关键词： EHEC O157∶H7   抗原   疫苗  

摘要： 肠出血型大肠埃希菌O157∶H7(EHEC O157∶H7)是重要的新发传染病,多次在世界范围内暴发流行。EHEC O157∶H7可引起出血性肠炎、溶血性尿毒综合症、血栓性血小板减少性紫癜等,严重者可导致死亡。研制安全、有效的疫苗是预防其感染最简单、经济、快捷的手段,但尚未有可用于人的疫苗。EHEC O157∶H7的毒力因子主要有T3SS相关蛋白、志贺毒素和表面菌毛及非菌毛黏附物质等,目前研究的疫苗种类包括单个毒力因子或者多个毒力因子融合的亚单位疫苗、DNA疫苗、载体活疫苗及BG疫苗等。本文通过阐述EHEC O157∶H7主要保护性抗原,就近年来EHEC O157∶H7基因工程疫苗研究进展进行综述,为其疫苗的研制提供新思路。

关键词： 兔出血症病毒   VP60   实时荧光定量PCR   基因工程疫苗   抗体   细胞因子  

摘要： 兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)俗称兔瘟,是由兔出血症病毒(Rabbit haemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种高传染性,高致死性的急性烈性传染病,给养兔业和相关行业带来了巨大的经济损失。RHDV属于杯状病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus),为单股正链RNA病毒,含有1条约7.4 kb的基因组和1条约2.2 kb的亚基因组。VP60是RHDV的主要结构蛋白,是病毒的免疫保护性抗原,是RHD诊断和疫苗研发的重要分子。RHD无有效的治疗手段,目前控制的主要措施为疫苗免疫预防。为了更好地控制和预防兔出血症,本论文从RHDV的检测和RHD基因工程疫苗的免疫保护机制两方面进行研究。根据VP60蛋白基因序列设计引物建立兔出血症病毒SYBR Green RT-PCR检测方法,利用该方法对不同时间点不同样品中病毒含量的动态变化进行分析;另外从体液免疫应答和细胞免疫应答两方面评估兔出血症基因工程疫苗的免疫保护机制。主要研究内容如下:1.兔出血症病毒SYBR Green RT-PCR检测方法的建立及应用根据兔出血症病毒的VP60蛋白基因序列设计引物,经过反应体系和反应条件的摸索和优化,建立了重复性好、敏感性强的RHDV SYBR Green RT-PCR检测方法,可有效检出重组质粒为14.6拷贝/μL的样品。利用该方法对RHDV感染兔6h、12h、24 h、30 h、36 h的血清、肝、脾中的病毒含量动态变化进行检测。结果表明,血清、肝、脾三种样品中病毒含量均呈现时间依赖效应,随着时间增加,其病毒含量呈现几何数增长。家兔感染RHDV12h、24h、30h及36h后,血清中病毒含量分别达到约105、106、107、108拷贝数;肝脏中病毒分别达到约105、108、108、109拷贝数;脾脏中病毒含量分别达到约105、108、108、108拷贝数左右;肝脏中的RHDV含量最高,说明肝脏是其主要的靶组织。2.兔出血症基因工程疫苗免疫保护机制的研究为研究兔出血症基因工程疫苗的免疫保护机制,以兔出血症基因工程疫苗免疫健康易感家兔,同时设立组织灭活疫苗免疫组和PBS空白对照组,从体液免疫应答和细胞免疫应答两个方面评估疫苗的免疫效力。分别在免疫接种后0、3、7、14、21、28 d采集各组兔血液,通过ELISA方法检测血清中RHDV特异性抗体IgG和IgM水平以及细胞因子白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)的水平变化;用血凝抑制(HI)检测血液中总抗体的水平变化,于21 d对所有试验动物攻毒,以攻毒保护试验评估疫苗的免疫保护能力。试验结果表明,免疫后7天、14天和21天,组织灭活疫苗组和基因工程疫苗组血清中特异性抗体IgG、IgM均显著升高,与对照组相比差异显著(P<0.05);基因工程疫苗组与对照组相比,免疫后3天、7天和14天血清中IL-2、IL-4和IFN-y含量均显著(P<0.05)增高,组织灭活疫苗组与对照组相比,血清IL-2含量无显著(P>0.05)差异,IL-4和IFN-y含量显著(P<0.05)升高;与对照组相比,免疫后7天、14天、21天两组疫苗组血清的血凝抑制效价均显著升高(P<0.05);同时还发现,基因工程疫苗组诱导产生的特异性抗体(IgG、IgM)、细胞因子(IL-4、IFN-γ)均比组织灭活苗组高,且免疫后3天、7天、14天、21天以及28天基因工程疫苗组血清中IL-2显著(P<0.05)高于组织灭活苗组;攻毒保护试验结果显示,两种疫苗均能100%保护RHDV的攻击。因此,兔出血症基因工程疫苗可诱导产生特异性体液免疫和细胞免疫应答反应,有效预防兔出血症。

