关键词： 农杆菌   遗传转化   水稻育种   基因工程  

摘要： 现如今,随着生物技术的不断快速发展,水稻基因工程育种在优质水稻培育方面的作用日益重要了起来.在众多的转基因手段当中,农杆菌作为一种天然的植物基因转化系统,在水稻基因工程育种中向来占据着独特的优势.本文主要从农杆菌介导遗传转化的科学原理入手,概要阐述了农杆菌介导遗传转化在水稻基因工程中的影响作用、优质特点以及应用范围,以期为农杆菌介导遗传转化技术在水稻基因工程中的科学应用起到一定的参考作用.

关键词： 创新   畜牧行业   猪伪狂犬病   饲料添加剂   特种饲料   工技   四川省畜牧科学研究院   四川省畜牧兽医研究所   基因工程疫苗   标签  

摘要： 2016年12月9日,在北京会议中心召开的中国饲料工业协会第七次会员代表大会上,四川省畜科饲料有限公司(以下简称"畜科")被评为"2016全国饲料优秀创新企业";其后不久,在四川省委改革办、四川省政府全创办、人民网四川频道主持评选的"2016

关键词： 隐孢子虫   实施荧光定量PCR   CP15   基因工程疫苗   免疫保护  

摘要： 隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种全球流行的重要人兽共患寄生原虫,具有广泛的宿主。隐孢子虫病目前是仅次于轮状病毒的第二大致腹泻疾病,每年有80万5岁以下儿童死于隐孢子虫引起的腹泻。尽管许多学者对其生物学特性、致病机理、免疫和基因组学等多个领域进行了研究,也取得了显著的成绩,但仍存在很多的问题和不足,隐孢子虫病至今尚无有效的治疗药物和疫苗。本研究对JVAP18S、Csp18S和CRU18S 3种隐孢子虫TaqMan实时荧光定量PCR方法的敏感性、特异性和重复性进行了比较。结果显示,3种方法均能有效检测隐孢子虫,其中JVAP18S法敏感性更高、特异性更强、重复性更好,适合于动物粪便中隐孢子虫卵囊的定量检测。ICR小鼠人工感染泰泽隐孢子虫后,第3 d开始排出卵囊,第9 d达高峰,21 d出现第二个高峰,至30 d仍有排出。构建了泰泽隐孢子虫子孢子表面抗原CP15基因的原核表达载体,实现了该基因的可溶表达,表达产物具有良好的免疫活性,其免疫血清与微小隐孢子虫抗原存在交叉反应。对rCP15、rCpSushi、rCP41制备的亚单位疫苗,以及pVAX-CpCTL10、pVAX-TH10和pVAX-CP15 3种核酸疫苗对ICR小鼠的免疫保护效果进行了比较。结果显示,6种疫苗均诱导产生了特异性的体液和细胞免疫反应,小鼠血清IgG抗体,IL-4、IL-17、INF-γ和TNF细胞因子,CD4+和CD8+淋巴细胞含量,以及脾淋巴细胞增值水平均有不同程度的提高。人工感染后各免疫组小鼠排卵囊量显著减少,其中pVAX-CpCTL10、rCP41和rCpSushi组减卵率分别达58.34%、53.78%和51.52%,表明6组疫苗免疫均对小鼠隐孢子虫感染有良好的保护效果。

