关键词： 鲍曼不动杆菌   基因工程疫苗   克隆表达   重组蛋白   免疫保护  

摘要： 目的制备鲍曼不动杆菌(Ab)A1S_1969重组蛋白,利用小鼠全身脓毒血症感染致死模型评价A1S_1969重组蛋白的免疫保护效果,探讨可能的免疫保护机制,为筛选Ab疫苗有效的保护性抗原奠定基础。方法基于反向疫苗学技术筛选出Ab外膜蛋白A1S_1969,利用p GEX-6P-2质粒构建GST融合表达载体,重组表达的A1S_1969蛋白经亲和层析高效纯化后与铝佐剂吸附制备而成重组A1S_1969免疫原;采用Balb/c小鼠全身感染模型评价A1S_1969重组蛋白的免疫保护效果,通过ELISA检测免疫小鼠Ig G抗体滴度和Ig G抗体亚型。制备A1S_1969重组蛋白抗血清进行体外调理吞噬杀菌实验。结果成功克隆、表达并纯化A1S_1969重组蛋白,纯度>90%。动物免疫保护结果显示A1S_1969重组蛋白组小鼠存活率为55.6%,对照组小鼠存活率为20.0%(P<0.05);末次免疫7 d后小鼠体内总Ig G抗体滴度为1∶64 000,以Ig G1亚型为主;体外调理吞噬杀菌实验结果显示A1S_1969特异性血清抗体可以增强中性粒细胞对Ab的杀菌作用,实验组杀菌率可达55%,对照组无杀菌活性。结论 A1S_1969重组蛋白可显著提高全身脓毒血症感染致死模型小鼠的存活率,具有良好的免疫保护效果。

关键词： 禽传染性喉气管炎   病毒基因组结构   病毒蛋白   基因工程疫苗  

摘要： 禽传染性喉气管炎(AILT)是由鸡疱疹病毒I型(GaHV-I)引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病,是世界养禽国家重点防控的疫病之一,发病率、死亡率较高,给养鸡业造成很大的经济损失。本文对该病的病毒形态、病毒基因组结构、病毒蛋白、分子生物学诊断方法、基因工程疫苗的研究状况作一综述,以为该病的防控奠定基础。

