关键词： 诱变育种   杂交育种   多、单倍体育种   基因工程育种   细胞工程育种  

摘要： 生物育种会用到的理论有遗传学理论、现代生物工程技术、细胞生物学等培养新种类,在职业高中学习期间,课本包含的育种方法有诱变育种,杂交育种,多、单倍体育种,基因工程育种以及细胞工程育种等。生物育种技术代表了当代生物科学研究的最新成果和实际使用。这些知识分散在教材里面,在最后的复习时期,可以为学生进行概括归纳,建立起全面的知识体系。

关键词： 猫细小病毒   单克隆抗体   抗体基因区分析   基因工程抗体  

摘要： 猫细小病毒(Feline parvovirus,FPV),又名猫泛白细胞减少症病毒,属细小病毒科、细小病毒属成员。可引起猫及猫科动物的泛白细胞减少症,表现为高热、顽固性呕吐、腹泻、脱水及白细胞严重减少,常造成幼猫的感染和高死亡率。目前临床对猫细小病毒及犬细小病毒的主要的治疗手段依赖于大量注射抗病毒单克隆抗体。鼠源单抗在用于异种动物治疗上通常不能有效激活补体和Fc受体相关的效应系统,并且能诱发抗鼠抗体,使得疗效降低并加重了动物免疫系统的负担。本研究开发的基因重组嵌合抗体,用抗猫、犬细小病毒的单克隆抗体的可变区替换犬天然抗体的可变区,使重组嵌合抗体在保留单克隆抗体的高亲和力的基础上实现犬源化的改造,达到减少抗体免疫原性的目的,提高抗体在临床上的疗效。本研究通过聚乙二醇法融合FPV免疫小鼠脾脏的细胞与SP2/0细胞,通过免疫荧光(IFA)鉴定、中和实验鉴定,获得一株单克隆抗体3A8,经鉴定该单抗具有与FPV和CPV的中和活性。同时研究并分析了犬天然抗体的可变区、恒定区的位置和次级的结构和分区。克隆单克隆抗体可变区基因及犬抗体的恒定区基因,嵌合两部分基因得到重组抗体基因。将重组抗体基因克隆至真核表达载体pFastBac-Dual杆状病毒穿梭载体质粒,转化DH10Bac感受态,再通过提取重组杆粒DNA,转入昆虫细胞进行真核表达。并对表达的重组嵌合抗体进行SDS-PAGE、Western-blot、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验和免疫荧光实验对表达的嵌合抗体进行鉴定。通过上述实验后验证了经昆虫细胞真核表达的重嵌合抗体,其重链大小为55kDa、轻链大小为25kDa。该重组嵌合抗体保留了来源于单克隆抗体的对FPV、CPV的中和活性,同时其恒定区部分成功犬源化。说明本研究实现了在保留单克隆抗体中和活性的基础上对单抗犬源化的改造,从而达到了减少抗体用于异种动物免疫源性的目的。