关键词： 基因工程抗体   CH3   不同长度G4S   二聚化融合蛋白  

摘要： 背景与目的抗体药物偶联物(ADCs)作为实现肿瘤靶向治疗的重要方式,近年来得到了长足的发展。这一概念的提出最初是来源于研究者期望将抗体作为化疗药物的运输载体,减少临床使用的化疗药物因低靶向性导致的毒副作用。经历多年的研究,Kadcyla与Adcetris在临床上成功的运用证明了这一概念的可行性。一个合理的ADCs设计有三点需要考虑:抗体部分、效应分子、偶联方式。这其中抗体部分的高度靶向性是ADCs发挥作用的根本。片段抗体具有穿透性强、表达成本低等优势,但是存在靶向性低于全抗、清除率过高的缺点,限制了其实际中在临床上的运用。为了进一步提高片段抗体的靶向性,实现片段抗体运用于ADCs的构建,本实验基于实验室以往的实验成果上,在原有片段抗体anti-CD19(Fab)、融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDP中,引入一段来自人源IgG1重链Fc段的CH3区域,期望通过CH3区域使得单体形式的融合蛋白通过彼此CH3区域之间的分子间相互作用力形成二聚化的融合蛋白,从而提高片段抗体与靶抗原的结合活性。运用Discovery Studio分子模拟软件分析由不同长度柔性肽(G4S)连接的融合蛋白的空间构象,通过基因工程技术构建并表达针对于CD19靶点的不同长度柔性肽连接的融合蛋白anti-CD19(Fab)-CH3、anti-CD19(Fab)-LDP-CH3,并初步研究二聚化融合蛋白与靶细胞的结合活性。方法通过Discovery Studio分子模拟软件的同源建模板块模拟蛋白anti-CD19(Fab)、anti-CD19(Fab)-LDP分别与CH3通过不同长度G4S连接形成的融合蛋白的空间构象。运用PCR、overlapPCR、酶切、连接等方法,构建含有不同长度G4S的基因重组质粒 pAZY-anti-CD19(Fab)-CH3 与 pAZY-anti-CD19(Fab)-LDP-CH3,经测序鉴定正确后,转化至大肠杆菌16C9进行表达,表达产物经Protein G亲和层析柱纯化后,通过12%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹(Western blot)分析鉴定。采用流式细胞检测技术(FACS)检测融合蛋白与CD19+B系淋巴瘤细胞系Raji的结合活性、与亲代鼠源性抗体HIT19a竞争结合Raji细胞的活性;并运用高效液相分子排阻色谱法(HPLC-SEC)分析融合蛋白二聚体的比例。结果成功构建并表达了通过不同长度G4S连接的的融合蛋白anti-CD19(Fab)-CH3(A)(B)(C)和 anti-CD 19(Fab)-LDP-CH3(A*)(B*)(C*),融合蛋白经 Protein G亲和层析柱纯化后在SDS-PAGE电泳以及Western blot上表现为单体形式,单体相对分子质量与预期一致。间接免疫荧光实验结果表明,通过不同长度G4S连接的融合蛋白彼此之间在与Raji细胞的结合能力方面没有明显的差异。但是与以单体形式存在的anti-CD19(Fab)、anti-CD19(Fab)-LDP相比较,对应的二聚化的融合蛋白与Raji细胞的结合能力明显提高。此外竞争性结合实验表明,相比单体形式的anti-CD19(Fab)或者anti-CD19(Fab)-LDP,二聚化的融合蛋白与亲代鼠源性抗体HIT19a竞争结合Raji细胞的能力明显提高。结论成功通过基因工程技术构建并通过原核系统表达了不同长度G4S连接的融合蛋白 anti-CD19(Fab)-CH3(A)(B)(C)、anti-CD19(Fab)-LDP-CH3(A*)(B*)(C*)。体外实验证明,不同长度G4S连接的融合蛋白与Raji细胞结合活性没有明显差异,但是与以单体形式存在的anti-CD19(Fab)、anti-CD19(Fab)-LDP相比,二聚体形式的融合蛋白对于Raji细胞有更强的结合能力,这对于未来片段抗体药物的发展以及运用于ADCs的构建提供了新的路径。

