关键词： 基因工程抗体   微囊藻毒素   农产品   质量安全   免疫分析  

摘要： 微囊藻毒素是蓝藻水华过程中产生的一类小分子多肽生物毒素,能对人和动物的肝脏造成严重损伤,属于2B类致癌物质。由于全球性工业和生活废水的大量排放以及气候变暖等现实因素,蓝藻水华现象日趋频繁和加剧,使得微囊藻毒素在水体和土壤中大量蓄积,严重威胁生态环境和农产品质量安全。基于"抗体-抗原"识别原理的免疫学检测方法是当前生物毒素快速检测研究的热点,近年抗体创制技术突飞猛进,现已从传统的多克隆抗体和单克隆抗体逐渐发展到了新型的基因工程人工抗体创制阶段。该文系统阐述了微囊藻毒素产生的内外因素及其对生态系统、人和动物的主要危害风险;全面梳理了基因工程抗体创制技术及其在微囊藻毒素检测应用研究上的最新进展;并结合作者及所在科研团队最新研究成果,深入探讨了基因工程抗体在微囊藻毒素检测应用上的发展趋势、存在的问题以及拟解决的对策。

关键词： 基因工程抗体   融合蛋白   力达霉素   B细胞淋巴瘤   细胞周期  

摘要： [目的]探讨融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDM对B细胞淋巴瘤细胞株BJAB细胞的杀伤作用及其机制研究。[方法]利用流式细胞分析技术(FACS)和激光共聚焦显微镜技术,检测融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDM与BJAB细胞的结合活性。MTT法检测融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDM对BJAB细胞的体外杀伤活性。彗星电泳实验检测融合蛋白anti-CD19 (Fab)-LDM对BJAB细胞DNA的损伤。FACS检测不同浓度融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDM处理BJAB细胞后细胞周期的变化。[结果] FACS和激光共聚焦显微镜技术实验结果表明,融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDM能与BJAB细胞结合。MTT法实验结果表明,融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDM对BJAB细胞杀伤活性较单用力达霉素或阿霉素强,IC50值分别为(0.15±0.02)nmol/L、(0.38±0.03)nmol/L和(57.15±2.30)nmol/L。彗星电泳实验结果表明,用5pmol/L的融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDM及力达霉素处理BJAB细胞后,可引起细胞不同程度的DNA损伤,由于融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDM具有靶向性和细胞内化的特性,对DNA造成的损伤较力达霉素组明显。FACS结果显示,随着融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDM浓度的增加,S期的比例从53.78%升高至77.29%,呈剂量依赖性。[结论]融合蛋白anti-CD19 (Fab)-LDM可以靶向杀伤B细胞淋巴瘤细胞株BJAB,引起细胞周期阻滞,在B细胞淋巴瘤生物治疗中具有潜在的应用价值。

关键词： 基因工程疫苗   动物疫病   防治   应用  

摘要： 为进一步巩固与夯实动物疾病防治在现代化生物工程中的重要地位,相关工作人员不仅要做好疾病分类及分析工作,更要对基因疫苗进行不断研究与优化,有效控制病毒性疾病传播。现就基因工程疫苗在动物疾病防治中的应用进行论述。

关键词： 细粒棘球绦虫   基因工程疫苗   DNA疫苗   合成肽疫苗   免疫保护  

摘要： 细粒棘球蚴病是由细粒棘球蚴寄生引起的人兽共患寄生虫病,在全世界范围内流行,严重威胁经济发展和人民健康。犬是细粒棘球绦虫的终末宿主,牛、羊和人是细粒棘球蚴的中间宿主。目前针对棘球蚴病的药物和手术治疗效果尚不理想,疫苗作为预防和控制棘球蚴病传播的重要补充手段,研究尤为重要。本文对抗细粒棘球绦虫疫苗的研究进展进行综述,旨在为高效疫苗的进一步研制提供参考。