关键词： 寨卡病毒感染   重组亚单位疫苗   减毒疫苗   免疫机制  

摘要： 1947年在乌干达的寨卡丛林中，科学家们首次在恒河猴中发现并分离寨卡病毒。在此后的60年间里，由于寨卡病毒感染病例较少，感染寨卡病毒之后病人不表现严重症状，所以它一直没有受到重视。直至2007年，在西太平洋的雅浦岛上，寨卡病毒首次在人群中大规模暴发，超过80％的当地居民被感染。更重要的是，此后当地居民患格林巴列综合征的发病率显著提高。在2015年，寨卡病毒又在世界范围内发生了大暴发，超过80个国家及地区发现寨卡病毒病例。在全球范围内，超过200万例病人表现出寨卡病毒感染后的症候群。其中，仅在巴西，就有超过100万例被感染的病人。在此大暴发过程中，科学家们发现寨卡病毒感染可以致使婴儿或胎儿罹患小头症。这些因素导致在2016年，世界卫生组织WHO将寨卡病毒大暴发列为“全球性紧急突发事件”，从而引起世界所有国家及地区的重视。与此同时，各国科学家也积极参与对寨卡病毒基础及临床相关研究。基于此背景下，我将自己的课题聚焦于研制开发寨卡病毒疫苗及探究在寨卡病毒疫苗如何诱导保护性免疫反应。　　首先，我设计了一个重组亚单位疫苗免疫原并且使用它建立实验系统。寨卡病毒隶属于黄病毒科、黄病毒属。寨卡病毒的基因组是包括一个整体开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)的单链正义RNA，其编码3个结构蛋白及7个非结构蛋白。完全成熟的寨卡病毒颗粒表面是由90对反向平行的包膜蛋白(E)组成的正20面体。因为E蛋白的外包膜区域(E80)是中和抗体的主要结合位点，所以直接选取了E80蛋白作为免疫原。利用真核果蝇表达系统(S2expression system)和原核大肠杆菌表达系统(*** expression system)分别表达并纯化了寨卡病毒E80蛋白，并分别命名为E80_S和E80_E。　　为了检测这两种免疫原的免疫原性，分别将E80_S蛋白和E80_E蛋白与铝佐剂混合，在第0周，第2周和第4周对野生型Balb/c小鼠进行了三次免疫，用PBS与铝佐剂混合并免疫的Balb/c小鼠作为阴性对照组。在第5周，解剖小鼠获得脾脏，通过滤网研磨过滤获得脾脏细胞，以用于细胞免疫反应检测。在ELISPOT实验中，与PBS免疫的阴性对照组相比，蛋白免疫组小鼠的脾脏免疫细胞只有在寨卡病毒E80蛋白刺激后，IFNγ的分泌量显著上升;而免疫组中对照蛋白(不相关HIV合成多肽及相似蛋白登革病毒E80蛋白)刺激后的脾脏细胞，无显著IFNγ分泌量增加。与ELISPOT结果相类似，通过流式细胞分析(FACS)，只有在寨卡病毒E80蛋白作为刺激物时，免疫组的CD4T细胞中IL-2才会显著表达。这说明两种免疫原都可以有效地引起免疫正常小鼠体内的抗原特异性细胞免疫反应。在平行实验中，第6周，采取小鼠血清，检测抗体反应。通过免疫酶联反应(ELISA)实验检测，两种免疫原在低免疫剂量(10μg)及高免疫剂量(50μg)免疫小鼠中均可以诱导出抗原特异性抗体反应。在各组小鼠抗原特异性抗体量的比较中，高剂量组显著优于低剂量组，同时E80S免疫组显著优于E80E免疫组。之后，进一步检测了血清中和抗体反应，发现两种免疫原均可以在免疫正常小鼠中诱导产生中和抗体反应。其中高剂量E80S免疫组小鼠体内中和抗体水平最高。最后，在野生型小鼠模型中，检测了免疫后的小鼠对寨卡病毒感染的抵抗能力。使用高剂量E80E和E80S免疫的小鼠，病毒血症严重程度和病毒血症持续时间均显著低于阴性对照组中的小鼠。部分(2/5)高剂量E80_S免疫的小鼠完全没有产生病毒血症。此外，高剂量E80_S和E80_E免疫的小鼠在寨卡病毒感染时，体重下降程度显著小于阴性对照组。这说明E80_S和E80_E免疫原可以有效地诱导正常小鼠产生细胞免疫和体液免疫应答，并在寨卡病毒感染时，为免疫小鼠提供有效的保护作用。　　随后，我使用了更复杂的病毒形式的免疫原来探究其是否也可以诱导出保护性免疫反应。由于寨卡病毒无法阻断小鼠中I型干扰素通路(IFNα/β通路)，所以寨卡病毒不能在免疫健全小鼠中复制。在正常小鼠中，寨卡病毒可以认为是体内减毒活疫苗。通过anti一IFNRα/β抗体免疫调节之后，寨卡体内减活病毒疫苗可以在免疫后第七天就快速诱导出高中和力的抗体。在第七天的中和抗体中，已经存在大量抗原特异性IgG。而在所有IgG中，IgG2a(c)占比例较大。滤泡辅助性T细胞(Tfh细胞)和生发中心B细胞(GC B细胞)对于抗体产生有至关重要的作用。于是在免疫正常小鼠中，具体的描述了从免疫后第7天到第28天的Tm细胞、前体滤泡辅助性T细胞(pre-Tfh细胞)和GC B细胞反应的反应动力学。并且，发现Tfh细胞和GC B细胞反应与中和抗体反应密切相关。　　因为之前有文献报道，流感疫苗免疫后，Th1细胞而不是Tfh细胞对于保护性中和抗体反应和I