关键词： 猪伪狂犬病   病毒变异株   基因工程疫苗   安全性   保护效力   动物试验  

摘要： 伪狂犬病(Pseudorabies)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的猪和多种家畜共患的一种急性，热性传染病。PRV主要感染猪，能够导致仔猪的高死亡率和种猪繁殖障碍，对养猪业危害极大。疫苗免疫是防控猪伪狂犬病的主要手段。然而自2011年底，PRV变异毒株在我国猪场出现并且流行，给养猪业造成了巨大的损失。最新的研究显示，现有商品化疫苗的保护效力显著下降，不能有效阻断这种变异株的传播和流行。本研究旨在以当前流行的PRV变异株（CH/HNSMX/2012株）为亲本，通过基因工程技术构建gI、gE、TK三基因缺失毒株rSMXΔgI/gEΔTK，通过一系列动物试验，研究了该毒株的安全性和免疫效力;为PRV变异株弱毒疫苗的研发与应用奠定了基础。\n 1.伪狂犬病病毒流行毒株的分离鉴定和致病力研究\n 本研究从85份病料样品中总共分离到16株PRV。空斑试验显示这16株PRV的空斑面积相似（0.4-0.8mm2），均显著高于经典毒株Ea株(0.2-0.5mm2)。对这16株PRV进行gC基因测序和进化分析，结果显示这16株PRV同源性非常高，和国内近期公布的PRV分离株的gC基因高度同源;因此可以初步判定，这16株PRV均属于PRV变异株。\n 选择PRV CH/HNSMX/2012株作为变异株的代表，通过小鼠和仔猪感染试验研究其致病力。小鼠LD50试验结果显示CH/HNSMX/2012株和Ea株的LD50分别为19.5和154.2 TCID50。CH/HNSMX/2012株对小鼠的致病力显著强于Ea株。使用CH/HNSMX/2012株通过滴鼻途径感染60日龄仔猪，剂量分别为106.0、107.0、108.0TCID50;结果显示所有感染组均出现发热，食欲废绝，典型的神经症状和严重的呼吸道症状。106.0 TCID50感染组的5头猪中有3头仔猪死亡;而107.0和108.0 TCID50能够导致5头仔猪全部死亡。\n 2.基因缺失病毒rSMXΔgI/gEΔTK的构建\n 根据PRV基因组序列，选择gI/gE和TK基因两侧的序列作为同源臂，构建了重组转移载体;将重组转移载体和CH/HNSMX/2012基因组共转染PK-15细胞，获得重组病毒;通过空斑纯化，获得纯净的不带标记的基因缺失毒株rSMXΔgI/gEΔTK。RFLP和Southern Blot试验证明该毒株按照设计在gI/gE和TK两个区域发生了缺失，而基因组其他位置没有发生突变。rSMXΔgI/gEΔTK株的生长曲线和亲本株相似，但是空斑面积显著减小。细胞连续传代试验证明rSMXΔgI/gEΔTK遗传稳定。\n 3.基因缺失株rSMXΔgI/gEΔTK的安全性评价\n 使用1010-107.0 TCID50剂量梯度的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒，通过足垫注射接种Balb/c小鼠，观察14d，接种小鼠未见临床感染症状。使用102.0-107.0 TCID50剂量梯度的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒，通过皮下注射接种新西兰大耳兔，观察21d，没有兔出现临床感染症状。使用1080 TCID50剂量的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒，通过肌肉注射接种绵羊，观察21d，结果没有绵羊出现临床症状;同栏饲养的绵羊没有出现gB抗体转阳的现象。使用108.0 TCID50剂量的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒，通过肌肉注射和滴鼻两种途径，接种0日龄仔猪，观察28d，结果没有仔猪出现临床症状，仔猪生长速度正常;每个感染组设置的哨兵猪gB抗体维持阴性。使用108.0 TCID50剂量的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒，通过肌肉注射接种妊娠84日龄母猪;没有母猪出现发热，流产等临床症状，出生仔猪数和仔猪的健康度和生长速度完全正常，和对照组没有差异。综上所述，PRV rSMXΔgI/gEΔTK株不能导致小鼠、兔、绵羊、新生仔猪、妊娠母猪等易感动物出现症状，仅具有有限的水平传播能力，安全性较好，适合作为弱毒疫苗的候选毒株。\n 4.基因缺失株rSMXΔgI/gEΔTK株对仔猪的免疫保护力评价\n 分别使用106.0 TCID50剂量的rSMXΔgI/gEΔTK株弱毒疫苗，1头份Bartha-K61株弱毒疫苗(Merial，France)，或者1mL DMEM免疫28日龄PRV阴性仔猪1次，免疫后28天采血检测抗体。中和试验结果显示rSMXΔgI/gEΔTK产生的血清中和抗体水平高于Bartha-K61疫苗。Bartha-K61疫苗产生的血清中和抗体中和Bartha-K61的中和效价显著高于中和CH/HNSMX/2012株的中和效价;而rSMXΔgI/gEΔTK株疫苗没有这个现象。免疫后28天使用CH/HNSMX/20

