ.1-VLP和GⅡ.4-VLP。　　在第二部分工作中，我们利用杂交瘤技术从分别免疫了GⅠ.1-VLP和GⅡ.4-VLP小鼠中筛选到了11株单克隆抗体，其中，1F7、2E12、4H12和9C2可特异性识别GⅠ.1-VLP;D11、G9、2D8和8E1可以特异性识别GⅡ.4-VLP;6B7、7H7和7D8可交叉识别GⅠ.1-VLP和GⅡ.4-VLP。NoV VLP与粘液素结合抑制试验表明，2E12和4H12对GⅠ.1显示了良好的潜在中和活性，而D11、G9和8E1对GⅡ.4显示了强大的潜在中和活性。鉴于4H12和8E1分别对GⅠ.1-VLP和GⅡ.4-VLP具有强大的结合活性，我们利用4H12和8E1分别建立了对GⅠ.1-VLP和GⅡ.4-VLP的夹心EL SA定量方法，最低检出限度分别为0.15625ng和0.625ng。　　在第三部分工作中，我们评价了NoV VLP的免疫原性及其与肠道病毒EV71型(Enterovirus71，EV71) VLP的免疫兼容性。在一个试验中，我们评价了由GⅡ.4-VLP和EV71-VLP组成的Bi-VLP在小鼠中的免疫原性。结果显示Bi-VLP可以诱导针对GⅡ.4和EV71持久的均衡的特异性抗体反应。在另一个试验中，我们用GⅠ.1-VLP、GⅡ.4-VLP和EV71-VLP组成的Tri-VLP免疫小鼠，发现Tri-VLP也可诱导针对的GⅠ.1、GⅡ.4和EV71均衡的持久的特异性抗体反应。　　综上，我们得出以下结论:(1)我们在昆虫细胞表达系统中成功地表达出了NoV GⅠ.1-VLP和NoV GⅡ.4-VLP;(2)我们筛选得到了一系列抗NoV的单克隆抗体，建立了对NoV VLP定性和定量的方法，并且获得的单克隆抗体4H12和8E1还具有良好的潜在中和活性;(3)由NoV VLP和EV71-VLP混合组成的双价和三价疫苗可均衡诱导出针对NoV和EV71病毒的中和性抗体，相互之间无免疫抑制或免疫优势。　　以上结果为NoV检测试剂盒和抗病毒药物的开发提供了依据，同时也为进一步开发NoV和EV71的多价疫苗奠定了基础。

关键词： 动物基因工程疫苗   企业国家重点实验室   兽用生物制品行业  

摘要： 近期,国家科技部下发《科技部关于批准建设第三批企业国家重点实验室的通知》,青岛易邦生物工程有限公司获得批准建设"动物基因工程疫苗国家重点实验室",这是中国兽用生物制品行业建设的首个企业国家重点实验室。

关键词： 猪流行性腹泻病毒   疫苗载体   重组病毒   病毒拯救  

摘要： 猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的急性"接触性"高度传染性消化道疾病，主要症状为呕吐、水样腹泻和脱水。PED的波及范围广，在全球均有病例报道。近几年，该病在中国广泛蔓延，造成了严重的经济损失，引起了中国各研究单位对其病原PEDV的关注。 目前，PEDV商品化疫苗保护效力在逐年降低，主要有两个原因，一是目前商品化疫苗与流行毒株的抗原性不匹配，二是减活疫苗毒株由于体外适应传代培养而被过度弱化。因此，新型疫苗的开发具有重要意义。本研究旨在通过靶向RNA重组反向操作平台，将2013年流行的3株细胞适应毒株的S基因分别替换掉原疫苗株（DR13）S基因，最终装配出3株重组疫苗毒株作为疫苗候选毒株，为后期研发的新一代减毒活疫苗奠定基础。 本研究分为两个部分。 第一部分：构建猪流行性腹泻病毒基因工程疫苗载体。选择三株2013年流行的细胞适应毒株KF804028, KF650372, KF650375的S基因作为免疫原性基因。根据Genbank中KF804028，KF650372,KF650375的S基因的序列，通过引物小片段(三条基因共94段)进行overlap PCR，形成一级片段，将融合得到的一级片段连接pJET-Blunt载体进行克隆并且测序。选择测序正确的Blunt载体，用引物进行PCR扩增，形成13段正确的一级片段。将相邻有21bp碱基重合区域的一级片段再次进行PCR片段融合，形成二级片段，同样的方法，逐级放大至四级片段，合成出3段PED流行毒株S (4161bp)基因。PED流行毒株S (4161bp)基因通过同源重组的方法与p-PEDV-ΔS DR13连接，并且克隆测序，从而获得正确的重组质粒，即猪流行性腹泻病毒（PEDV）基因工程疫苗载体。三个重组质粒分别命名为pPEDV-DR13ΔS/KF804028S、pPEDV-DR13ΔS/KF650372S、pPEDV-DR13ΔS/KF650375S。 第二部分：重组病毒的拯救。将已经构建好的三个携带流行的细胞适应毒株S基因的重组质粒体外转录成RNA，通过电转，使流行毒株的S基因整合进入PEDV病毒基因组，再将重组的PEDV（rPEDV）感染VERO细胞，从而获得能够在VERO细胞上产生CPE并且连续传代的重组PEDV。三个重组病毒分别命名为PEDV-DR13ΔS/KF804028S、PEDV-DR13ΔS/KF650372S、PEDV-DR13ΔS/KF650375S。