关键词： 草鱼呼肠孤病毒   DNA疫苗   亚单位疫苗   VP35蛋白   VP56蛋白   免疫保护  

摘要： 草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国重要的淡水养殖鱼类之一,而草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)引起的草鱼出血病,是危害草鱼养殖业的主要病毒性疾病。草鱼呼肠孤病毒为双链RNA病毒,含11个基因片段编码112个蛋白,同时根据基因型分类为GCRV I型、II型和III型,其中II型是主要的流行病毒,致死率高。但是目前针对II型GCRV的疫苗种类很少,无法满足生产实际的需要,严重制约着草鱼养殖业的健康发展。本论文以草鱼呼肠孤病毒河南分离株GCRV-HN14为研究对象,生物信息学分析为II型草鱼呼肠孤病毒,其中S11序列片段编码的VP35蛋白含有锌指结构基序,该基序也存在于其他呼肠孤病毒外衣壳蛋白中,所以推测VP35是外衣壳蛋白;S7序列编码的VP56蛋白类似腺病毒的纤维突起蛋白,称为类纤突蛋白,推测其具有类似于纤突蛋白中和病毒的能力而表现较好的免疫原性。基于此,本论文采用S11节段,构建真核和原核表达载体,制备DNA疫苗和亚单位疫苗,针对S7节段制备亚单位疫苗,分别免疫草鱼后检测了一系列免疫保护指标进行疫苗效果评价。本文的主要内容如下:***疫苗的制备与免疫效果评价以GCRV-HN14病毒基因组为模板,通过反转录、基因克隆,获得S11片段。将S11序列ORF插入pcDNA3.1(+)真核表达载体,构建重组表达载体pcDNA3.1-s11并测序验证,重组质粒作为DNA疫苗。通过Western blot验证,pcDNA3.1-s11在草鱼肾细胞中成功表达重组蛋白VP35。之后,以10μg pcDNA3.1-s11肌肉注射草鱼,设PBS为对照组,pcDNA3.1(+)为空载体组,于免疫后1、7、14、21、28、35、42和49 d收集样品,采用一系列指标评价免疫保护效果。结果如下:(1)质粒在鱼体内分布表达检测:通过PCR检测,在血液、肝脏、脾脏、肾脏和肌肉中均有pcDNA3.1-s11分布;通过Western blot检测质粒表达,仅在肌肉中有重组蛋白VP35表达。(2)外周血细胞数量变化以及白细胞分类计数:pcDNA3.1-s11疫苗免疫草鱼后,各组间红细胞数量没有显著性差异(p>0.05);与对照组相比,免疫组白细胞数量在免疫后1、7和14 d显著增加(p<0.05或p<0.01);免疫草鱼体内中性粒细胞和淋巴细胞的比例明显增高,在7 d单核细胞百分比达到峰值[(24.13±2.38)%;p<0.01],在14 d淋巴细胞比例达到峰值[(93.30±4.71)%;p<0.05]。(3)血清抗体效价检测:在免疫后7 d,免疫草鱼体内产生了抗VP35蛋白的抗体,免疫后28 d抗体效价最高(OD为0.79±0.06;p<0.01)。(4)免疫相关基因:IFN1、TLR22、MHC I和IgM在头肾和脾脏中的相对表达量变化显示,四种免疫基因的表达量在免疫后均有不同程度的上调。与对照组相比,头肾中IFN1在免疫后7 d开始上调,第14 d呈现最高,上调11.68倍(p<0.01);脾脏中IFN1在14 d上调,第21 d达到峰值,上调17倍左右(p<0.01)。头肾与脾脏的TLR22在1 d显著上调,在第14 d达到最高,分别约上调6倍和120倍(p<0.05或p<0.01)。头肾与脾脏的MHC I的表达变化与TLR22相似,在1 d开始上调,第21 d达到峰值(p<0.05或p<0.01)。头肾与脾脏的IgM在7 d开始上调,分别在35 d和28 d上调11.59倍和17.84倍,达到峰值(p<0.01)。(5)免疫保护率:在免疫后21 d攻毒,pcDNA3.1(+)组和空白对照组的死亡率在90%5%,pcDNA3.1-s11免疫组死亡率为26.79.6%,DNA疫苗的相对保护率约为70%。***35亚单位疫苗的制备与免疫效果评价将S11片段克隆到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET32a-VP35,转化大肠杆菌DE3。通过SDS-PAGE对重组蛋白(rVP35)的可溶性分析,rVP35主要以包涵体形式存在。同时优化重组蛋白表达条件后,选择1 mM IPTG诱导6 h,进行诱导表达。Ni柱纯化及复性获得重组蛋白,以每尾腹腔注射30μg rVP35免疫草鱼,于免疫后1、3、5、7、14、21、28和35 d收集样品,进行一系列指标评价免疫保护效果。结果如下:(1)外周血细胞数量以及白细胞分类比例变化:rVP35免疫后,白细胞数量显著高于对照组,其中单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞百分比显著升高。免疫草鱼体内红细胞数目维持在(2.03±0.07)×10/mL,与对照组无差异(p>0.05)。白细胞数量在第3 d开始升高,第5 d达到峰值[(7.92±0.72)×10/

