关键词： 杆状病毒表达系统   基因工程疫苗   H5N1   H7N9   HA基因  

摘要： H5N1和H7N9亚型高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)不仅严重影响了家禽养殖业的健康发展,还对人类公共卫生安全带来了严重威胁。目前禽流感病毒的防控主要依赖于全病毒灭活疫苗,大多采用鸡胚工艺进行疫苗生产,在生产过程中存在较大的生物安全威胁,因此亟需开发一种新的安全有效的禽流感候选疫苗。本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达了禽流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白,制备了禽流感基因工程亚单位疫苗,并初步评估了其免疫效果。本研究首先将H5N1(D889)和H7N9(E157)毒株的HA基因插入到转递质粒p ACEBac1中,进一步构建重组穿梭载体,转染sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒BV-HA5和BV-HA7。对表达的HA蛋白进行SDS-PAGE、Western Blot和血凝试验鉴定。SDS-PAGE和Western Blot试验结果显示H7N9的HA蛋白大小约为63 k Da,H5N1的HA蛋白大小约为70 k Da;血凝试验结果表明,H7N9 AIV的HA蛋白血凝效价为2,H5N1 AIV的HA蛋白血凝效价为2。通过SPF鸡试验对HA蛋白的免疫原性进行评估,H7N9和H5N1动物试验各分三组,即高剂量组、低剂量组和PBS对照组,其中高剂量组HA蛋白的血凝效价为2,低剂量组HA蛋白的血凝效价为2,免疫剂量为0.5 m L/只。首次免疫后三周使用同源毒株攻毒,攻毒剂量为10 EID/200μL。攻毒后连续观察14天,并记录临床症状表现和死亡情况。试验结果表明:疫苗免疫后三周,H7N9高剂量组平均HI(Hemagglutination inhibition,HI)效价为6.4log2,H7N9低剂量组平均HI效价为6.1log2,两组HI效价差异不显著(P>0.05);H5N1高剂量组平均HI效价为4.6log2,H5N1低剂量组平均HI效价为3.8log2,两组HI效价差异不显著(P>0.05)。攻毒后,H7N9高剂量组和H7N9低剂量组SPF鸡存活率均为100%,H5N1高剂量组和H5N1低剂量组SPF鸡存活率均89%。排毒方面,H7N9高剂量组在第3天和第5天各检测到1只鸡排毒;H7N9低剂量组在第3天检测到3只鸡排毒;H5N1低剂量组在第3天检测到5只鸡排毒,第5天检测到2只鸡排毒;H5N1高剂量组在第3天检测到7只鸡排毒,第5天检测到4只鸡排毒。本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达了禽流感病毒的HA蛋白,基于HA蛋白制备了禽流感基因工程疫苗,为高致病性禽流感的防控提供了新的思路和技术平台。