关键词： 鸭坦布苏病毒病   PrM/E基因   临床特征   抗体检测  

摘要： 鸭坦布苏病毒病（Duck Tembusu Virus Disease）是一种以蛋鸭的产蛋量急剧下降为主要临床特征的疫病，病禽体重下降、高热、食欲下降、产蛋量下降甚至停止产蛋以及部分死亡是坦布苏病毒病的主要眼观特征。\n 鸭病毒性肠炎（Duck Virus Enteritis，DVE）又名鸭瘟（Duck Plague，DP），是由鸭肠炎病毒（Duck Enteritis Virus，DEV）引起的鸭、鹅等雁形目禽类的一种急性接触性传染病，其特征为血管破坏、组织出血、消化道粘膜破溃、淋巴器官损伤和实质器官变性。病禽体温升高，两腿麻痹，下痢，流泪，部分病鸭头部肿大。该疾病传播迅速，因其发病率和死亡率特别高，对养鸭业甚至水禽养殖业造成了严重威胁。\n 目前鸭瘟的预防主要依靠接种弱毒苗实施。鸭肠炎病毒本身具有成为病毒载体的潜力，而且将其开发为病毒载体具有以下优势：其全基因组中具有很多非必需基因，因此该病基因组具有很强的容纳外源基因的能力；同时该病毒的宿主较少，因此该疫苗对于人及其他家畜来说相对安全；另外，鸭瘟病毒能潜伏在三叉神经节、淋巴样组织和外周血淋巴细胞中，并且能持续地诱导机体产生相关细胞免疫和体液免疫。\n 本研究前部分对某地区的两鸭场进行了采样调查，并分别对坦布苏病毒抗体E蛋白与PrM蛋白间接ELISA方法进行了评估及差异性分析，得到以下结论：\n （1）经过3次鸭坦布苏病毒病疫苗免疫的种、蛋鸭场一，抗体保持在了一个比较高的水平，并很好的做到了全进全出。而未免疫疫苗的肉鸭场二，呈现了坦布苏病毒的大面积感染情况，证明鸭坦布苏病毒在该地区呈现流行趋势，蛋鸭种鸭应及时做好相关免疫工作。\n （2）从品种对疫苗的敏感性上来说，樱桃谷鸭比麻鸭对疫苗的敏感性更强，更易产生较高的抗体水平。\n （3）两种蛋白包被的ELISA板均能较好地检测鸭坦布苏病毒的抗体水平，并且呈现了一致性，增加了鸭坦布苏病毒间接ELISA检测的多样性和准确性。\n 以上采样调查结果同时反映了两种蛋白均存在良好的免疫原性，于是我们将鸭坦布苏病毒PrM基因与E基因串联插入鸭瘟病基因间隙中，构建得到一种可以同时表达PrM和E蛋白的基因工程二联疫苗。\n 本研究后部分借助CRISPR/Cas基因编辑技术的启发，运用CRISPR/Cas9系统对鸭瘟病毒进行修饰和同源重组，将坦布苏病毒的主要免疫源性基因PrM基因与E基因成功插入到鸭肠炎病毒的US7、US8基因之间的基因间隙，开发了鸭肠炎病毒和坦布苏病毒的基因工程二联苗，大大降低了工作量，同时提高了重组效率，并通过一系列实验验证了该二价苗的蛋白表达效果。主要研究结果如下：\n （1）构建含有重组同源臂的克隆载体\n 本研究在鸭肠炎病毒US7和US8之间插入克隆片段，分别将750 bp左右的上下游同源臂用PCR扩增，再将大约1.8 kb的筛选标记红色荧光蛋白RFP扩增，运用重叠PCR的方法将上述三个片段连接起来，之后将该连接片段克隆到载体pMD-18T上。\n （2）目的病毒C-KCE-RFP的筛选及稳定性测试\n 运用CRISPR/Cas9系统同源重组后的鸭瘟病毒，在US7和US8基因之间存在红色荧光蛋白RFP表达基因，以红色荧光蛋白RFP作为筛选标记，筛选到重组成功的鸭肠炎病毒，并通过逐步拯救纯化该病毒，并通过实验验证其荧光能够稳定表达。\n （3）将坦布苏病毒Prm基因整合到鸭肠炎病毒载体上\n 分别将750bp左右的上下游同源臂用PCR扩增，再将大约1.8 kb的PrM/E片段扩增，运用重叠PCR的方法将上述三个片段连接起来，之后将该连接片段克隆到载体pMD-18T上，运用相同的CRISPR/Cas9系统，重组红荧光病毒C-KCE-RFP，使得PrM/E替换RFP红色荧光表达基因，并通过逐步拯救纯化该病毒。\n （4）目的病毒C-KCE-PrM/E的稳定性及效果检测\n 得到的纯化后的目的病毒C-KCE-PrM/E经稳定性检测发现该病毒能够稳定传代，经体外实验表明PrM蛋白和E蛋白能随着该病毒的复制而表达。