关键词： 多聚体   TgDLC8a-GST多聚表达载体   基因工程疫苗  

摘要： 同源二聚体是生物蛋白质较常见的存在形式。两种同源二聚体蛋白可以形成多聚体复合物。可广泛应用于多种领域,其中一个非常重要的应用是可以用作抗原表达平台,用来插入抗原表位,来提高抗原的载量。本研究利用弓形虫的动力蛋白轻链8a(TgDLC8a)和谷胱甘肽S转移酶(GST)这两个同源二聚体表达形成多聚体复合物,作为一个疫苗表达平台,插入鸡艾美尔球虫的多种抗原片段。以带有GST标签的PGEX-6P-1为载体,通过基因工程技术将TgDLC8a基因克隆至PGEX-6P-1载体上,利用PGEX-6P-1携带的GST蛋白完成与TgDLC8a的融合。为了展示抗原,选取GST与TgDLC8a基因之间的BamHI和对TgDLC8a蛋白空间结构影响较小部位(37-42 bp)两个位置作为抗原的插入位点,构建多聚表达载体TgDLC8a-GST。将柔嫩艾美尔球虫抗原EtMIC2、EtMIC1H的关键结构域克隆到TgDLC8a-GST载体上,利用诱导表达的多价抗原复合物对该表达平台进行评价。TgDLC8a-GST转BL21诱导表达产物经Native-PAGE和Western-blot分析表明,融合的TgDLC8a-GST同源二聚体可以形成多聚体复合物。抗原基因克隆至重组表达载体后均可成功表达并形成蛋白二聚体及多聚体,表明TgDLC8a插入的酶切位点不影响其同源二聚体的形成,该平台可以用于疫苗展示。研究表明TgDLC8a和GST融合成的同源二聚体可以形成多聚复合物。本研究成功构建了重组多聚体表达平台(TgDLC8a-GST),该平台可以高效地以多价态的形式展示抗原,为基因工程疫苗的研发提供了良好平台。利用鸡球虫感染试验对该重组疫苗株的免疫保护效果进行了探究。140只一日龄雏鸡随机平均分成7组,I、II组为PBS对照组,III、IV、V、VI、VII组动物分别皮下多点免疫TgDLC8a-GST蛋白抗原疫苗、TgDLC8a-GST-MIC2-MIC1H蛋白抗原疫苗、TgDLC8a-GST-MIC2-MIC1H蛋白抗原疫苗(辅助佐剂)、EtMIC2、EtMIC1H混合蛋白抗原疫苗、EtMIC2、EtMIC1H混合蛋白抗原疫苗(辅助佐剂)。21日龄时,对II、III、IV、V、VI、VII组口服接种16000个***孢子化卵囊。31日龄时,对结果进行分析。动物试验结果表明,IV、V、VI、VII组蛋白抗原疫苗均能够对球虫的感染提供一定的保护作用,且IV组平台表达疫苗株与VI组比较要有效。

