关键词： 猪圆环病毒2型   重组腺病毒   基因工程疫苗   免疫原性  

摘要： 猪圆环病毒相关性疾病（porcine circovirus associated disease,PCVAD）是由猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）引起的猪传染性疾病。接种疫苗是防控PCVAD最有效的手段,重组腺病毒载体疫苗已经有相关报道,但是由于腺病毒自身蛋白可以诱导宿主产生强烈的免疫应答反应,从而限制了这种疫苗在临床实践中的应用,如何降低自身免疫应答反应成为重组腺病毒载体疫苗规模化应用必须解决的关键科学问题。本研究构建了4类PCV2重组腺病毒载体疫苗,一是利用人巨细胞病毒第一内含子（human cytomegalovirus first intron,Intron A）和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element,WPRE）,构建Intron A和/或WPRE优化的PCV2重组腺病毒载体疫苗;二是通过共表达猪肿瘤坏死因子相关激活蛋白（tumor necrosis factor related activation protein,TRAP/CD40L）和粒细胞-巨细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GMCSF）,构建CD40L和/或GMCSF优化的PCV2重组腺病毒载体疫苗;三是分别在CD40L、Cap和GMCSF的N端添加分泌型信号肽,构建分泌型重组腺病毒载体疫苗;四是分别在CD40L和GMCSF的N端添加分泌型信号肽,Cap N端添加跨膜型信号肽,构建跨膜型重组腺病毒载体疫苗。4类重组腺病毒载体疫苗均进行动物试验评价免疫效果,期望构建的这4类PCV2重组腺病毒载体疫苗能够提高PCV2 Cap的表达效率和表达方式,从而降低腺病毒疫苗免疫剂量,减弱腺病毒载体自身的免疫原性,增强疫苗免疫效果,为PCV2重组腺病毒载体疫苗的规模化应用奠定基础。研究取得以下结果。1.将Intron A和WPRE克隆到PCV2重组腺病毒,构建PCV2 Cap、Intron A和WPRE相关重组腺病毒疫苗,分别命名为Ad-C、Ad-A-C、Ad-C-W和Ad-A-C-W。western blotting结果表明,在Ad-C、Ad-A-C、Ad-C-W和Ad-A-C-W感染细胞的蛋白样品中均可检测到Cap表达,并且Ad-A-C-W感染细胞的Cap表达量高于其他组。IFA结果表明,Ad-C、Ad-A-C、Ad-C-W和Ad-A-C-W感染的细胞均能检测到荧光,并且Ad-A-C-W感染细胞的荧光信号强于其他组。使用上述构建的重组腺病毒免疫小鼠2次,间隔14 d。结果表明,一免后14 d开始检测到特异性抗体和中和抗体。一免后35 d至一免后56 d,Ad-A-C-W免疫组特异性抗体水平和中和抗体水平显著高于其他组（p＜0.05）,Ad-A-C免疫组和Ad-C-W免疫组特异性抗体水平和中和抗体水平差异不显著,但均显著高于Ad-C免疫组（p＜0.05）。一免后28 d至一免后56 d,Ad-A-C-W免疫组淋巴细胞增殖水平、IFN-γ和IL-4分泌水平显著高于其他组（p＜0.05）,Ad-A-C免疫组和Ad-C-W免疫组差异不显著,但均显著高于Ad-C免疫组（p＜0.05）。2.将CD40L和GMCSF克隆到PCV2重组腺病毒,构建PCV2 Cap、CD40L和GMCSF相关重组腺病毒疫苗,分别命名为Ad-CD40L-Cap、Ad-Cap-GMCSF和Ad-CD40L-Cap-GMCSF。western blotting和IFA结果显示,重组腺病毒Ad-CD40L-Cap、Ad-Cap-GMCSF和Ad-CD40L-Cap-GMCSF均可以检测到相应蛋白表达。使用上述构建的重组腺病毒免疫小鼠2次,间隔14 d。结果表明,一免后14 d开始检测到特异性抗体和中和抗体。一免后21 d至一免后56 d,Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫组特异性抗体水平和中和抗体水平显著高于其他组（p＜0.05）,Ad-CD40L-Cap免疫组和Ad-Cap-GMCSF免疫组特异性抗体水平和中和抗体水平差异不显著,但均显著高于Ad-Cap免疫组（p＜0.05）。一免后28 d至一免后56 d,Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫组淋巴细胞增殖水平、IFN-γ和IL-4分泌水平显著高于其他组（p＜0.05）,Ad-CD40L-Cap免疫组和Ad-Cap-GMCSF免疫组差异不显著,但均显著高于Ad-Cap免疫组（p＜0.05）。3.将重组腺病毒Ad-Cap、Ad-A-C-W和Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫猪,进行免疫保护试验,一