关键词： 寄生虫   14-3-3   基因工程疫苗   综述  

摘要： 寄生虫病是危害人和动物的重要传染病之一,疫苗是目前控制寄生虫病最为经济有效的方式。近年来,免疫学及生物工程的迅速发展极大的促进了寄生虫基因工程疫苗的研究。14-3-3蛋白是一种广泛存在于真核生物中的高度保守蛋白,已被国内外学者运用于多种寄生虫基因工程疫苗的研究。本文则对国内外寄生虫14-3-3基因工程疫苗的研究进展做一综述。

关键词： 轮状病毒   基因工程疫苗   VP4^*高聚体   中和抗体   免疫保护性  

摘要： 在前期工作中发现,截短的轮状病毒VP4~*蛋白(aa26–476)在大肠杆菌中能够以可溶形式表达,且在小鼠模型中具有较高的免疫原性和免疫保护性。本研究通过颗粒化进一步提高VP4~*蛋白的免疫保护性。通过37℃水浴加热处理24h使VP4~*蛋白多聚化,通过高效液相色谱、透射电镜、分析超离等分析VP4~*蛋白颗粒化程度,通过酶联免疫吸附试验分析颗粒化对VP4~*蛋白与中和抗体反应性的影响;通过差示量热法分析VP4~*高聚体的热稳定性;最后,通过小鼠母传抗体模型研究颗粒化对VP4~*免疫原性和免疫保护性的影响。结果表明,VP4~*蛋白高聚体结构均一,并且相比三聚体,具有更高热稳定性和中和抗体结合活性;在内毒素<20 EU/mg的条件下,与铝佐剂混合,刺激小鼠产生更高滴度的中和抗体;对轮状病毒导致的腹泻具有更高的免疫保护性。综上所述,VP4~*高聚体的研究为轮状病毒基因工程亚单位疫苗的研制提供了更广阔的思路。

关键词： 动物疫苗   应用   病毒性   公共卫生安全   畜牧养殖业   兽用生物制品   机体免疫系统   基因工程疫苗  

摘要： 疫苗是将病原微生物及其部分代谢产物,经过灭活、人工制弱或应用转基因等多种方法获得的生物制剂,主要用于预防、控制传染病的发生、流行。动物疫苗属于兽用生物制品,能刺激机体免疫系统产生有效物质抵御病原体的侵害。为养殖业提供高效、安全的动物疫苗产品,促进了行业的健康发展,保障了人类健康和公共卫生安全。随着我国经济的快速发展,人们生活水平的不断提高,畜牧养殖业也发生了空前的变化,养殖方式由粗放化逐渐向专业化、集约化转变,饲养量不断攀升,由此造成传染性疾病的发生日趋复杂化,而防控疫病流行的主要措施是接种疫苗。依据生产工艺,动物疫苗可分为:灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗。