关键词： 肿瘤坏死因子   抗体   制备  

摘要： 人肿瘤坏死因子(Tumour necrosis factor alpha,TNFα)是一种多功能性的细胞因子,既参与造血、免疫监视和避免细菌感染等正常的生理过程,又在类风湿性关节炎、移植排异和肿瘤发生等病理过程中扮演着重要的角色。因此,目前靶向于TNFα的抗体及其他拮抗剂已成为全球最炙手可热的生物药物。然而,目前我国在抗TNF α抗体的产业化方面还完全处于空白。鉴于此,本课题围绕抗TNFα人鼠嵌合型抗体(英夫利昔单抗)和抗TNFα纳米抗体(TNF60)展开了以下研究:一方面,本课题通过酶联免疫检测方法对前期转染英夫利昔单抗真核表达质粒后得到的一系列中华仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)单克隆进行了筛选与鉴定,然后通过亲和纯化方法对所选单克隆细胞株培养上清中的目的抗体进行纯化,并进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。最终,本课题筛选得到了4株高表达英夫利息单抗的CHO细胞克隆,制备了以非聚集体形式存在于溶液中的英夫利息单抗,纯度为87%,浓度为6 mg/mL。另一方面,本课题将TNF60的编码基因连接到pET-22b和pET-28a质粒中,构建获得了 TNF60的原核表达质粒,转化大肠杆菌(Escherichia coli,***)Rosetta(DE3)中,筛选得到了 TNF60的两种基因工程表达菌,通过响应面法优化确定TNF60的最佳培养条件为:SB培养基,0.1mMIPTG,培养温度为22℃,诱导后培养时间为14 h。经过固相Co2+亲和纯化之后得到纯度为95%的TNF60重组蛋白,经质谱分析显示目的蛋白序列正确、免疫印迹(Western blot)证实重组蛋白具有良好的抗原结合活性,能够有效的作用于TNF α。最后,我们用卡拉胶致小鼠足肿胀炎症模型对TNF60的体内抗炎活性进行了分析。结果显示,重组TNF60能够有效抑制小鼠炎症,给药2 h后,其在66 mg/Kg的剂量下的抑制效果与200mg/Kg剂量下的阳性对照药物阿司匹林相当。

关键词： 岗位职责   相关专业   销售任务   学历   市场发展趋势   岗位要求   招聘启事   金宇   畜牧兽医   基因工程疫苗   支原体培养   二代测序   形成分析  

摘要： 招聘岗位:销售业务员?岗位职责:?1、根据部门年度销售任务,综合所辖市场的实际情况,提出市场全年需求计划及所辖市场的营销方案,并组织落实;2、针对市场发展趋势、竞争对手的动向及本市场任务完成情况,负责形成分析报告,并提出应对意见与建议;3、制定每月所辖市场的销售滚动计划,并于月底对计划的执行情况进行分析;4、定期或不定期向区域总经理和总监汇报工作进度。岗位要求:大学本科及以上学历,畜牧兽医、市场营销及相关专业,3年以上相关工作经验。工作地点:广州及全国各省

关键词： 杂交育种   诱变育种   多倍体育种   单倍体育种   细胞工程育种   基因工程育种  

摘要： 生物育种是利用遗传学、细胞生物学、现代生物工程技术等方法原理培育生物新品种的过程，为高考考查的重点之一。在高中阶段所介绍的育种方法主要有：杂交育种、诱变育种、多倍体育种、单倍体育种、细胞工程育种、基因工程育种等。生物的育种技术体现着当代生物科学研究的最新成果及其应用。育种知识在目前高中教材中分布得比较零散，高三复习阶段应该归纳总结，使知识系统化、条理化，以帮助学生构建完整的知识体系。