关键词： 类风湿性关节炎   肿瘤坏死因子α   单克隆抗体   基因工程抗体  

摘要： 类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种主要表现为软骨和骨损伤的慢性自身免疫性疾病,全球发病率高达0.24%,严重威胁人类的健康。虽然RA的发病机制还不是完全清楚,但是研究者发现遗传、环境、免疫调节异常等因素与它有关。其中,免疫调节异常与RA的关系广受关注。引发和维持介质与调停介质的不平衡是引起免疫调节异常的重要原因,这将导致炎症不受机体控制,进而引发细胞损伤。在RA个体中,这种损伤表现为滑膜、软骨、骨的破坏。肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的分泌异常是导致两种介质处于不平衡状态、引起免疫调节异常并引发RA的重要因素之一,因此受到研究者的广泛关注。TNF-α是一种来源广泛的、具有高度保守性的细胞因子,通过刺激多种细胞来发挥不同的功能。TNF-α抑制剂能够特异性结合TNF-α,阻断其生物活性,进而控制炎症、缓解病情,已在临床上广泛应用。比如英夫利昔单抗、阿达木单抗和依那西普等,但是,由于上述单抗成本高、价格昂贵、操作复杂和免疫排斥等因素限制了它们的应用。因此,需要开发一种成本较低、操作简单和免疫耐受的TNF-α抑制剂。为了开发一种TNF-α抑制剂,本课题通过以人源TNF-α为抗原免疫Balb/c小鼠,制备抗TNF-α的鼠源单克隆抗体。为降低机体对该抗体的免疫排斥,对该抗体进行人源化改造,最终获得一株嵌合型抗体,为后续开发有效的TNF-α抑制剂打下基础。首先,用hTNF-α免疫雌性Balb/c小鼠,通过单克隆抗体技术获得了八株分泌特异性结合hTNF-α的单克隆抗体的杂交瘤细胞,经染色体结构及数量的验证,均符合杂交瘤细胞的特征。对单抗亚型鉴定的结果显示,制备的单抗是IgMκ亚型。挑选其中三株用于制备腹水,用特异性结合免疫球蛋白κ轻链的Protein L对腹水进行纯化。通过BCA法测得纯化后的抗体浓度为2 mg/ml。SDS-PAGE检测结果显示纯化后的单抗纯度较高,Western blot检测结果验证了单克隆抗体为IgM亚型。为了挑选一株合适的杂交瘤细胞株用于后续的基因工程改造,对纯化后的三株单抗进行了亲和力的测定,通过非竞争ELISA法测定单克隆抗体亲和力,最终计算得到2B9E10单抗的Ka = 1.6×108 M-1、3E4C11单抗的Ka =7.698×108 M-1、4H5A10 单抗的 Ka = 5.9×107M-1,细胞株 2B9E10 和 3E4C11 细胞株所分泌的抗体属于高亲和力抗体。故挑选亲和力最高的3E4C11单抗进行基因工程改造。其次,用通用引物调取3E4C11细胞株的轻、重链可变区基因,经过SOEPCR将可变区基因以交联臂(Gly4Ser)3连接,构成单链抗体(ScFv),将其与人源IgG1 Fc段基因序列相连,构建到真核表达载体中。将构建好的载体转染到293T细胞中进行表达,最终Western blot结果显示在胞浆中检测到目的蛋白的表达。通过本课题的研究,我们不仅自主研制出了特异性结合hTNF-α的鼠源性单克隆抗体,并对其进行基因工程改造,获得嵌合型抗体,这为更进一步的人源化改造打下基础,且在TNF-α抑制剂的开发以及RA的治疗方面具有重要意义。