关键词： 猪肺炎支原体   猪圆环病毒2型   杆状病毒   联苗   嵌合体蛋白  

摘要： 猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumoniae of swine,MPS)是一种慢性呼吸道传染病,也称为猪气喘病或猪地方性肺炎(swine enzootic pneumonia,EP)。猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是引起MPS的主要病原体。猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是造成猪断奶后多系统衰竭综合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原体。临床上Mhp常会与PCV2等病原体协同感染,增加相关疾病的严重性和潜在的持久性,最终导致死亡率上升。目前,防控Mhp和PCV2的主要手段是疫苗免疫。但传统的商业疫苗以灭活疫苗和弱毒疫苗为主,其普遍存在免疫原性不好、免疫反应持续时间不稳定或者毒力容易回复等缺点。而多联疫苗可实现接种一针预防多种疾病的目的,尤其在疫病长期共存的情况下,联苗将成为未来防疫的主要类型。通过基因工程方法制备的疫苗能同时表达多种疾病的抗原蛋白,达到联合疫苗的使用效果,同时也解决了常规联苗抗原组分相容性的问题。但目前可同时预防Mhp和PCV2两种病原体的二联基因工程疫苗未见报道。基于此,本研究的目的是通过昆虫杆状病毒表达系统的表面展示技术,在杆状病毒囊膜上同时表达Mhp的P97R1、P46、P42嵌合体蛋白与PCV2的Cap蛋白。并将此重组杆状病毒rvAc-P97R1P46P42-Cap作为活病毒疫苗免疫动物,初步分析其在小鼠以及仔猪上的免疫效果。为了检测蛋白表达和动物免疫效果,首先利用原核表达系统制备了 rP97R1、rP46、rP42和Cap重组蛋白,将rP97R1、rP46、rP42蛋白免疫新西兰大白兔分别制备了抗血清。通过间接ELISA分别检测了三种纯化后多抗效价,均达到1:400000以上,可供后续实验使用。然后构建了一种携带有mCherry和 EGFP双荧光标签的重组杆状病毒rvAc-P97R1P46P42-mCherry-Cap-EGFP,感染Sf9细胞后进行直接荧光观察以及间接免疫荧光、免疫电镜等实验的鉴定,证实了融合有mCherry标签的P97R1P46P42和融合有EGFP标签的Cap蛋白能表达并定位于细胞膜上,同时也能展示在杆状病毒囊膜表面。在此基础上,对含有荧光标签的重组杆状病毒载体去标签改造,得到重组杆状病毒rvAc-P97R1P46P42-Cap。将此重组杆状病毒免疫BALB/c小鼠,经间接ELISA和脾淋巴细胞增殖实验检测表明,与PBS、野生型杆状病毒rvAc-dual以及商业疫苗相比,重组杆状病毒免疫后能引发小鼠产生特异性的IgG抗体(P<0.001),脾淋巴细胞在被相应刺激原刺激后能产生显著的增殖效果(P<0.001),且免疫血清能与两种病原体的野生株发生特异性的抗原-抗体反应。由此结果可知,此重组杆状病毒免疫小鼠后能够引发小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫效应。在此基础上,重组杆状病毒免疫仔猪进一步进行验证,通过对免疫猪的血清进行ELISA检测后发现其与野生型病毒相比,同样能引发猪的机体产生显著水平的特异性抗体和细胞因子IL-4和TNF-γ(P<0.001)。说明重组杆状病毒免疫仔猪后同样能够引发特异性的体液免疫和细胞免疫效应。由此证明,重组杆状病毒rvAc-P97R 1 P46P42-Cap在小鼠和仔猪中都具有较好的免疫原性。本研究通过杆状病毒表面展示系统同时表达了 Mhp三种抗原(P97R1、P46和P42)的嵌合体蛋白和PCV2的Cap蛋白,并在小鼠和仔猪免疫实验中证实其具有较好的免疫原性,为进一步研制可同时预防Mhp和PCV2的二联基因工程疫苗奠定了基础。

关键词： 中华薄壳介   几丁质酶   RACE   重组蛋白   ELISA  

摘要： 几丁质酶作为生物指示物,常常用于农药水生生态风险评估,尤其是用于评估农药对甲壳类动物种群发育的影响。介形虫是浮游动物的重要组成部分,尤其是底栖节肢动物中最常见的物种。介形虫的种群丰度,在一定程度上,往往能够揭示出某一水域的健康状况。已有研究表明,水域中几丁质酶的含量与浮游节肢动物的种群丰度具有相关性。为了高效、便捷、专一的测量水域中介形虫几丁质酶含量,我们需要开发出能特异性识别介形虫几丁质酶的抗体。本文首先利用RT-PCR技术和RACE技术,从中华薄壳介体内克隆获得几丁质酶(Chitinase)基因的cDNA和gDNA全长序列。结果显示,中华薄壳介几丁质酶基因(DsChi)由10个外显子和9个内含子构成,开放阅读框为1821bp,编码606个氨基酸。再通过双酶切技术,将目的基因与表达载体(pET-30a(+))连接,成功构建出重组表达载体。重组表达载体转化大肠杆菌后,阳性菌株经IPTG诱导培养,表达得到了重组几丁质酶蛋白。以纯化的重组几丁质酶蛋白为免疫原,免疫新西兰白兔,成功制备了兔抗中华薄壳介重组几丁质酶抗血清,经过纯化得到了抗体球蛋白,经ELISA检测,抗体对重组几丁质酶蛋白的效价在128000以上。在抗体的特异性研究中,我们提取黑壳虾、掌肢新米虾、隆线溞、低额溞、水黾、东亚异痣蟌、羽摇蚊、中华剑水蚤、中华田螺、鲫鱼鱼苗十种生物体内粗酶液进行了交叉反应,结果显示该抗体能较好的识别介形虫体内的几丁质酶液,并且与其它生物交叉反应都在20%以下。因此本文制备的兔抗介形虫多克隆抗体可以应用于水体检测介形虫种群变化,研究结果为利用几丁质酶鉴定农药水生危害提供了一种较新的方法。