关键词： 寨卡病毒   基孔肯雅病毒   蚊媒   重组腺病毒疫苗   重组痘苗病毒疫苗   复合型佐剂  

摘要： 寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是一种经伊蚊传播的蚊媒病毒,该病毒于1947年乌干达地区首次发现,2015年在巴西引发大规模疫情的暴发并迅速扩散至美洲及亚洲的多个国家和地区。感染患者主要表现出神经系统疾病及新生儿小头畸形等症状。2016年2月世界卫生组织宣布寨卡病毒感染为“国际关注的突发公共卫生事件”。基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)于1952年坦桑尼亚地区首次发现,自2004年以来再次在全球范围内暴发疫情,该病毒主要以伊蚊为传播媒介,感染后引起患者发热、关节痛及皮疹等症状。随着全球经济贸易和旅游等的往来,近年来中国相继有输入性ZIKV及CHIKV感染患者,经伊蚊叮咬后具有潜在的暴发流行性。目前尚无有效的疫苗预防ZIKV与CHIKV感染。本研究对2018年云南部分地区蚊媒携带ZIKV及CHIKV流行情况进行检测,并对其遗传进化进行分析。利用人腺病毒5型载体和痘苗病毒天坛株载体构建共表达ZIKV和CHIKV结构蛋白的重组载体病毒候选疫苗,通过免疫小鼠验证重组载体疫苗的免疫原性及保护性。主要研究结果如下:(1)对2018年云南省普洱市及大理自治州等地区蚊媒携带ZIKV及CHIKV情况进行检测,结果显示:所采集的蚊媒样品中未检测到ZIKV;CHIKV阳性率为6.9%,病毒主要由埃及伊蚊和三带喙库蚊携带。遗传进化分析显示CHIKV属于ECSA亚型,与印度株和斯里兰卡株同源性较高,推测CHIKV可能通过斯里兰卡和印度经蚊媒传播至中国云南地区。此外,CHIKV毒株均不存在E1 A226V位点突变,表明所检测到的CHIKV可能不通过白纹伊蚊进行传播。(2)以ZIKV SY012016株prME、E基因及CHIKV 0706a TW株E2、E1及E2-6K-E1基因为基础,构建单独表达ZIKV及CHIKV结构蛋白的重组腺病毒和重组痘苗病毒候选疫苗,进行小鼠免疫试验。结果显示:腺病毒与痘苗病毒载体表达的ZIKV/CHIKV候选疫苗能诱导小鼠产生体液免疫及细胞免疫应答,抑制ZIKV/CHIKV在小鼠脏器内的复制。(3)将ZIKV prME及CHIKV E2-6K-E1基因分别连接到腺病毒与痘苗病毒穿梭质粒,包装共表达ZIKV prME蛋白和CHIKV E2E1蛋白的重组腺病毒rAd-ZIKV-CHIKV和重组痘苗病毒rdVTT-ZIKV-CHIKV候选疫苗,采用腺病毒Prime-痘苗病毒Boost策略免疫小鼠。结果显示:采用Prime-Boost免疫策略能诱导小鼠产生较强的体液免疫与细胞免疫应答。在攻毒ZIKV/CHIKV后,免疫组小鼠脏器及血液中病毒载量比对照组低1～2个数量级。表明采用异源Prime-Boost免疫策略,在降低载体自身免疫的同时,能够增强小鼠体液免疫及细胞免疫应答,抑制小鼠脏器内病毒的复制及病毒血症的发生。(4)以ZJ01佐剂、ZJ02佐剂为基础,分别添加A、B、C、D组份构建第二代复合型疫苗佐剂。将佐剂分别与重组痘苗病毒rdVTT-ZIKV-E和ZIKV E蛋白混匀后免疫小鼠,验证不同佐剂对载体疫苗和亚单位疫苗的免疫增强作用。结果显示:ZJ01佐剂与ZJ02佐剂辅以A组份和D组份的复合型佐剂能促进载体疫苗及亚单位疫苗产生更强的体液免疫及细胞免疫应答。免疫35 dpi时,血清中IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b抗体水平及特异性抗体水平是不含佐剂组的1.50～3.35倍;中和抗体效价是不含佐剂组的1.75～2.5倍;CD4T淋巴细胞是不含佐剂组的1.22～1.28倍;CD8T淋巴细胞是不含佐剂组的1.02～1.09倍。表明含有A和D组份的ZJ01佐剂与ZJ02佐剂能更好增强载体疫苗和亚单位疫苗的免疫效果。综上所述,本研究检测云南部分地区蚊媒携带ZIKV及CHIKV情况,为中国云南ZIKV与CHIKV流行提供一定参考;利用腺病毒、痘苗病毒载体构建共表达ZIKV与CHIKV候选疫苗并采用异源Prime-Boost免疫策略免疫小鼠,在降低疫苗载体自身免疫的同时能够诱导小鼠体液免疫和细胞免疫反应,对攻毒的小鼠提供切实的保护作用;通过对佐剂的研究成功筛选出用于载体疫苗与亚单位疫苗的复合型佐剂,能够显著增强疫苗的免疫效果。本研究为ZIKV、CHIKV基因工程疫苗及复合型佐剂的研究奠定基础。

关键词： 棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗   阳性率   抗体水平   免疫应答  

摘要： 为了评价羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗对川西北高原牧区西藏羊的免疫效果,本试验将西藏羊随机均分为免疫组和对照组,免疫组羊按免疫剂量接种包虫病疫苗,28 d后加强免疫,对照组羊不接种。在加强免疫30 d后采集血液制备血清,用间接ELISA法检测血清中的特异性抗体,同时剖解部分试验羊,检查肺脏和肝脏中的包囊数量,统计保护率。结果显示:免疫组羊首免28 d后抗体阳性率为77.9%,加强免疫30 d后抗体阳性率为95.4%,与免疫前和对照组比较差异显著(P<0.05);剖检部分试验羊统计包囊数量,得出保护率达到了75.0%。本试验表明,羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗对阿坝地区西藏羊的棘球蚴病具有预防控制作用。