关键词： CD45   基因工程抗体   哺乳细胞表达系统  

摘要： 【目的】构建两种新型抗人CD45哺乳动物细胞表达表达载体,利用DHFR系统筛选出能稳定高表达抗CD45基因工程抗体的细胞株,为以人CD45为靶点的研究奠定基础。【方法】(1)PCR扩增得到抗CD45抗体的轻链可变区VL区和重链可变区VH区基因,通过基因工程技术构建抗人CD45抗体的真核表达载体,得到Anti-CD45-scFv-Fc与pBudce-CD45[H+L]。(2)将两者转染HEK-293T细胞获得瞬时转染表达,用Elisa方法检测两种真核表达载体的抗体表达量的差异。用流式细胞术检测两种抗体与CD45-/+细胞系的结合。(3)采用抗原抗体系统和生物素亲合素系统Western blot方法,鉴定抗体与CD45分子的结合特异性。(4)挑选表达量较高,结合活性好以及具有结合特异性的抗体用于后续实验研究。筛选出稳定高表达Anti-CD45-scFv-Fc的DG44-CHO细胞株。【结果】(1)通过分子生物学技术将抗体基因片段分别克隆至载体,得到载体Anti-CD45-scFv-Fc与pBudce-CD45[H+L],经测序鉴定显示其载体DNA序列正确,表明两种哺乳细胞表达载体均构建成功。(2)用Elisa方法检测Anti-CD45-scFv-Fc与pBudce-CD45[H+L]两种载体转染HEK-293T细胞后的抗体瞬时表达量分别为2mg/L和0.3mg/L。(3)采用流式细胞术检测结果表明,Anti-CD45-scFv-Fc载体表达的抗体与CD45+多种细胞株(KG1a,K562,Jurkat)结合活性接近单克隆抗体,而与CD45-的多种细胞株(HepG2,A549,B16,HU)结合活性低。pBudce-CD45[H+L]载体表达量过低,因此选择表达量高的Anti-CD45-scFv-Fc载体用于后序实验。(4)Western blot鉴定结果表明Anti-CD45-scFv-Fc载体表达的抗体与高表达CD45分子细胞株总蛋白在250kD处有结合条带,符合CD45分子理论值170-250kD,而与不表达CD45分子的细胞株总蛋白在相同位置无结合条带。同时,Anti-CD45-scFv-Fc抗体与生物素标记的人CD45(rhCD45)作用,HRP标记的亲和素显色,还原抗体与非还原抗体分别在约60kD和120 kD处有结合,符合单价抗体(包含Fc段)与双价抗体分子量大小,证实所构建的载体转染哺乳动物细胞成功表达双价抗体,并可与CD45分子的特异性结合,达到了预计形成的抗体结构模式。(5)用DHFR系统筛选获得了稳定转染Anti-CD45-scFv-Fc的DG44-CHO细胞,并证实了该系统对抗体的结合活性等无明显影响,可大量表达抗体进行后续效应实验。【结论】成功改造鼠源性单克隆抗CD45抗体,构建了表达抗人CD45抗体的哺乳细胞表达载体Anti-CD45-scFv-Fc,DHFR系统筛选获得稳定高表达Anti-CD45-scFv-Fc的DG44细胞株。