关键词： PEDV S1蛋白   杆状病毒表达系统   基因拷贝数   PEDV疫苗  

摘要： 猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是全球流行的极具威胁性的猪病之一,由具有高致死率的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起。该病在世界各地的爆发给全球养猪业造成了重大经济损失,但迄今为止尚无有效安全的疫苗可用。因此,研制安全高效的PEDV疫苗具有十分重要的意义。S蛋白是PEDV的主要结构蛋白,由S1区和S2区组成,其中S1含有3个中和表位区域,常作为PEDV基因工程疫苗研究中最重要的一个靶蛋白。本研究利用MultiBac多基因表达系统构建含有不同S1基因拷贝数的重组杆状病毒:AcMNPV-IM-p10S1、AcMNPV-IM-2p10S1、AcMNPV-IM-3p10S1、AcMNPV-IM-phS1、AcMNPV-IM-2phS1、AcMNPV-IM-3phS1、AcMNPV-IM-p10S1-phS1和AcMNPV-IM-2p10S1-2phS1,以实现S1蛋白在昆虫细胞中的高效表达,并将纯化后的S1蛋白作为基因工程疫苗使用,初步探索PEDV S1蛋白在BALB/c小鼠上的免疫效果。通过Western Blot和His标签ELISA定量检测试剂盒分析S1蛋白的表达情况,结果显示不同拷贝数的重组杆状病毒感染Sf9细胞后,S1蛋白均能有效表达,而且其蛋白表达量受到基因拷贝数和启动子的影响。1.当S1基因由1拷贝增加到3拷贝时,表达量随拷贝数的增加而增加,在3拷贝时表达量达到最高,4拷贝时有所下降。2.p10启动子驱动的蛋白表达量要显著高于polh启动子驱动的蛋白表达量。将表达的S1蛋白经过镍柱亲和层析纯化后与等量的佐剂混匀并乳化制备PEDV亚单位疫苗,然后将其背部皮下注射免疫小鼠。间接ELISA检测S1蛋白刺激小鼠产生的血清抗体水平。结果表明S1蛋白可以诱导小鼠产生特异性免疫反应。本研究利用杆状病毒多基因表达系统成功表达了PEDV S1蛋白,并利用多拷贝表达和替换启动子摸索了提高蛋白表达量的方法,而且纯化后的S1蛋白具有良好的免疫原性,为以后研发基于S1蛋白的PEDV基因工程疫苗提供有力的支持。