关键词： 氯霉素   单链抗体   重组表达   直接竞争酶联免疫分析  

摘要： 各类兽药的大量使用,虽然提高了动物性食品的产量,但是也对人类健康造成了潜在威胁。同时兽药残留问题也影响着我国动物性食品的出口贸易。免疫分析方法是目前兽药残留检测使用较多的方法。抗体作为免疫分析的核心试剂,其稳定性是影响免疫检测分析结果的关键因素。本论文利用分子生物学技术获得了氯霉素的基因工程抗体,并利用这一抗体建立了免疫检测方法,为氯霉素的检测提供了一种有效、稳定的检测技术。从分泌氯霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株10A3B6E中提取总RNA,并反转录成cDNA。以cDNA为模板,利用兼并引物进行PCR扩增,获得抗体基因的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),将其连接到pMD18-T载体后进行大规模测序。同时,利用木瓜蛋白酶对单克隆抗体进行水解获得Fab,SDS-PAGE电泳后,对Fab中的轻链和重链分别进行Orbitrap质谱分析,获得其中的氨基酸片段。将可变区测序结果与质谱鉴定结果进行比对分析,获得了氯霉素特异性抗体可变区序列,重链可变区和轻链可变区的长度分别为341 bp和324 bp。利用重叠延伸PCR将重链可变区、轻链可变区及连接片段进行连接,获得了 711 bp的单链抗体(scFv)基因片段。将该片段用内切酶SfiⅠ和NotⅠ进行酶切,并与经过相同酶切的表达载体pLIP6/GN进行连接,转化BL21(DE3)后,对scFv进行重组表达。在25℃,180rpm振荡培养条件下,利用0.1 mmol/L IPTG对表达菌株诱导10-14小时,成功获得出可溶性的抗氯霉素单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白(CAP scFv-AP)。利用Ni2+-NTA亲和层析柱对CAP scFv-AP进行分离纯化。利用纯化后的蛋白,通过对免疫分析条件的优化,建立了一种简便、快捷、实用的氯霉素直接竞争ELISA检测方法。优化后的检测条件为:包被原包被量0.1μg/孔;封闭液1%脱脂乳粉;样品稀释液0.02 mol/LTBS(pH 5.7)。在最佳条件下,该检测方法的检测灵敏度(IC50)与检测限(IC15)分别为6.92:±0.24 ng/mL和1.11±0.05ng/mL。选择3种氯霉素结构类似物和2种兽药进行特异性分析,结果显示该检测方法对氯霉素琥珀酸钠、氟甲砜霉素、甲砜霉素、四环素、链霉素的交叉反应率分别为42.34%、0.37%、0.22%、0.22%和0.12%,说明所建立的检测方法具有较好的特异性。选择对虾和鳕鱼作为实际样品,分别向其添加10、30、100 ng/g氯霉素,测得其回收率为72.53%-107.67%,变异系数小于10%,表明方法具有较好的精密度。本研究为氯霉素的大规模检测提供了一种有效的初筛技术,这对于保障动物源性食品安全具有重要的实际意义。

关键词： 猪圆环病毒   诊断技术   全病毒疫苗   基因工程疫苗  

摘要： 猪圆环病毒病(PCVD)是由猪圆环病毒2型(PCV2)感染引起的多种猪临床疾病总称,这一新传染性病毒每年给全球养猪业造成了巨大的经济损失。目前已知注射疫苗是现今有效防治本病的主要方法,但在临床上,由于猪只健康状态不同、其他病原微生物合并感染、饲养环境变化,在临床上彻底控制PCVD仍存在不少困难。文内讨论了PCV2感染给猪群带来的疾病、本病的临床和实验室诊断、流行病毒及大面积使用疫苗后出现的新问题。。