关键词： 狂犬病病毒   糖蛋白   腺相关病毒   疫苗   多克隆抗体   神经嗜性   神经退行性疾病   基因治疗   细胞系构建   CRISPR  

摘要： 狂犬病毒是由弹状病毒科狂犬病毒属的成员,它是一种单股负链RNA病毒,其基因组主要编码5种结构蛋白,从3’端到5’端依次为核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和依赖RNA的RNA多聚酶(L)。其中,G蛋白不仅是唯一可以诱导机体发生免疫反应产生中和抗体的抗原蛋白,还决定病毒的细胞嗜性和病毒吸附细胞的能力,从而使狂犬病毒具有强烈的神经嗜性。狂犬病是狂犬病毒引起的一种人畜共患、急性、致死性的传染病,机体一旦感染发病,死亡率100%。目前,尚无有效的治疗方式,暴露前疫苗免疫是最好的预防措施。同时,由于狂犬病毒G蛋白在体外难以表达纯化,所以G蛋白多克隆抗体和单克隆抗体难以制备。基于以上背景,本课题主要从以下3个方面进行:1.狂犬病毒亚单位疫苗的制备根据G蛋白可以诱导机体产生中和抗体的特点,使用具有安全性高,免疫原性低、表达持续时间长等优点的腺相关病毒表达载体AAV病毒载体表达G蛋白,制备一种新型的亚单位疫苗。本课题选取了狂犬病毒疫苗株SADL16的G蛋白(包括第194、333位氨基酸突变和未突变类型)、、B2C株G蛋白及N2C株G蛋白作为表达对象。同时我们在表达载体中插入土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)以提高G蛋白表达量。质粒构建完成后在HEK-293T细胞系上包装成能表达G蛋白的亚单位疫苗,经过滴度测定、G蛋白表达检测后,通过肌肉注射免疫6周龄雌性Balb/c小鼠,然后分别在免疫后第1、2、3、9月末检测小鼠体内中和抗体水平。结果表明,免疫组小鼠产生较高水平的中和抗体,且比疫苗对照组存在明显的优势。为了检测抗体是否可以在狂犬病毒感染后产生保护力,以50倍的狂犬病毒CVS-24株半数致死剂量进行病毒感染实验。攻毒实验表明,该表达G蛋白的AAV亚单位疫苗可以为机体提供有效的保护力。与其他疫苗相比,该疫苗具有成本低、免疫程序简单(只需一次免疫即可)、贮存和运输条件要求低(4℃)以及抗体水平持续时间长等优点。2.G蛋白多克隆抗体的快速制备由于G蛋白在体外难以表达纯化,可以利用表达G蛋白的AAV重组病毒免疫小鼠,然后收集其血清作为G蛋白的多克隆抗体。间接免疫荧光实验结果也表明,可以利用此方法快速制备G蛋白的多克隆抗体。3.狂犬病毒作为基因治疗载体的改造由于狂犬病毒具有严格的嗜神经性,我们尝试逐步改造狂犬病毒,提高其安全性,并最终作为神经退行性疾病基因治疗的转移载体使用。首先,我们将BDNF、NGF插入缺失G蛋白的狂犬病毒基因组,然后在此基础上再缺失狂犬病毒M蛋白和P蛋白。目前,狂犬病毒G蛋白缺失株已经在B7GG细胞系拯救完成,后者由于没有对应的细胞系可以完成病毒的拯救,所以我们利用CRISPR技术在B7GG细胞系基础上构建同时表达M、P、G蛋白的细胞系。同时,本课题以AAV重组病毒过表达α-突触核蛋白构建帕金森综合征(Parkinson’s disease,PD)疾病模型,目前已完成了前期的质粒构建及病毒包装工作。目前没有细胞系可以用于缺失M、P蛋白的狂犬病毒的拯救,所以我们B7GG细胞系的基础上,利用CRISPR技术将狂犬病毒的M、P蛋白敲入B7GG细胞基因组,构建同时表达狂犬病毒M、P、G蛋白的细胞系。在此过程,我们将B7GG细胞系中绿色荧光蛋白(GFP)替换为红色荧光蛋白(m Cherry)以便于细胞筛选工作,同时将潮霉素基因也克隆到该细胞系利于细胞的抗性筛选。将重组目的基因片段与g RNA共转染B7GG细胞后,经过潮霉素和流式筛选,我们易获得同时表达M、P、G蛋白的细胞系(B7CMPG)。