关键词： 猪流感病毒   伪狂犬病病毒表达载体   基因工程疫苗   Bac-Bac杆状病毒表达   HA亚单位疫苗  

摘要： 猪流感是由猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)引起的一种急性、热性、高度传染性呼吸系统疾病。猪流感病毒亚型众多,变异速度快,广泛流行于包括我国在内的世界各地养殖场猪群中,给全球养殖业带来了巨大的经济损失。目前疫苗接种仍是防控猪流感的最有效手段。在保证疫苗安全性的前提下,为了提高猪流感疫苗的保护效果,本研究分别制备了表达SIV血凝素(HA)基因的活病毒载体疫苗r SMX?TK?g I/g E-opti HA和利用杆状病毒表达系统表达并纯化的HA蛋白制备的亚单位疫苗,并对两者的单独及联合免疫效果进行初步研究。通过将两种疫苗单独或配合使用,测定各组体液免疫和细胞免疫水平、攻毒后的病理损伤情况、体重丢失以及存活率等方面来比较不同免疫策略下保护效果的差异,以期找到免疫效果最佳的疫苗组合,为猪流感疫苗的研发提供可靠的数据支持。本研究主要内容如下:1.表达SIV HA基因的重组变异伪狂犬病病毒r PRV-HA的制备本研究以变异伪狂犬病病毒基因缺失毒株(r SMX?g I/g E?TK)为载体,以密码子优化的H1N1亚型猪流感病毒HA基因为目的基因,采用同源重组的方法,成功构建了重组病毒r SMX?TK?g I/g E-opti HA,并对获得的重组病毒在多种细胞上的增殖特性、一步生长曲线、遗传稳定性以及对小鼠的安全性等生物学特性进行了研究。结果表明,r SMX?TK?g I/g E-opti HA能够稳定表达HA蛋白。该重组病毒在ST、PK-15、Vero和BHK-21细胞上的毒价均高于107.0 TCID50/0.1 m L,并且在PK-15细胞上的毒价达108.0 TCID50/0.1 m L。一步生长曲线结果表明,该重组病毒的增殖特性与亲本毒株一致。连续传代20代后,HA基因未发生变异,表明该重组病毒具有良好的遗传稳定性,并且对小鼠安全性良好。***蛋白亚单位疫苗的制备本研究采用经典的Bac-to-Bac杆状病毒真核表达系统,表达HA蛋白。将SIV HA基因的信号肽及胞外域片段克隆到转移载体p Fast Bac HT B中,获取重组质粒p Fast Bac HT B-HA。将鉴定正确的重组质粒p Fast Bac HT B-HA转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经三次蓝白斑筛选得到含HA基因的重组杆状病毒质粒r Bacmid-HA。随后,将重组杆粒r Bacmid-HA转染至sf9昆虫细胞中,获得重组杆状病毒r Ac MNPV-HA,传代3次后,用sf9细胞进行重组蛋白的优化表达。SDS-PAGE和Wstern blotting结果显示,重组蛋白在培养上清和细胞内均表达,且培养上清中的蛋白,即分泌蛋白均以糖基化形式存在;而在细胞内表达的蛋白多以非糖基化形式存在。3.两种猪流感基因工程疫苗单独及联合免疫效果研究在成功制备了活病毒载体疫苗r SMX?g I/g E?TK-opti HA和HA蛋白亚单位疫苗的基础上,本研究将4周龄健康雌性BLAB/c小鼠随机分为8组,其中3个实验组和5个对照组,每组10只,空白对照组(非免疫不攻毒)每组5只。采取皮下注射的免疫方式进行r SMX?TK?g I/g E-opti HA活病毒载体疫苗的单独免疫、HA蛋白亚单位疫苗的单独免疫以及r SMX?TK?g I/g E-opti HA活病毒载体疫苗和HA蛋白亚单位疫苗的联合免疫,同时设置亲本病毒载体对照组,DMEM对照组、佐剂对照组、灭活疫苗对照组以及空白对照组(详细分组见表3-6)。每组共免疫2次,间隔4周。分别在首免后第0、2、4和6周采血检测SIV ELISA抗体、PRV ELISA抗体、SIV HI抗体以及细胞因子IFN-γ,并于加强免疫2周后,在乙醚麻醉下,用H1N1(F9)(LD50为102.38 TCID50)通过滴鼻方式进行攻毒,剂量为50ul/只。攻毒后连续14 d每日称量每只小鼠的体重,并观察小鼠临床表现及统计死亡情况。结果显示,r SMX?TK?g I/g E-opti HA活病毒载体疫苗单独免疫、HA蛋白亚单位疫苗的单独免疫以及两种疫苗联合免疫均能够刺激小鼠产生特异性体液免疫应答及细胞免疫应答;r SMX?TK?g I/g E-opti HA的单独免疫效果最佳但低于SIV灭活疫苗对照组。攻毒保护力试验结果表明,两种疫苗单独及联合免疫对小鼠均有较好的保护力,保护率分别为85.7%、85.7%和71.4%,PBS对照组存活率仅42.9%。r SMX?TK?g I/g E-opti HA的单独免疫与两种疫苗联合免疫保护力相当,且高于HA亚单位疫苗的单独免疫。因此,从本研究结果可以初步判定r SMX?TK?g I/g E-opti HA单独免疫具有最佳的免疫保护效果。