关键词： 肉毒毒素   重链受体结合区Hc   DEC205   DNA疫苗   重组亚单位疫  

摘要： 肉毒毒素又被称为肉毒神经毒素,是由厌氧的革兰氏阳性菌肉毒梭菌产生的外毒素,是已知毒性最强的蛋白,根据其抗原性不同可以分为7种类型(BoNT/A-BoNT/G),A、B、E和F型可以导致人类中毒,其中A型肉毒毒素中毒致死率最高。各型肉毒毒素分子结构比较相似,分子量大小约150 kDa,由二硫键连接一个100 kDa的重链(HC)和一个50 kDa的轻链(LC)组成。肉毒毒素重链羧基端(HC)负责与细胞受体的结合,重链氨基端(HN)介导L链的跨膜转运;轻链具有锌离子内肽酶活性,能够将可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE)切割而抑制神经递质的传递,最终会导致骨骼肌麻痹,呼吸衰竭而死亡。肉毒毒素生产工艺简单,稳定性良好,具有极强的致死性,是一种潜在的生物武器,极容易被制备成生物战剂应用。此外,近些年来由于肉毒毒素导致的中毒事件也时有发生,因此,对于预防和治疗肉毒毒素中毒的研究具有十分重要的意义。接种疫苗是一种有效预防肉毒毒素中毒的策略。鉴于早期研制的类毒素疫苗存在较多的缺陷,所以一直未能得到十分广泛的应用,因此研究新型肉毒毒素疫苗成为一种迫切的需要。破伤风毒素(TeNT)和肉毒毒素在结构上有较多的相似之处,所以借助于破伤风毒素Hc片段亚单位疫苗研究成功的策略来研制肉毒毒素亚单位疫苗。肉毒毒素受体结合区Hc能介导毒素特异性结合到神经肌肉接点处的神经末梢,此外,Hc片段不存在锌肽链内切酶活性,没有毒性,免疫动物后能刺激产生保护性免疫反应。基于这一重要发现,研究人员开始以肉毒毒素受体结合区Hc为靶标,开展新型肉毒毒素重组亚单位疫苗和核酸疫苗的研究。DNA疫苗是将编码抗原的基因克隆到真核表达载体中作为疫苗,免疫动物后该载体会在体内表达抗原,继而刺激机体产生免疫反应和保护作用。DNA疫苗具有很多优点:生产工艺简单、产品易纯化、便于储存,在接种者体内表达抗原,并且能够产生体液免疫和细胞免疫反应,然而,DNA免疫原性较低,不足以提供足够的保护作用,距离真正的人类临床应用还有一定的差距,需要进一步提高与放大祼DNA的免疫效果。树突状细胞(DCs)是体内已知最强的专职抗原递呈细胞,在抗原递呈和启动机体免疫应答中具有十分重要的作用。DEC205是表达于树突状细胞表面的内吞性受体,能够高效地介导抗原的摄取、加工处理以及递呈。为了增强肉毒毒素DNA疫苗的免疫原性,本研究开展了A型肉毒毒素受体结合区Hc抗原靶向DCs的DNA疫苗研究工作。将编码抗DEC205的抗体基因(scDEC)和编码A型肉毒毒素受体结合区基因(AHc)融合,并克隆到真核表达载体pVAX1中,构建了一个DCs靶向的DNA疫苗(pVAX1-scDEC-AHc),同时还设置了非靶向的疫苗载体(pVAX1-SAHc)和阴性对照(pVAX1)。免疫小鼠后证明该DCs靶向的DNA疫苗确实能够增强抗原特异性体液和细胞免疫反应;相比于非靶向DNA疫苗,其抗体滴度增强了2.5倍,细胞免疫反应也有较大程度的增强。抗体亚型测定的结果表明该DNA疫苗免疫小鼠后产生了以IgG1为主的抗体,即免疫反应以Th2型免疫应答途径为主。保护性试验结果证明pVAX1-scDEC-AHc疫苗免疫后能够刺激机体产生强的保护性免疫反应,30μg剂量免疫两次之后即能对103 LD50的A型肉毒毒素产生完全保护作用,而pVAX1-SAHc疫苗仅为12.5%的保护效率;三次免疫之后对104 LD50的A型肉毒毒素具有87.5%的保护效率,pVAX1-SAHc疫苗仅为12.5%的保护效率,这些结果表明pVAX1-scDEC-AHc DNA疫苗相对于pVAX1-SAHc疫苗具有更高的保护效率。通过脾细胞流式分析和免疫注射部位肌肉组织免疫组化实验研究了该DNA疫苗的DCs靶向效应,结果表明pVAX1-scDEC-AHc疫苗免疫后能够在免疫注射部位募集更多的DCs,促进其成熟,并且能够高效地促进免疫器官中的DCs进行增殖和成熟,这些结果提示该DNA疫苗能够增强免疫反应可能要归功于这种DCs靶向作用。本研究工作还对原核表达的可溶性B型肉毒毒素重组亚单位疫苗的免疫原性进行了研究。本实验将B型肉毒毒素受体结合区Hc段基因克隆到pTIG-Trx原核表达载体,利用大肠杆菌BL21(DE3)菌株实现了BHc的可溶性表达,破菌上清用HisTrapTM HP蛋白纯化柱和Capto TM MMC层析柱进行纯化,纯化到了纯度较高的带His标签的和无His标签的BHc抗原。免疫小鼠研究该大肠杆菌表达的重组BHc的免疫原性和保护效果,结果表明1μg该重组BHc单剂量免疫小鼠就能对103 LD50的B型肉毒毒素产生完全保护作用,两次免疫则可以对104 LD50的B型肉毒毒素产生完全保护作用。测定BHc-His免疫的小鼠血清中特异性抗体滴度平均可以达到1

