关键词： 非洲猪瘟病毒(ASFV)   细胞凋亡   自噬   免疫应答   基因工程疫苗  

摘要： 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起家猪的一种急性、出血性、高度接触性蜱传病毒病,可致家猪网状内皮系统出血及高死亡率,是危害世界养猪业健康发展最严重的传染病之一。ASFV是一种大型的DNA病毒,结构复杂,其基因组编码大量蛋白。该论文介绍了ASFV的特性,免疫应答机制如免疫逃逸、体液免疫和细胞免疫,以及基因工程疫苗如减毒活疫苗、亚单位疫苗、病毒载体活疫苗及DNA疫苗研究的最新进展,并对中国ASF的疫苗研制、防控进行了展望。

关键词： 犬细小病毒(CPV)   基因工程抗体   共转染   HEK-293F细胞  

摘要： 本研究旨在利用HEK-293细胞系制备鼠源犬细小病毒(canine parovirus,CPV)基因工程抗体并检测其生物活性。通过抗体亚型检测试剂盒检测CPV单克隆抗体亚型;采用间接ELISA检测CPV单克隆抗体的亲和力和特异性;经RACE-PCR获得CPV单克隆抗体的可变区序列,将可变区序列与鼠源抗体恒定区序列连接;分别构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-L和pcDNA3.1(+)-H,将载体共转染HEK-293细胞,采用血凝抑制与中和试验的方法检测鼠源CPV基因工程抗体生物活性;采用HEK-293F细胞悬浮表达并用间接ELISA方法检测鼠源CPV基因工程抗体的表达量;用Protein A亲和层析柱纯化鼠源CPV基因工程抗体后进行SDS-PAGE鉴定;间接免疫荧光检测纯化后鼠源CPV基因工程抗体的活性。结果显示,CPV单克隆抗体亚型为IgG 2b,亲和力常数6个Ka平均值为1.02×10^11 L/mol,只与CPV VLPs发生反应。琼脂糖凝胶电泳结果显示,试验成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-L和pcDNA3.1(+)-H;HEK-293和HEK-293F细胞培养上清液血抑效价分别为1∶2^4和1∶2^6,中和试验结果显示,HEK-293和HEK-293F细胞培养上清液中和效价分别为1∶152和1∶1 290;鼠源CPV基因工程抗体在HEK-293F细胞中的表达量为5.97 mg/L,SDS-PAGE分析在55和25 ku处出现条带,表明鼠源CPV基因工程抗体成功在HEK-293F细胞中表达并纯化。间接免疫荧光检测结果表明,纯化后鼠源CPV基因工程抗体具有良好的生物活性。本研究在HEK-293F细胞中成功表达具有中和活性、纯度较高的鼠源CPV基因工程抗体,为今后CPV基因工程抗体药物的研发奠定基础。

关键词： 纳他霉素   自然分离   诱变选育   原生质体育种   基因工程育种  

摘要： 纳他霉素生产中菌种选育的方法主要有自然分离、诱变育种、原生质体育种、基因工程育种等。在生产单位中运用最多的诱变育种。

关键词： 人源化抗体   小分子抗体   抗体融合蛋白  

摘要： 随着基因工程技术的发展和对抗体基因结构的深入研究,开发了第三代抗体—基因工程抗体,被广泛用于疾病的临床诊断、治疗和预防等领域。主要介绍基因工程抗体药物的研究进展。

关键词： 狂犬病病毒   G蛋白   口服疫苗   减毒沙门氏菌  

摘要： 中国的狂犬病主要由农村家犬通过咬伤传染所致,为了研制高效实用的家犬用狂犬病口服基因工程疫苗,本研究把狂犬病病毒G蛋白基因插入真核表达质粒pIRESneo,构建重组表达质粒pIRESneo-G,转化入鼠伤寒减毒沙门氏菌SL3261,构建重组口服疫苗SL3261-pIRESneo-G。通过口服免疫小鼠,检测免疫血清中和抗体水平及其病毒保护效果。结果显示,经小鼠口服免疫接种一次后第三周能产生高水平的中和抗体水平,达到WHO要求的0.5IU/mL;免疫小鼠经肌肉注射100LD50/0.03mL的野毒株GX074后获56%保护效果。