关键词： Cry2Aa毒素蛋白   噬菌体展示   十二肽   单链抗体   抗独特型抗体  

摘要： 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)以生物制剂或转基因植物的形式被广泛运用于农业和卫生害虫的生物防治,其在带来巨大经济和社会效益的同时,也存在着生态安全隐患,因此转Bt基因产品的检测监控技术是其产品安全管理、市场监管和风险评估的技术基础和必要保障。目前检测技术正随着基因工程抗体的不断发展而改革创新。新型抗体-十二肽和单链抗体(single-chain antibody fragment,scFvs)已逐渐应用于免疫学检测领域。十二肽是将随机十二肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pⅢ)上,所展示的十二肽表达在pⅢ的N末端,目前主要应用于模拟抗原表位;单链抗体(ScFv)是重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)由氨基酸Linker拼接而成,分子量约为30 kD。这些新型抗体可以保持与抗原结合的特异性并且无需免疫手段,通过原核表达大量制备。噬菌体展示技术正是筛选、制备和表达单链抗体的一种最有效方式,而且也是获得抗独特型抗体的一种新的制备方式。利用噬菌体展示技术将抗体的基因型和表现型相结合的独特优势,为进一步开展亲和力成熟及蛋白结合机制等研究提供了基础。以此为基础,本文开展了以下二个方面的内容:1.建立基于十二肽检测Cy2Aa毒蛋白的间接竞争ELISA检测方法利用噬菌体展示随机十二肽库对Cry2Aa毒素蛋白进行四轮筛选,并从第4轮产物中随机挑选了 20个克隆,通过单克隆ELISA法鉴定出这些克隆均能与Cry2Aa毒素特异性结合。经过PCR扩增、DNA电泳鉴定及测序,推导出8条不同的序列。挑取阳性值最高的克隆GT(氨基酸序列为GTPWHHHRHLIV),由此建立了基于十二肽的Cry2Aa 蛋白的间接竞争ELISA检测方法。该方法的抑制中浓度(IC50)为1.139μg/mL,最低检测限IC10为0.0211μg/mL,线性检测范围为0.0478～22.691μg/mL(y=23.091gx+48.692,R2=0.9963)。噬菌体展示肽库筛选方法为快速、准确地检测Cry2Aa毒蛋白提供了新的途径。2.建立基于单链抗体检测Cry2Aa毒蛋白的双抗夹心ELISA检测方法通过优化固相化筛选策略,利用人源化噬菌体抗体库(TomLinson Ⅰ)筛选抗Cry2Aa毒蛋白的单链抗体(SingLe-chain antibodies,scFv)。经4轮"扩增-吸附-洗脱"后,从最后一轮洗脱产物中随机挑取200个单菌落进行单克隆ELISA鉴定,对阳性克隆进行PCR扩增、DNA电泳鉴定及测序,成功筛选获得12个阳性噬菌体scFvs,经鉴定均有完整外源基因片段插入。将相相对结合活性最好的阳性隆scFv-A3替换到宿主菌HB2151中进行可溶性诱导表达并纯化。并利用纯化后的scFv-A3作为"捕获抗体",Anti-Cry2Aa兔多克隆抗体作为"检测抗体",建立针对Cry2Aa的双抗夹心ELISA检测方法。结果表明,该方法的最低检测限为1.08 ng/mL线性检测范围在7.1ng/mL-3.8μg/mL,线性回归方程为y=167.96x+0.4513(R2=0.9909)。***2Aa毒蛋白的抗独特型单链抗体的筛选以Cry2Aa为免疫原免疫新西兰大白兔得到Cry2Aa的多克隆抗体。再以亲和纯化Cry2Aa多抗和阴性抗体作为包被原,通过扣除筛选(subtractive panning)策略在人源化噬菌体抗体库Tomlinson Ⅰ中,淘选Cry2Aa毒蛋白的抗独特型单链抗体。分别采取两种试验方案:一种是只进行一轮筛选,洗涤次数为40次;另一种是进行四轮筛选,逐级降低包被原,增加洗脱次数,具体方法同抗Cry2Aa单链抗体的筛选方法。两种方法均挑取200个克隆。结果显示:只经过一轮筛选,可获得并鉴定出38个阳性克隆;经过四轮筛选之后获得125个阳性克隆。再通过与受体(小菜蛾的BBMV)结合后,其中B10的OD450为0.806最高,F2为0.584次之,阳性对照1.472,阴性对照0.138,无关克隆反应值0.105。说明B10和F2均与小菜蛾的BBMV有一定的结合活性,确定这2个抗独特型抗体的亚型为Ab2β,为下一步杀虫活性研究提供了初步基础。