关键词： 轮状病毒   基因工程疫苗   VP4高聚体   中和抗体   免疫保护性  

摘要： 轮状病毒是全球范围内引起5岁以下婴幼儿腹泻的主要病原体,在全球每年由于轮状病毒感染导致的死亡病例高达40-60万。疫苗是预防轮状病毒感染及发病最有效的途径,目前已经有两种轮状病毒疫苗(Rotateq和Rotarix)在全球范围内推广使用,70多个国家已经将轮状病毒疫苗纳入免疫规划。随着轮状病毒疫苗的推广,轮状病毒导致的年死亡病例由40-60万下降到20万左右。但是目前的轮状病毒疫苗存在地区有效性差异大、会诱发小儿肠套叠等问题,因此更加安全、有效的轮状病毒亚单位疫苗的研究对于进一步降低轮状病毒导致的发病率和死亡率具有重要意义。VP4作为刺突蛋白,介导了轮状病毒的吸附和入胞过程,其抗体可以阻断轮状病毒的吸附和入胞过程,是轮状病毒基因工程亚单位疫苗一种重要的候选抗原。本课题组在前期研究中发现N端起始于26位氨基酸、C端终止于476位氨基酸的VP4截短蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,其在铝佐剂条件下的免疫原性显著高于VP8-1(aa26-231)。本研究拟探究影响26-476蛋白免疫批间差的原因,并对26-476高聚体的形成条件及其性质初步评价,并把轮状病毒VP4多聚化推广至其他基因型VP4蛋白,以期获得均一性、稳定性较好,免疫原性强、免疫保护性高的VP4重组蛋白候选疫苗。本研究首先在免疫佐剂的选用、内毒素含量、二硫键三个方面探究了影响26-476蛋白免疫原性的原因,发现免疫佐剂及内毒素对蛋白的免疫原性存在一定的影响,但并不是主要因素,但是二硫键的形成可使其形成高聚体,从而显著增强其免疫原性及免疫保护性。然后,我们对26-476高聚体的形成条件进行探究证实盐离子浓度对26-476高聚体的形成存在直接关系,而pH是形成高聚体大小的关键因素。利用TEM、AUC、HPLC、DSC等分析技术对不同高聚体的形态大小及热稳定性进行分析,证实了 26-476高聚体是大小均一、热稳定性良好、形态不规则的颗粒状聚合物。并对高聚体的抗原性、免疫原性、免疫中和活性进行了探究,发现TB8.0及TB8.8条件下形成的高聚体很好的保持了表面中和表位的完整性,其三种性质均得到了加强。最后,我们把VP4形成高聚体推广至包括人源毒株在内的其他基因型毒株后,发现VP4-26-476(LLR)形成高聚体的条件对于不同基因型的VP4截短蛋白高聚体的制备具有通用性。综上所述,本研究获得了均一的VP4截短蛋白的高聚体,该高聚体大小均一、热稳定性良好,相比三聚体具有更高的抗原性、免疫原性及免疫中和活性,为未来VP4基因工程亚单位疫苗的研制提供了更广阔的思路。

关键词： DNA疫苗   结核分枝杆菌   串联表达   表达分析   免疫效应  

摘要： 目的:构建抗耐药结核重组质粒DNA疫苗p IEMKMAGP,并初步评价其免疫效果,为临床耐药结核病的治疗提供新的选择。方法:(1)利用DNA重组技术,将结核分枝杆菌表面抗原MPT64、Ag85B基因编码区和野生型kat G基因编码区,以及穿孔素PRF1、颗粒溶素GNLY基因编码区插入到真核表达载体p IRES2-EGFP中,构建抗结核多基因真核串联表达载体p IEMKMAGP(MPT64-Ag85B/kat G/GNLY-PRF1);(2)利用电转化的方法,将质粒p IEMKMAGP转化耻垢分枝杆菌制备重组耻垢分枝杆菌菌苗;(3)利用脂质体转染技术,将质粒p IEMKMAGP转染293T细胞,应用荧光定量PCR技术检测目的基因表达水平,应用Western blot技术检测目的蛋白表达情况;(4)质粒p IEMKMAGP免疫接种C57BL/6小鼠和SD大鼠,ELISA试剂盒检测IL-12和IFN-γ细胞因子表达水平。结果:(1)成功构建了抗耐药结核多效基因工程DNA疫苗p IEMKMAGP(MPT64-Ag85B/kat G/GNLY-PRF1);(2)成功制备重组耻垢分枝杆菌菌苗;(3)目的基因MPT64/Ag85B、kat G、GNLY/PRF1在293T细胞中成功表达,融合蛋白MPT64/Ag85B、融合蛋白GNLY/PRF1成功表达,且融合蛋白MPT64/Ag85B可分泌表达;(4)目的基因MPT64/Ag85B、kat G、GNLY/PRF1在C57BL/6小鼠组织器官m RNA水平上有一定表达,但蛋白水平上未检测到目的蛋白的表达;(5)质粒p IEMKMAGP免疫接种SD大鼠中外周血血清中的IL-12和IFN-γ细胞因子表达水平明显升高。结论:(1)抗耐药结核真核表达质粒p IEMKMAGP(MPT64-Ag85B/kat G/GNLY-PRF1)作为DNA疫苗能够在细胞水平上有效表达,有望为进一步开发新型的抗结核疫苗提供了实验依据。(2)本研究构建的抗耐药结核DNA疫苗p IEMKMAGP(MPT64-Ag85B/kat G/GNLY-PRF1)可以引起IL-12和IFN-γ细胞因子水平的升高。

