关键词： 淋巴瘤   噬菌体显示   单克隆抗体   嵌合Fab’   CD20  

摘要： 本研究采用噬菌体表面显示技术克隆抗CD20抗体轻、重链可变区基因，构建嵌合抗CD20抗体及其Fab’片段，在哺乳动物细胞和大肠杆菌中进行表达;并对Fab’抗体片段的体内外抗瘤活性进行研究，以期将抗CD20抗体HI47推向B淋巴细胞瘤临床治疗应用。 一 轻重链可变区基因克隆及单链抗体库的构建 常规提取HI47杂交瘤细胞总RNA，利用RT-PCR法扩增抗体轻重链可变区基因片段，经Overlap PCR，利用连接链(GS)基因片段将抗体轻重链基因连接构成单链抗体(ScFv)基因，将ScFv基因重组到pCANTAB 5E载体上，构建抗CD20单链抗体噬菌体文库(约3×10克隆)，以表达CD20分子的Daudi细胞为靶抗原，经Panning，ELISA法筛选，获得多个具有CD20结合活性的克隆，对克隆6的基因序列进行序列测定分析，结果显示克隆6的基因序列完符合PDB文库中的抗体基本框架序列，是抗体基因序列。 二 嵌合抗体的构建表达及活性鉴定 利用PCR从表达载体pCANTAB 5Ecd20ScFv上扩增抗CD20抗体轻重链可变区基因，将VH、VL基因克隆到表达载体pYZF中，构建抗CD20抗体表达载体pYZFcd20，并在大肠杆菌中进行高效可溶性分泌表达Fab’，表达量可达3mg／ml。 本研究对嵌合抗CD20 Fab’片段的体内外活性进行了进一步的研究，竞争性免疫荧光抑制试验结果显示，Fab’特异结合Daudi细胞表面CD20，MTT法测定结果表明，Fab’表达产物抑制Daudi细胞、Raji细胞的生长，IC分别为69μg／ml、26μg／ml。H掺入试验显示，嵌合抗CD20 Fab’不抑制Daudi细胞、Raji细胞DNA合成，但对RNA合成具有抑制作用。以50mg／kg剂量，四天一

关键词： 狂犬病毒   噬菌体表面呈现   人源基因工程抗体   Fab   全抗体   中和抗体   杆状病毒表 达   体外中和活性  

摘要： 狂犬病是由病毒引起的世界性人兽共患病,人和动物一旦发病100i死亡.狂犬病的暴露后预防(Postexposure Prophyaxis,PEP)主要是通过疫苗,对于严重暴露者(Ⅲ)而言,需同时注射狂犬病毒免疫球蛋白.采用单抗鸡尾酒制剂代替HRIG用于狂犬病的暴露后治疗.与抗血清相比,单抗鸡尾酒具有很多优点:重复性好,特异性强,用量少,易于标准化,能大量生产,而且病原污染的可能性降低.在该文中,首次报道了运用噬菌体抗体库技术获得人源抗犬病毒基因工程抗体Fab段基因及其表达,并首次运用杆状表达系统表达了人源狂犬病 毒全抗体.用超离纯化的狂犬病毒aG株抗原和四株狂犬病毒特异单抗的原捕捉法,筛选上述噬菌体抗体库,经过几轮筛选,最后获得20株Fab阳性克隆,并最终鉴定了三株.将以上三 单抗的基因克隆进pBluescript(ks)载体进行序列测定,将获得的序列与GeneBank库中已有 的序列进行比较,发现所获Fab序列的CDRs为新序列.G10与B2两株单抗中,G10的轻链为κ 链,B2的轻链为λ链.将单抗G10的Fab段基因亚克隆进杆状病毒表达载体,与人源Fc片段基因相连接,构建出重组表达质粒.将重组表达质粒DNA与线状杆状病毒DNA共传染sf9细胞, 通过空斑纯化,分离得表达人抗体基因的重组杆状病毒.对重组杆状病毒进行扩增,并将扩增的病毒进一步感染昆虫细胞使抗体基因得到表达.采用Protein G亲和层析的方法纯化了 表达的全抗体.