关键词： 洛蒙德链霉菌   洛蒙真菌素   高通量筛选   复合诱变   基因工程  

摘要： 洛蒙德链霉菌S015(Streptomyces lomondensis S015)能够生物合成吩嗪类化合物洛蒙真菌素(Lomofungin)。而洛蒙真菌素是一种广谱抗生素,能够抗细菌、真菌及肿瘤,因此在很多领域都有其应用价值。由于S015菌株的洛蒙真菌素产量较低,难以满足研究和生产的要求,因此本论文从S015菌株出发,通过建立高通量筛选方法,复合诱变筛选及基因工程改造来构建其高产菌株。本论文根据洛蒙真菌素的2-丁酮溶液在紫外波长375 nm处有一个特征吸收峰的现象,确定了375 nm是能用来检测酸性的2-丁酮溶液中的洛蒙真菌素的一个特征波长。并且验证了溶液中洛蒙真菌素浓度和其A值呈良好的正相关关系。所以将洛蒙德链霉菌的发酵液通过2-丁酮萃取等处理后的上层有机相的A值作为快速判断其洛蒙真菌素含量的标志,同时结合利用24孔深孔板培养和酶标仪能同时对大量样本进行分析检测的优点,成功建立了高通量筛选高产洛蒙真菌素菌株的方法。随后利用该高通量筛选方法,从S015菌株出发,进行了6轮ARTP和紫外诱变交替的复合诱变育种,累计筛选了4,320株突变株,最终获得了高产菌株M6,其洛蒙真菌素产量为61.33 mg/L,是出发菌株S015的7.35倍,并且具有良好的遗传稳定性。将M6菌株与出发菌株S015进行对比,虽然两者在菌落形态上没有明显差异,但是M6菌株的细胞生长更为旺盛。在摇瓶发酵的过程中,M6菌株的细胞干重最大可达12.49 g/L,是S015菌株的2.21倍。获得高产菌M6后,将其洛蒙真菌素的前体分支酸的消耗途径中的trpE1、trpE2基因进行双敲除,洛蒙真菌素产量提升为81.89mg/L。在M6ΔtrpE1ΔtrpE2的基础上,过表达了全局调控基因afsR,使产量达到109.53 mg/L,比双敲株提升了33.75%,是野生型S015的13.13倍。之后还分别过表达了与洛蒙真菌素的前体分支酸的合成途径相关的8个基因,并对其中的aroB1、aroB2、aroK1和aroK2基因进行了组合过表达,但对产量的提升效果都不明显。最后,针对M6ΔtrpE1ΔtrpE2::afsR菌株,将其培养基中麦芽提取物浓度优化为14 g/L,并添加大豆油至1.5%,添加Fe离子至0.08 mmol/L,使其洛蒙真菌素最终产量为212.68 mg/L,是野生型S015菌株产量的25.50倍。本论文将突变菌株高通量筛选方法建立和不同诱变育种手段复合及基因工程改造相结合来提高目标产物产量,取得了良好的高产菌株筛选效果,可为其他抗生素及次级代谢产物的生产菌株筛选提供良好的借鉴。