关键词： 炎症反应   信号传导   抗TLR4抗体Fab片段   TLR4   LPS  

摘要： TLR4受体是一种模式识别受体,在对TLR4的研究中发现,TLR4在LPS介导的严重反应中起着关键的调节作用。TLR4通过依赖MyD88途径或不依赖MyD88途径调节LPS在细胞内的信号传导,从而控制内毒素发挥生物学效应。阻断TLR4介导的内毒素信号向细胞内的传导,是减轻内毒素生物学效应的有效的方法。本课题在上一阶段的研究中成功制备出了鼠抗人TLR4单克隆抗体,体外活性检测显示其能显著抑制经LPS刺激TNF‐α的产生。但鼠源单克隆抗体在人体治疗中易出现人抗鼠抗体(HAMA)反应。嵌合抗体技术是将人源抗体恒定区替代鼠抗体的恒定区,构建人鼠嵌合抗体,不仅可以保留亲本抗体的高亲和力,而且大大降低鼠单克隆抗体在人体应用中的免疫原性。本研究在嵌合抗体技术的基础上,针对人源抗TLR4抗体设计合成抗TLR4抗体Fab片段基因,利用重叠延伸法扩增Fab片段基因,构建表达质粒并转化大肠杆菌,探索其原核表达,以期获得有效的抗TLR4抗体Fab片段。研究方法:1.制备人源抗TLR4抗体Fab片段利用PCR技术从本课题上一阶段筛选的阳性噬菌体中扩增抗体重链可变区VH和轻链可变区VL基因,采用重叠扩展延伸法成功将人源抗体恒定区重链与轻链分别与噬菌体扩增的可变区重链和轻链拼接,获得重组重链Fd和轻链;进一步构建重组质粒pETDuetTM‐1‐Fab;转化大肠杆菌BL21诱导表达,获得高纯度的人源抗TLR4抗体Fab片段。2.鉴定Fab抗体与抗原的相互作用及测定抗体亲和常数采用流式细胞仪及BiacoreX100仪分别检测抗TLR4抗体Fab片段特异性识别TLR4抗原的能力及抗体的亲和力。3.抗体体外中和试验体外中和实验检测抗TLR4抗体Fab片段对炎症因子TNF‐α的中和作用。研究结果：1.成功扩增获得重组重链Fd和轻链DNA片段;构建重组原核表达质粒pETDuetT‐1‐Fab;转入大肠杆菌诱导表达后,亲和纯化获得高纯度的抗TLR4抗体Fab片段。***及流式细胞仪检测结果显示,本研究中所制备的抗体能够与hTLR4特异性结合。3.本研究中所制备的抗TLR4抗体Fab片段亲和常数为1.619*10‐7。4.人源抗TLR4抗体Fab片段在体外可有效的保护细胞,中和肿瘤坏死因子TNF‐α。结论:本研究成功制备人源抗TLR4抗体Fab片段,该抗体可与hTLR4特异性结合,亲和力较高,在体外可有效中和肿瘤坏死因子TNF‐α,保护细胞。表明通过基因工程获得了人源单克隆抗体,为抗TLR4抗体的进一步研究和应用打下了坚实的基础,可能为炎症相关性疾病的治疗提供了一种新的预防和治疗生物制剂。

关键词： 基因工程抗体   分子模拟   基因突变   亲和力成熟  

摘要： 基因工程重组抗体可通过对基因序列的分析、修饰与修改,从而改进抗体特性。对基于基因突变的基因工程抗体亲和力成熟的方法进行总结,主要包括小分子有机物-抗体相互作用机制分析、抗体序列数据库及计算机模拟技术,以及新兴的分子模拟与对接技术。