关键词： 抗KG1a细胞   表面分子   基因工程   抗原分子  

摘要： 造血是一个受高度调控、具有复杂细胞社会性行为的生理过程，造血干／祖细胞在这一过程中处于中心地位。造血干／祖细胞表面具有多种分化阶段特异性标志分子、细胞因子受体分子及粘附分子等多种细胞表面分子，在造血细胞的增殖、分化、迁移和归巢等过程中发挥重要作用。分离这些细胞表面分子及其抗体，研究它们的结构与功能作用是实验血液学的重要研究课题，对于深入理解血细胞发生、发展的生理及病理过程，发展血液系统恶性肿瘤的新型诊疗方法和生物制剂具有重要的理论价值和实际意义。本论文的目的在于寻找新的有功能的抗造血干／祖细胞表面分子的抗体，探索其功能特性，并通过所获得的抗体分离抗原分子及其基因。 首先，构建KGla细胞免疫小鼠的噬菌体展示单链抗体(scFv)文库。用具有造血干／祖细胞特征的人髓系自血病细胞系KGla细胞免疫小鼠，取其脾细胞，提取RNA，利用设计合成的用于扩增全套抗体重链可变区和轻链可变区的寡核苷酸引物，经RT-PCR扩增VH和VΚ基因，将其先后克隆入噬菌粒展示表达载体pSEX81，电穿孔转化大肠杆菌XL1-Blue，构建scFv文库;测定了文库的库容量和BstNI酶切单个克隆分析文库的多样性，并用KGla细胞作为固相抗原，对文库进行四轮吸附-洗脱-富集的初步筛选，SDS-PAGE检验筛选后文库scFv的呈示表达。结果表明文库的库容为3X10cfu，单个克隆的BstNI酶切图谱显示多样，提示文库的容量和多样性均能满足进一步筛选分离目的抗体基因的需要，且初步筛选后的文库能很好地表达外源scFv。 随之，通过采用多种细胞对scFv抗体文库进行大量筛选、分离和鉴定目标抗体。用完整的KGla细胞对以上文库进行四轮更为严格的筛选，随机挑选126个克隆进行细胞-ELISA分析噬菌体抗体与不同细胞的结合活性，所用细胞系包括KGla、Sf9、NIH-3T3、293、7402等，结果所检测的克隆均和KGla细胞有强的ELISA结合反应，其中31个克隆呈现更为特异性的结合，即仅与KGla细胞有强的结合反应，而与其

关键词： 霍乱毒素   突变体   疟疾基因工程疫苗   毒性检测   免疫佐剂  

摘要： 霍乱毒素(CT)是霍乱弧菌分泌的对人致泻的烈性肠毒素,完整的全毒素由一个A亚基(CTA)和五个B亚基(CTB)组成.为去除CT的毒性并保留其有效的免疫佐剂作用,构建一种安全、有效的免疫佐剂,该实验采用PCR体外定点突变技术和基因工程技术,将CTA结构基因的第61位和第63位丝氨酸密码子TCT,随机替换成苯丙氨酸密码子TTT,以去除CT的毒性,然后将CT突变基因与恶性疟原虫多抗原表位(AWTE)融合基因重组,构建了两种CT突变体及其与AWTE基因融合的表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达,纯化出蛋白产物,检测了其免疫原性、毒性,最后又通过动物分组实验研究了其佐剂效果,并探讨了免疫途径对其发挥佐剂的影响.该实验结果为进一步研究CT佐剂作用的机理,及其在疟疾疫苗设计中的应用打下了基础,提供了有价值的实践经验.