关键词： 基因工程疫苗   分类   特点   应用  

摘要： 随着生物学及重组DNA技术的发展,对基因工程疫苗的研究投入越来越多,利用基因工程开发新疫苗有利于打破传统疫苗的局限性。本文首先介绍了基因工程疫苗的原理,分析了基因工程疫苗的特点和缺陷之处,最后从重组亚单位疫苗、重组活载体疫苗及基因疫苗三个方面,探讨了基因工程疫苗的应用前景和发展趋势,旨在为相关研究与实践提供参考。

关键词： 晚疫病   致病机理   基因工程   发展前景  

摘要： 位列世界第三大粮食作物的马铃薯,晚疫病是其生长发育中的致命病害,每年因晚疫病造成巨大的损失,培育具晚疫病抗性品种成为当今马铃薯育种的头等任务。利用基因工程技术进行马铃薯晚疫病抗性研究则是当前世界针对此病采取的较为先进且绿色环保的技术,可以更加有效地提高马铃薯的产量。为了促进马铃薯抗晚疫病育种进展,本综述总结了马铃薯的致病机理及利用基因工程技术转抗病基因,转蛋白基因,转无毒基因和基因编辑技术,来提高马铃薯的晚疫病抗性,必将使晚疫病的防治能力大为提高。利用这些先进的技术进行育种,其前景十分广阔但也同时面临着许多问题与挑战。

关键词： 猪瘟   疫苗   基因工程   研究进展  

摘要： 规模化养猪场由于猪群较大、产仔数量多,极易发生猪瘟。猪瘟是一种传播速度快、死亡率高的烈性接触性传染病,对中国乃至世界养猪业造成严重危害。传统疫苗无法正确区分常规疫苗免疫与野毒感染,导致免疫失败的现象常有发生。因此,新型基因工程疫苗的研究对猪瘟病毒的防治具有重要意义。本文综述了国内外猪瘟基因工程疫苗的一些重要研究进展。以期为防控猪瘟提供理论指导。

关键词： 黄瓜   甜瓜   基因工程   分子遗传  

摘要： 黄瓜和甜瓜均属于葫芦科甜瓜属作物,作为重要的园艺作物在全世界广泛种植。我国黄瓜和甜瓜的种植面积与产量均居世界第一。不断培育优质高抗的新品种是促进产业持续发展的重要推动力,但常规育种存在转育效率低、育种周期长等问题。多年来瓜类育种家们一直致力于甜瓜属作物基因工程育种方法的探索和研究,随着黄瓜和甜瓜在基因组研究领域取得了重大突破,大量重要功能基因的发掘与克隆为基因工程育种带来了机遇,也促使甜瓜属作物基因工程技术研究进入了快速发展的阶段。就基因工程技术在甜瓜属作物分子遗传育种研究中的应用和发展现状、存在问题以及未来发展趋势等进行了探讨。

关键词： 黄花蒿   分子标记辅助育种   基因工程育种   分子设计育种   分子育种  

摘要： 疟疾被认为是世界三大致死疾病之一,黄花蒿是抗疟一线药物青蒿素的唯一天然植物来源,因此培育高青蒿素含量的黄花蒿新品种具有重要战略意义。随着黄花蒿种质资源库的建立及基因组、转录组、遗传图谱等遗传信息的公布,通过解析遗传信息发掘黄花蒿优质、抗逆基因和遗传标记等分子育种手段来快速培育优良品种成为黄花蒿未来育种的主要方向。该文基于黄花蒿的遗传背景和分子育种领域的研究现状,探讨并制定了黄花蒿分子育种策略和技术路线,对未来黄花蒿分子育种提供了指导与科学参考。

关键词： DNA疫苗   哈尔滨兽医研究所   H5亚型禽流感   中国农业科学院   抗原蛋白   基因工程疫苗   宿主细胞   免疫应答  

摘要： 据悉,由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制的用于预防H5亚型禽流感的DNA疫苗,经过严格的审评程序,获得国家一类新兽药证书。这是我国获得批准的首个DNA疫苗产品。DNA疫苗是将编码目的抗原蛋白基因序列的质粒经肌肉注射导入宿主细胞,通过转录系统表达抗原蛋白,诱导宿主产生针对该抗原蛋白的免疫应答,从而达到免疫目的的新型基因工程疫苗。

关键词： 口蹄疫病毒   基因工程疫苗   接触性传染病   偶蹄动物   virus   动物传染病   世界范围   动物疫病  

摘要： 口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（foot-andmouth disease virus,FMDV）引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病,可感染猪、牛、羊等70多种动物。该病传染性强、传播快、在世界范围广泛流行。OIE将其列在15个A类动物疫病之首,我国政府也将其排在一类动物传染病的第一位。一年四季均可发病,多发于冬、春寒冷季节。