关键词： 轮状病毒   基因工程疫苗   VP4~*   免疫原性   中和活性  

摘要： A组轮状病毒(RV)是引起婴幼儿严重腹泻的主要病原体,严重时导致死亡,疫苗接种是预防轮状病毒感染的有效手段。随着卫生条件的改善以及轮状病毒疫苗的推广,轮状病毒导致的发病率和死亡率均显著降低。但是,目前上市的疫苗均为减毒活疫苗,在轮状病毒导致的死亡率较高的欠发达地区的保护率低于50%,因此,急需发展更加安全有效的轮状病毒疫苗以降低轮状病毒感染导致的死亡率。高滴度的母源抗体是导致轮状病毒疫苗在这些地区保护率降低的主要原因之一。非复制型疫苗,特别是基因工程疫苗,由于安全性高,且通过肠道外免疫可以在一定程度上避免母源抗体的干扰,成为近年来研究的重点。本课题组在前期研究中基于大肠杆菌系统表达了截短羊轮状病毒的VP4*(aa26-476)蛋白,并通过小鼠模型证实该蛋白具有较好的免疫原性和免疫保护性。在前期工作的基础上,我们进一步表达了在婴幼儿中流行最为广泛的P[8]型轮状病毒Wa毒株的VP4*蛋白,并与目前已经进入临床Ⅰ、Ⅱ期的轮状病毒候选基因工程疫苗P2-VP8进行平行比较,研究其成为轮状病毒候选疫苗的可行性。结果发现:重组表达的VP4*和P2-VP8均具有较好的均一性和热稳定性;VP4*蛋白相比P2-VP8具有更强的中和抗体结合能力,并且在豚鼠和家兔中均具有更高的免疫中和和活性;此外,重组表达的VP4*蛋白在小型猪以及灵长类动物食蟹猴中也均具有较高的免疫原性和免疫中和活性;VP4*免疫血清不仅可以中和同型轮状病毒的感染,对异型毒株也具有交叉中和活性。综上所述,原核表达P[8]型人源轮状病毒VP4*蛋白具有较高的均一性、热稳定性,相比临床Ⅰ、Ⅱ期的基因工程疫苗P2-VP8具有更高的抗原性和免疫中和活性,且在小型猪和食蟹猴中也具有较高的免疫原性。因此,VP4*相比P2-VP8更适合成为轮状病毒候选疫苗,为研制新型的轮状病毒基因工程疫苗奠定了良好的基础。