关键词： 乙型肝炎病毒   戴恩颗粒   基因工程疫苗   乙肝疫苗   加强接种   读者  

关键词： ctDNA   重复序列   内含子雄性不育性   叶绿体基因工程  

摘要： 叶绿体有自身的DNA。本文从叶绿体DNA(ct DNA) 分子的理化特性、ct DNA 重复序列结构、各种基因定位及内含子序列测定等方面阐述了叶绿体遗传的机理和特点,明确了叶绿体基因组有其自主复制的遗传特性,但同时需要核遗传系统提供编码信息。由于高等植物雄性不育性与ct DNA 有关;叶绿体基因工程对叶绿体遗传机制理论研究及有效改善农作物品质、加速农作物改良等方面有巨大作用。

关键词： 基因工程   育种   作物   遗传育种  

摘要： 几千年来,曾经出现过无数次由于植物病虫害流行导致粮食减产而造成的饥荒。农民一直在和病虫害及杂草进行艰苦的斗争。为使农作物免受侵害,古人只有祈求上苍的保佑。现代农民则利用科技手段杀灭害虫和杂草,如播撒杀虫剂和除草剂,或利用育种技术强化种子的抵抗力。但有些新技术的代价太高,缺点也不少。杀虫剂和除草剂的使用,会导致土壤和水源的污染,造成物种灭绝。植物基因工程技术的发展。

关键词： 啤酒酵母   育种   基因工程   酵母菌种  

摘要： 传统的遗传学方法虽在育种方面取得一定的成绩，但都存在不足之处。现代基因工程技术由于其育种具有定向性，目前已广泛应用于微生物菌种的改造与构建。利用基因工程可以在不改变啤酒酵母原有酿造特性的条件下，赋予啤酒酵母新的酿造特性。简述基因工程在啤酒酵母育种中的应用情况。

关键词： 小麦   基因工程   育种   发展  

摘要： １　小麦分子育种的国内外进展１．１　小麦遗传转化自１９８３年Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ获得世界上第一例转基因植株，１９８５年Ｈｏｒｃｈ首创叶盘法以来，分别建立了农杆菌介导法、ＰＥＧ介导法、电激穿孔法、病毒介导法、显微注射法、花粉管通道法、超声波法、基因枪法等，转基因成功的有５０多个物种共１１０多种植物。目前已形成了以农杆菌介导法和基因枪法占主导地位的两大植物转基因体系。迄今为止，媒介农杆菌法获得的转基因植物占转基因植物总数的８５％左右，主要集中在双子叶植物，但在单子叶植物上的进展却非常缓慢。到目前为止，转有农业价值基因的工作主要集中在水稻上，转其它粮食作物主要是标记基因和报告基因。小麦属于难以转化的禾本科作物之一，主要原因是农杆菌很难感染小麦愈伤组织或细胞，不能致瘤和转入Ｔｉ质粒上的Ｔ－ＤＮＡ。１９９２年以来，有关小麦转基因的报道开始增多，涉及的方法有花粉管通道法、基因枪介导法和农杆菌介导法。Ｓａｕｔｔｅｒ等最早（１９９１）利用基因枪法将ＮＰＴⅡ基因导入了小麦，１９９２年Ｖａｓｉｌ等利用基因枪法将Ｂａｒ基因导入了小麦，１９９６年成卓敏等利用花粉管通道法将ＣＰ基因导入了小麦。Ｂｌｅｃｈｌ等（１９９６）、张晓东等（１９９...

关键词： 艾滋病毒   疫苗   研制   基因工程疫苗  

摘要： 新一代的人免疫缺陷病毒-1型HIV-1候选疫苗的开发除了安全性的考虑,还必须从策略上兼顾:①区域流行的优势株;②拥有较多的抗原决定簇,并考虑人群主要组织性相容抗原(MHC)的多态性;③能诱发体液免疫和细胞免疫,而细胞免疫更为重要;④联合免疫或加强免疫;⑤剔除有负面作用的位点。本文重点简述HIV-1候选疫苗的发展策略和方向。