关键词： 猪繁殖与呼吸综合征   灭活疫苗   弱毒活疫苗   基因工程疫苗  

摘要： 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是一种猪的高致病性和高死亡率的疫病,给养猪业带来了严重损失,目前尚无特别有效的免疫预防措施,接种疫苗仍是预防本病的最重要措施。灭活疫苗安全但保护力低,弱毒活疫苗有散毒风险但是保护力相对较高,DNA疫苗、亚单位疫苗、活载体疫苗和基因缺失疫苗等新型疫苗研究都有较好进展。预防控制和消灭PRRS任重道远。

关键词： 疫苗接种   疫苗生产   Pasteur   全抗原   巴斯德   悬浮培养   细胞培养法   组织培养   疫苗学   基因工程疫苗  

摘要： 从组织培养法到细胞培养法,再到悬浮培养法;从全抗原疫苗到基因工程疫苗,再到DNA疫苗,三次疫苗变革经历了一个多世纪,未来将迎来以无疼痛、高效价、使用方便为特点的第四代疫苗技术革命。1796年英国（Jenner）医生总结种牛痘预防天花的经验,从此开始了疫苗的科学发展之路,而真正将疫苗学发展壮大的,是被称为疫苗之父的巴斯德（Pasteur）。

关键词： 基因工程   疫苗   动物疾病防治  

摘要： 随着科学技术的快速发展，动物疾病的防治手段也在不断增多。基因工程疫苗相比传统的治疗手段，更加科学、安全，且利用现代生物方法，可进一步保证疫苗的安全性与稳定性，对动物疾病的防治起到更加良好的效果，且经过近几年的快速发展，已成为未来动物疾病防治过程中的主要发展方向。基于此，研究与探索基因工程疫苗在动物疾病防治中的应用，并简单介绍基因工程疫苗的种类及其应用实践。

关键词： 基因工程疫苗   动物疾病   防治  

摘要： 随着我国环境污染问题的日益严峻,动物在生存过程中面临的疾病威胁越来越大。为了有效预防动物疾病,给动物生存提供一个健康的环境,研究学者借助先进的现代生物方法,切实提高了疫苗的稳定性和安全性,这就是基因工程疫苗。本文对基因工程疫苗的分类进行简要介绍,并在此基础上探讨该疫苗在动物疾病防治中的应用,以此来为日后动物疾病防治工作的有效开展提供一定的参考依据。

关键词： 包虫病   echinococcosis   基因工程疫苗   细粒棘球绦虫   泡型   包虫抗原   棘球属绦虫   免疫保护   棘球蚴病   疫苗接种  

摘要： 包虫病是由棘球属绦虫的幼虫引起,呈全球性分布。细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫分别引起人类罹患囊型包虫病（cystic echinococcosis,CE）和泡型包虫病（alveolar echinococcosis,AE）。包虫病是世界上最致命性的人畜共患疾病之一。既往,我国颁布了一些包虫病的防治措施,但由于文化、民族、宗教、信仰等不同,实施难度较大。

关键词： 单克隆抗体   基因工程抗体   单链抗体   双特异性抗体   免疫诊断   感染性疾病   综述  

摘要： 感染性疾病病原体的准确检测对于其有效防控极为重要,也是合理用药、有效治疗的前提。抗体因其高度的特异性和亲和力,已经成为免疫诊断中一个关键性的分子。其类型多样,从多克隆抗体到单克隆抗体,再发展到基因工程抗体,而基因工程抗体又包括单链抗体、双特异性抗体和多特异性抗体等。各类型抗体在感染性疾病的免疫诊断方面均有应用。本文就单克隆抗体和基因工程抗体在感染性疾病免疫学诊断方面的应用作一综述。

关键词： 基因工程小鼠   制备   保种   育种   技术  

摘要： 本文从小鼠的超数排卵、采集胚胎、原核受精卵显微注射、胚胎移植、基因型鉴定等多个环节,详细阐述制备基因工程小鼠的技术操作要领;通过实施辅助生殖技术IVF(体外受精)、精子和胚胎的冷冻、复苏技术实现了基因工程小鼠的保种和育种,涉及相关技术的要点改进和操作体会,成功建成了基因工程小鼠的制备和保种、育种平台,提供了良好的技术服务。