关键词： 柯萨奇病毒B组4型   基因工程疫苗   灭活疫苗   滴鼻免疫   皮下免疫   母传抗体  

摘要： 研究背景与目的柯萨奇B组病毒(Coxsackievirus B,CV-B)分为6个血清型,CV-B组病毒分布较广泛,人类感染的机会较大,病毒进入人体后在特定的组织或器官内进行复制,致使心脏、胰腺、肌肉、骨骼发生病变。柯萨奇B组4型(Coxsackievirus B4,CV-B4)是CV-B组病毒中较为常见及典型的病毒。有研究表明CV-B4病毒是在婴幼儿时期引起胰岛素依赖性糖尿病的主要致病因素之一,另外还可导致新生儿感染心肌炎和脑炎。与其他肠道病毒相比,CV-B4病毒的致死率较高。目前,尚无防控CV-B4感染的疫苗,缺乏高效的治疗药物。当前,基因工程疫苗研发技术的愈加成熟,相较于传统灭活疫苗具备更好的安全性。考虑到对CV-B4疫苗需求的提高,在本研究中,针对构建的以水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)为载体的CV-B4疫苗,通过Western Blot及间接免疫荧光验证重组疫苗的蛋白表达水平,并利用建立的BALB/c乳鼠的CV-B4感染模型,与传统CV-B4灭活疫苗比较,进一步评价该CV-B4基因工程疫苗对乳鼠的保护效果,以期为CV-B4病毒的预防控制提供更安全高效的疫苗,降低CV-B4病毒的感染率。本实验针对以VSV为载体所构建的含CV-B4分离株LY114F VP1片段的重组载体疫苗VSV-VP1,经Western Blot及间接免疫荧光验证了重组疫苗的成功构建。并且,基于前期建立的CV-B4动物感染模型,对比VSV-VP1疫苗滴鼻免疫、皮下免疫及CV-B4灭活疫苗皮下免疫后,BALB/c成年鼠体内产生的Ig G和Ig A含量、免疫BALB/c孕鼠后仔鼠的存活率、组织病理学变化及体内细胞因子的表达水平,评价CV-B4基因工程苗和传统灭活疫苗的免疫保护效果,以期为预防CV-B4感染的疫苗选择及应用提供参考。研究方法***-B4分离株的准备及体内致病性提取患儿粪便中病毒总RNA,进行CV-B4病毒的初步鉴定并测序。对CV-B4鉴定阳性的样本,经Vero细胞进行增殖培养,测定病毒载量。选取的1日龄BALB/c乳鼠经肌肉注射途径感染10 TCID/只的CV-B4病毒液,通过动物存活率和临床评分,分析CV-B4病毒的体内致病性。将CV-B4病毒液注射于成年雄性BALB/c鼠体内,观察成年鼠的血糖及糖耐量变化。***-VP1重组疫苗VP1蛋白的表达验证为验证VSV-VP1重组疫苗蛋白VP1蛋白是否正确表达,进行了两部分实验进行验证:Western Blot检测及间接免疫荧光。将包被有CV-B4 VP1的VSV-VP1重组疫苗感染Vero细胞,CV-B4病毒液为对照收集细胞液进行SDS-PAGE凝胶电泳,Western Blot验证比较重组疫苗中CV-B4 VP1和CV-B4目的蛋白的大小;用VSV-VP1感染Vero细胞,CV-B4多抗血清孵育,DAPI染色,在荧光显微镜下观察CV-B4 VP1蛋白是否已正常表达。***-VP1免疫效果与灭活CV-B4疫苗的免疫效果比较将BALB/c雄性成年鼠随机分为4组,即CV-B4灭活免疫组、VSV-VP1皮下免疫组、VSV-VP1滴鼻免疫组、空白对照组,每只小鼠等剂量免疫。免疫后0 w、1 w、2 w、3 w、4 w、5 w、6 w取小鼠眼球血离心收集血清用来检测Ig G含量,同时收集小鼠粪便测Ig A含量。为进一步验证两种疫苗的免疫效果,进行了母传抗体保护实验。选取刚怀孕的成年雌性鼠随机分为5组,分别为CV-B4灭活组、VSV-VP1滴鼻免疫组、VSV-VP1皮下免疫组、阴性对照组及空白对照组。对照组孕鼠等剂量注射PBS。对生产的一日龄乳鼠,等剂量肌肉注射CV-B4病毒液。每天记录乳鼠体重及临床症状。显微镜检乳鼠组织的病理学变化。通过ELISA法检测乳鼠感染CV-B4病毒后第1、3、5天的心脏血,4℃过夜静置后离心取上清,测血浆中细胞因子IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的表达水平,以初步了解上述细胞因子在CV-B4感染中可能发挥的作用。研究结果1.经SDS-PAGE凝胶电泳显示,VSV-VP1疫苗所包被的CV-B4 VP1蛋白已成功表达。同时,间接免疫荧光试验也观察到了CV-B4 VP1蛋白表达的荧光信号。2.对比VSV-VP1基因工程疫苗和CV-B4灭活疫苗对成年鼠的免疫结果显示,VSV-VP1滴鼻免疫在免疫一次后产生的Ig G含量较VSV-VP1重组疫苗、CV-B4灭活疫苗产生的Ig G含量高。***-VP1基因工程疫苗和CV-B4灭活疫苗的母传抗体保护实验中取乳鼠心脏、肺、后肢肌、脑做HE染色,结果显示CV-B4病毒对脑、肌肉的损伤较大,主要引起脑、后肢肌出现淋巴细胞浸润、水肿及纤维组织增生,并且出现肌束断裂。阳性对照组脑

关键词： 基因工程   植物育种   应用   遗传  

摘要： 基因工程是生物科学研究中的四大工程之一,在植物、动物、生态建设等方面均有重要作用。植物育种是我国农业发展的关键所在,基因工程在植物育种方面大有可为,且已经取得优异的成果。文章以基因工程技术为研究对象,重点探讨了基因工程技术在植物育种方面的具体应用,旨在提高我国农业发展水平与植物生产率。