关键词： PEDV S1蛋白   杆状病毒表达载体系统   表面展示   基因工程疫苗  

摘要： 猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是全球流行的极具威胁性的猪病之一,由具有高致死率的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起。该病在世界各地的爆发给全球养猪业造成了重大损失,但迄今为止尚无有效安全的疫苗可用。通过新手段研制PEDV疫苗十分必要。S蛋白是PEDV的主要结构抗原蛋白,由S1区和S2区组成,其中S1含有3个中和表位区域,常作为PEDV基因工程疫苗研究中最重要的一个靶蛋白。本研究拟构建S1基因的系列重组杆状病毒:rv Ac-S1、rv Ac-SP-S1、rv Ac-SP-S1-TMD、rv Ac-SP-S1-e GFP、rv Ac-SP-S1-e GFP-TMD,以实现在昆虫细胞中高效表达S1或者在重组杆状病毒表面展示S1。并将上述S1蛋白及表面展示S1的重组病毒分别作为蛋白亚单位疫苗和病毒活载体疫苗使用,初步探索两种疫苗在BALB/c小鼠模型上的免疫效果。直接荧光、间接免疫荧光、免疫印迹、免疫电镜对S1的表达定位进行分析。结果表明:rv Ac-SP-S1-e GFP和rv Ac-SP-S1-e GFP-TMD感染Sf9细胞后,S1在Sf9细胞中高效表达,且S1胞内表达量前者大于后者;S1定位于感染细胞的细胞膜附近及rv Ac-SP-S1-e GFP-TMD表面。制备S1重组蛋白免疫原及表面展示S1的重组病毒颗粒性免疫原皮下免疫小鼠。间接ELISA、微量细胞培养中和试验、脾淋巴细胞增殖试验对免疫原刺激小鼠产生的体液免疫及细胞免疫应答效果进行检测。结果表明:展示S1的重组杆状病毒免疫血清中存在特异性抗体,抗体效价达1:5000,并具有一定中和PEDV能力,中和效价达1:26。在PEDV刺激原作用下,展示S1重组杆状病毒免疫鼠的脾淋巴细胞与对照组相比增殖显著(P>0.05)。而S1重组蛋白免疫原小鼠后未取得理想效果。上述可知,表面展示S1的rv Ac-SP-S1-e GFP-TMD重组杆状病毒直接免疫小鼠可诱导产生体液及细胞免疫反应。本研究首次将PEDV CV777全长S1蛋白表达于昆虫细胞及展示于杆状病毒表面以用于PEDV疫苗研发,并取得一定初步成果,为PEDV新型疫苗的研发奠定了基础。

关键词： 雌核发育   制种过程   细胞工程   单位产量   饵料系数   养殖周期   平湖镇   超雄   基因工程育种   投饵机  

摘要： 全雄黄颡鱼是利用细胞工程育种技术、基因工程育种技术,通过性转诱导、雌核发育生产的＂YY型＂超雄黄颡鱼。其雄性率高（95%以上）、生长速度快（比普通黄颡鱼快30%~50%）、适应性强、质量安全（制种过程不用激素）、种源可控、适合于标准化、规模化养殖生产,具有饵料系数低、单位产量高、养殖周期短、出塘规格整齐个体大、市场价格高等优点。