关键词： 单链双特异抗体   原核表达   胞毒作用   前列腺癌  

摘要： 背景:目前双特异性抗体是肿瘤免疫治疗的热点研究内容。在肿瘤靶向治疗中,常见的双特异性抗体含有两个抗原的结合位点,其中一个靶向效应细胞表面抗原,另一个靶向肿瘤细胞相关抗原。CD3是常见的T细胞靶向抗原,其在T细胞表面均有表达,而且CD3复合体具有触发T细胞的潜能,因此靶向CD3的双特异性抗体被广泛研究。并有研究表明CD87的表达水平与肿瘤的恶性程度有关。在人恶性肿瘤组织中CD87的表达水平远高于其在正常组织中的表达水平,因此我们选择CD87作为单链双特异性抗体(scBsAb)的另一个作用靶点。方法:首先,通过SnapGene Viewer软件将抗人CD3单克隆抗体的重链、轻链与抗人CD87单克隆抗体的重链、轻链交叉连接,以基因合成的方式获得scBsAb的基因片段。然后利用分子生物学手段构建pET24a/scBsAb,先将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导蛋白表达。获得的工程菌经超声破碎,先在变性条件下亲和纯化目的蛋白,再采用稀释复性方法对scBsAb进行复性。利用SDS-PAGE及Western Blotting检测、鉴定目的蛋白。其次,利用流式细胞术检测纯化的scBsAb与两种相应抗原的结合情况,并测定scBsAb介导的细胞毒作用。采用商品化ELISA试剂盒测定scBsAb介导人外周血单个核细胞(PBMCs)发挥靶向CD87阳性肿瘤细胞杀伤的过程中IFN-y水平。结果:利用基因工程手段,我们获得了较高纯度的scBsAb。与对照相比,scBsAb能与PC-3细胞表面CD87特异性结合,并能与CD3特异性结合;scBsAb的浓度及效靶比影响scBsAb介导的杀伤作用。在效靶比为10:1,scBsAb浓度为100 μg/mL时最大杀伤率达到40.86%;在scBsAb浓度为100 μg/mL,效靶比为40:1时最大杀伤率达到60.9%。此外,ELISA检测实验表明,在scBsAb介导PBMCs发挥靶向CD87阳性肿瘤细胞杀伤的过程中IFN-γ的分泌显著提高。可见scBsAb在体外能够有效介导PBMCs杀伤CD87阳性肿瘤细胞。结论:在本研究中,我们利用大肠杆菌表达系统纯化获得了抗人CD3×CD87单链双特异性抗体,并对其生物学活性进行研究。我们发现scBsAb能够与PC-3细胞表面CD87特异性结合,并且能与CD3特异性结合。通过体外研究我们还发现scBsAb能够介导PBMCs发挥靶向CD87阳性肿瘤的胞毒作用。这些都为进一步的体内实验和抗CD3×CD87单链双特异性抗体的临床应用奠定了基础。