关键词： 三唑磷   对硫磷   单链抗体   双特异性抗体   蛋白表达   同源模建   表面等离子共振   酶联免疫吸附法  

摘要： 为研制农药特异性基因工程抗体,本研究以有机磷杀虫剂三唑磷和对硫磷为目标分析物,采用一种新型水溶性免疫佐剂（快速佐剂）进行了三唑磷和对硫磷单克隆抗体（单抗）的制备。该免疫佐剂操作简便,无需乳化,与人工抗原混合后可直接对Balb/c小鼠进行小腿肌肉注射,免疫脾细胞制备方便,细胞融合后筛选得到有效细胞株的阳性率超过30%;间接竞争酶联免疫吸附法（ic-ELISA）筛选获得能够稳定分泌高亲合力、高特异性抗体的杂交瘤细胞株,快速制备了针对农药三唑磷和对硫磷的高亲合力单抗,灵敏度和特异性等方面与以往采用弗氏佐剂获得的单抗相当,对三唑磷的识别灵敏度（IC50）0.91 ng/mL,对对硫磷识别灵敏度（IC50）8.18ng/mL。以制备的杂交瘤细胞株为RNA来源,采用抗体亚型特异性的简并性引物,通过RT-PCR法扩增了抗对硫磷单抗的y1亚型重链可变区（VH）和κ亚型轻链可变区（VL）的基因序列,以及抗三唑磷单抗的γ1亚型VH和稀有的λ亚型VL基因序列,通过重叠延伸PCR法成功将相应的VH、VL核苷酸序列经连接肽（Gly4Ser）3串联,构建了 VH-VL连接方式的单链抗体（scFv）全长序列。将抗三唑磷scFv和抗对硫磷scFv的全长序列依次构建到大肠杆菌原核表达体系、杆状病毒-昆虫细胞表迗系统、毕赤酵母真核表达系统中进行可溶性表达,免疫印迹法鉴定蛋白表达,ic-ELISA法评价抗体活性。结果表明,抗三唑磷抗体和抗对硫磷抗体的VH和VL基因序列被成功扩增,在毕赤酵母表达体系中更经济有效地获得了高活性的抗三唑磷scFv和抗对硫磷scFv,抗体活性与亲本单抗相当,为进一步展开新型抗体的分子设计奠定了研究基础。在明确表达体系的基础上,研究了轻重链可变区取向（VH-VL、VL-VH）对抗三唑磷scFv、抗对硫磷scFv的生物活性和表达水平的影响。结果表明,轻重链可变区不同取向对抗三唑磷scFv和抗对硫磷scFv的亲合力和特异性没有明显影响,产物具备特异性识别相应靶标化合物的能力,对三唑磷的IC50在0.4～0.5 ng/mL,对对硫磷IC50在8.5～10.5ng/mL,抗体活性与亲本单抗相当;相较而言,抗三唑磷scFv和抗对硫磷scFv在VL-VH取向下,更容易获得较高水平的蛋白表迗,表达量均迗700mg/L左右。随后,尝试了两个抗三唑磷scFv的串联,设计了不同轻重链可变区取向和连接肽长度的抗三唑磷双价串联单链抗体,ic-ELISA法鉴定不同抗体的活性。结果表明,抗三唑磷双价串联单链抗体的抗体活性与连接肽长短[Gly4Ser、（Gly4Ser）3]、单价scFv的表达情况无关,与轻重链取向有关,轻链在N端的构建方式更易获得高识别能力的抗体蛋白,亲合力（IC50在0.8～0.9 ng/mL）和特异性与亲本单抗相当。在上述研究基础上,设计了不同连接方式的三唑磷-对硫磷双特异性串联单链抗体。ic-ELISA法鉴定结果表明,轻重链可变区取向同样是影响三唑磷及对硫磷双特异性串联单链抗体识别能力的重要因素。其中,以VLT-VHT-Gly4Ser-VLP-VHP的构建方式更容易获得高识别能力的抗体,但对三唑磷和对硫磷的灵敏度均下降了近7倍,同时交叉识别谱发生了改变。综上所述,在构建高亲合力单链抗体、双价串联单链抗体以及双特异性串联单链抗体时,应优先考虑轻链可变区在N端的构建方式;在设计双特异性串联单链抗体时,还需要考虑两个scFv可变区片段之间的相互干扰导致抗体活性下降和非特异性结合的问题。最后,利用Accelrys公司的Discovery studioTM,根据抗体的氨基酸序列进行同源模建,构建了抗三唑磷单链抗体和抗对硫磷单链抗体的三维模型。对抗体与农药小分子间的对接构象进行了模拟,确定了对接过程中抗体的主要氨基酸作用位点。同时,结合表面等离子共振技术（SPR）测定抗体与小分子互作反应,明确了抗体与靶分子间结合的动力学和亲合能力,为进一步提高抗体的亲合力以及稳定性奠定了坚实的基础。