关键词： 小反刍兽疫   亚单位疫苗   病毒样颗粒疫苗   基因工程弱毒苗   核酸疫苗  

摘要： 2013年世界动物卫生组织(OIE)和联合国粮食及农业组织(FAO)提出小反刍兽疫可能成为继牛瘟之后,被在全球范围内消灭的第2个动物疫病。近年来,广泛使用弱毒疫苗免疫预防小反刍兽疫,但由于缺乏区分免疫抗体和感染抗体的技术手段等,给小反刍兽疫的消灭和根除计划的实施带来一定的困难。因此,新型疫苗以及特异性诊断技术的研究和开发成为研究热点。论文对小反刍兽疫新型疫苗研究中的亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗、基因工程弱毒苗、核酸疫苗的研究进行综述,以期为小反刍兽疫新型疫苗开发和应用提供参考。

关键词： 基因工程疫苗   动物疾病   核酸疫苗  

摘要： 基因工程疫苗同常规疫苗相比,是借助了现代生物方法,使生产的疫苗的安全性和稳定性得到了明显提高,且有较好的保护性免疫反应,加上成本较低,可实现1针防多病,俨然已经成为了动物疫苗今后发展的一个主要方向。本文章简要介绍了基因工程疫苗种类及其在动物疾病防治中的有效应用。

关键词： 羊包虫病   疫苗   母源抗体   检测  

摘要： 通过对怀孕4周的母羊进行羊棘球蚴（包虫）病基因工程亚单位疫苗的首免,在怀孕8周时进行二免,待母羊分娩后,分别在羔羊1、3、5、8、12、17周龄采集血清,用ELISA方法检测棘球蚴母源抗体,监测抗体消长规律。结果显示：羔羊血清中母源抗体第1周最高,平均抗体OD450值0.900,第3周时为0.710,17周时抗体保护处于临界值;其阳性率在1-5周为100%,第17周时仅30%,从而选择羔羊最佳首免时间为12-16周。

关键词： Blood Donors   Hepatitis B Core Antigens   Hepatitis B Vaccine  

摘要： BACKGROUND It is important to differentiate whether isolated anti-HBc is due to false positive results or the prior exposure to hepatitis B virus, because individuals with false-positive anti-HBc can benefit from vaccination and their blood can be safely transfused. To distinguish between these two conditions, we evaluated the serologic response to hepatitis B vaccine. METHODS Ninety subjects with isolated anti-HBc (cases) and 100 subjects with totally negative hepatitis B serologic markers (controls) were recruited to receive three doses of hepatitis-B (HB) vaccine. Thirty days after the first dose of the vaccine, anti-HBs titers were checked and individuals with anti-HBs titer >50 mIU/mL did not receive additional doses of the vaccine. However, others completed the vaccination course, and another blood sample was collected 30 days after the third dose to measure anti-HBs level. RESULTS Nineteen (21.1%) cases and three (3%) controls had no sero-conversion (anti-HBs titers <10 mIU/mL) 30 days after the third dose (p<0.0001). Primary response, defined as the development of anti-HBs antibody titers ≥10 mIU/mL 30 days after the third dose, was observed in 43 (47.8%) cases and 92 (92%) controls (p<0.0001). Also, 31.1% of cases developed anti-HBs titers ≥ 50 mIU/mL 30 days after the first dose of vaccine, but the rate was significantly lower (5%) in the control group (p<0.0001). Furthermore, half of the individuals with positive isolated anti-HBc developed protective levels of anti-HBs after three doses of HB vaccination. CONCLUSION More than 75% of individuals with positive isolated anti-HBc can benefit from vaccination and can be included in donor pool. Also, one fifth seemed to have occult HBV infection. So HB vaccination may be used as a diagnostic tool for clarifying the situation of the subjects with isolated anti-HBc.