关键词： 禽流感   H7N9   HA基因   杆状病毒双CMV表达系统   疫苗  

摘要： H7N9亚型禽流感(H7N9 avian influenza,H7N9 AI)的暴发已对养殖业和人类公共安全造成了严重危害。尤其在2016年9月以来,出现了高致病性变异H7N9亚型禽流感毒株,进一步加重了对养禽业的威胁。因此,为有效控制禽类感染H7N9 AIV,亟需一种有效预防禽感染的H7N9 AIV疫苗。以杆状病毒作为活病毒载体能够诱导宿主的体液免疫和细胞免疫反应,目前利用杆状病毒作为体内基因投送的载体已受到广泛的关注。本研究选取了A/CK/GD/2013(H7N9)的HA基因,将其克隆至杆状病毒转移载体pFast-(C MV)的pCMV启动子下游,获得重组质粒pFast-(CHA),该重组质粒经过蓝白斑筛选后获得阳性重组杆粒Bacmid-(CHA),将其转染sf9细胞,获得重组杆状病毒BV-(CHA)。该疫苗的特点是重组杆状病毒携带双CMV启动子,能够驱动插入的HA基因,通过基因转导的作用,使其在宿主细胞中内源性表达,具有DNA疫苗的特点。间接免疫荧光试验结果表明,重组杆状病毒BV-(CHA)可以在转导的鸡胚成纤维传代细胞(DF-1)中有效表达HA蛋白。为了评价重组杆状病毒BV-(CHA)的免疫原性,本研究选择14日龄的SPF鸡作为实验动物,随机分为3组,每组10只,免疫两次,间隔三周,肌肉注射免疫0.5mL(10pfu/mL)重组杆状病毒(BV-(CHA)),同时设杆状病毒野毒(BV-WT)、PBS对照组。二免后3周,滴鼻攻毒10EID/100μL A/CK/GD/2013病毒,连续观察14天鸡的排毒情况以及临床症状,并于攻毒后3、5、7、9、11天采集喉头拭子和泄殖腔拭子,分离病毒测定滴度。研究结果表明,在加强免疫后第3周,BV-(CHA)免疫组可诱导产生HI抗体,并且HA特异性IgG抗体极显著高于其他对照组(P<0.001)。攻毒后,BV-(CHA)免疫组从第3天检测到2只鸡排毒,第5天检测到1只鸡排毒,第7天开始没有检测到排毒;而BV-WT免疫组第3、5、7、9天均检测到排毒鸡只,排毒持续到第9天;PBS组全部检测到排毒,排毒持续到第11天。BV-(CHA)可以保护80%的鸡完全无排毒,对另外20%的鸡产生部分保护,主要表现为减少排毒时间以及排毒量,因此,BV-(CHA)有望成为控制禽源H7N9流感疫情的候选疫苗。综上所述,重组杆状病毒BV-(CHA)免疫后能有效减少感染鸡只的排毒时间以及排毒量,在应对H7N9 AIV的变异以及流感大流行方面具有重要意义。

关键词： 猪瘟病毒   单克隆抗体   基因工程抗体   嵌合表达   悬浮培养  

摘要： 猪瘟(Classical swine fever,CSF)是严重危害养猪业的一种烈性传染病,给各个国家和地区造成巨大的经济损失,是世界动物卫生组织要求的必须申报的动物烈性传染病之一。猪瘟的病原是猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV),CSFV的结构蛋白包括囊膜糖蛋白E、E1、E2和衣壳蛋白C。CSFV E2蛋白是CSFV主要的保护性抗原,可以诱导机体产生中和抗体,从而抵抗CSFV的感染。现在,已有很多针对CSFV E2蛋白的单克隆抗体,在CSFV的鉴别诊断、抗原变异和抗原表位等研究中有着至关重要的作用。对抗体研究的逐渐深入,高效稳定的基因工程抗体技术已逐渐成为制备抗体的中流砥柱。通过之前的工作,通过免疫小鼠得到了一株鼠源E2单克隆抗体HQ06,HQ06可以特异性识别CSFV C株和Shimen株E2蛋白的线性表位,该单克隆抗体重链为IgG1型,轻链为к型。由于杂交瘤细胞并不能稳定长期保存,且易造成抗性的减少和消失,因此,本研究中利用基因工程技术,将HQ06抗体重链和轻链的可变区与猪源恒定区基因嵌合重组后克隆至真核表达载体,应用悬浮HEK293细胞构建稳定表达抗体的细胞系,制备一株猪瘟病毒E2蛋白猪源化单克隆抗体(rHQ0)。将抗体纯化后,试验结果显示抗体已成功组装,并且可以和兔抗猪免疫球蛋白G反应,这标志着抗体猪源化的成功。之后应用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白免疫印记试验(Western blotting)、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和证实了rHQ06与CSFV E2蛋白的反应活性。应表面等离子共振试验(SPR)验证rHQ06与CSFV E2的结合力。随后,通过交叉反应试验证明了rHQ06对CSFV的特异性。更重要的是对rHQ06抗病毒活性的探究,证明rHQ06可以中和CSFV的感染。综上所述,本研究应用悬浮HEK293细胞稳定表达了具有良好反应原性和中和活性的重组CSFV E2蛋白的猪源化单克隆抗体rHQ06Sw,为研究CSFV E2蛋白结构、功能以及开发新型的CSFV诊断和治疗制剂奠定基础。

关键词： HBV   治疗性抗体   Fc改造   新生儿Fc受体   半衰期  

摘要： 近年来,延长治疗性抗体半衰期已成为抗体工程改造的重点。抗体半衰期的延长不仅可以提高药效,减少给药频率,而且可以降低治疗费用。利用Fc基因改造以提高抗体和人新生儿Fc受体(hFcRn)亲和力的方法已被广泛应用于延长抗体的半衰期。然而,同一 Fc的有效突变改造对于不同抗体,半衰期的延长效果会有差异。本研究拟通过对不同已报道的Fc有效突变的筛选,获得能够延长HBV治疗性人源化抗体huE6F6体内半衰期的Fc改造抗体。主要研究内容包括以下三部分:第一,Fc改造抗体的表达与性质分析。本研究选用三种已报道能够提高抗体半衰期的Fc突变组合,分别构建并表达了 huE6F6-YTE(M252Y/S254T/T256E)、huE6F6-QL(T250Q/M428L)和 huE6F6-LS(M428L/M434S)改造抗体。通过DSC测定热稳定性发现,改造抗体与野生型抗体的Tml值在60℃以上,Tm2值保持同一水平,在81℃～82℃之间,表明改造抗体构象基本稳定。改造抗体的HBsAg结合活性检测表明Fc区域的点突变并不影响抗体原有的抗原特异性。初步比较了这三株改造抗体与hFcRn受体分子的pH依赖结合活性,其中huE6F6-YTE在pH 6.0的条件下提高了约60倍,同时能够保持pH依赖性;而另外两个改造抗体的结合活性提高倍数在10倍以内,pH依赖性并不明显。第二,基于细胞的改造抗体与FcRn结合活性检测。通过构建稳定表达EGFP-hFcRn的MDCK细胞株,采用pH 6.0条件下与人IgG竞争结合细胞上hFcRn受体的方式比较了各个改造抗体的结合效果,发现huE6F6-YTE改造抗体结合能力最强。由此确定以huE6F6-YTE作为后续动物体内半衰期效果评估的候选分子。第三,评估huE6F6-YTE在实验动物体内的半衰期以及抗原清除效果。结果显示,huE6F6-YTE在hFcRn转基因小鼠和食蟹猴体内的半衰期分别为野生型的1.5倍和2.5倍。huE6F6-YTE在HBV转基因小鼠体内的抗原清除程度不及野生型抗体,但是持续时间较长,达到4天左右。在食蟹猴体内HBsAg清除效果测试中,huE6F6-YTE注射组食蟹猴体内的抗原半衰期是huE6F6-WT注射组的4倍,而huE6F6-YTE的抗体半衰期为huE6F6-WT的1.5倍。总之,本研究通过Fc改造成功获得半衰期显著改善的HBV治疗性抗体,对治疗慢性乙型肝炎的临床前研究具有重要意义。