关键词： 猪流行性腹泻病毒   S1蛋白   昆虫杆状病毒表达系统   免疫原性   基因工程疫苗  

摘要： [目的]在昆虫细胞中表达猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S1 NTD蛋白,研究其免疫原性,为基于PEDV S蛋白的基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础.[方法]PCR扩增PEDV S1-NTD基因,构建其重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD和重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD.将Ac-PEDV S1-NTD转染sf9昆虫细胞,利用昆虫杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD.将P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,Western blot鉴定重组蛋白的表达,空斑试验测定重组杆状病毒的滴度.在此基础上,分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.1,1和3的P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,并在感染后1,2,3,4和5d收集细胞,通过Western blot和空斑试验分别检测目的蛋白的表达量和重组杆状病毒的增殖情况.将MOI为0.1的P3代重组杆状病毒皮下注射免疫BALB/c小鼠,每隔2周免疫1次,共免疫3次,以注射PBS、空载体Bacmid和PEDV商业疫苗为对照组,于首免后不同时间采集血液分离其血清,ELISA法检测血清中PEDV特异性抗体的水平;于首免后35 d剖取小鼠脾脏,分离其淋巴细胞;PEDV刺激后,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖情况.[结果]PCR扩增获得了约738 bp的PEDV S1-NTD基因;成功构建了重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD、重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD和重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD.利用杆状病毒表达系统在sf9细胞内成功表达了重组PEDVS1-NTD蛋白,且杆状病毒以MOI为1感染sf 9细胞后在第3天蛋白表达量达到最高.在首免后35 d,重组杆状病毒免疫组小鼠血清效价达到最高值,为1∶5 000,与商业疫苗组效价一致;淋巴细胞增殖试验表明,重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD免疫组小鼠脾淋巴细胞对PEDV的刺激也发生了显著增殖(P<0.05),而PBS和空载体Bacmid对照组淋巴细胞未发生明显增殖(P>0.05).[结论]成功构建了重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD,在昆虫细胞中成功表达了PEDV S1-NTD蛋白,且具有较好的免疫原性.

关键词： 基因编辑   基因工程   遗传改良   羊  

摘要： 基因工程技术可以改造生物的基因组,实现基因的删除、替换或插入.羊作为草食家畜的代表,在基因工程领域发挥着引领作用.1984年世界首例试管羊诞生;1997年世界上首例克隆羊降临,揭开了哺乳动物体细胞克隆的序幕;2006年世界首例转基因羊生产“抗凝血酶III”在欧洲上市,打开了转基因动物产品实现产业化的大门.羊作为适用于生物工程操作的大家畜,必将在基因工程领域的基础理论研究、新品种培育和人类疾病治疗等方面发挥不可替代的作用.

关键词： 乙型脑炎病毒   灭活疫苗   活疫苗   猪   病毒样颗粒   基因工程疫苗  

摘要： 猪乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)是由乙型脑炎病毒(JEV)引起的一种经蚊虫传播的人畜共患病,且是严重威胁人畜健康的一种中枢神经系统的急性传染病。猪是JEV的重要储存宿主和扩增宿主,同时也是乙型脑炎的主要传染源,可引起母猪繁殖障碍和公猪睾丸炎。人是JEV的终末宿主,特别是儿童,感染发病后,死亡率可达25%。目前,仍无有效药物治疗乙型脑炎感染,而其流行区域的扩大及其优势基因型的改变为JEV防控策略带来了新的挑战。近年来,随着基因工程和蛋白质工程的发展,以及对病毒分子结构和功能的深入研究,一些新技术新手段被应用到JEV疫苗研发中,基因工程亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗、嵌合病毒减毒活疫苗、多表位疫苗、DNA疫苗等应运而生。在疫苗制备过程中,培养工艺的优化、病毒抗原的纯化、新型佐剂和耐热保护剂的应用等生产工艺的提升策略,为保障JEV疫苗的质量提供了新方向。文章简述了猪JEV疫苗的使用现状及研发进展,旨在为研制更安全、有效的猪JEV疫苗提供参考依据。

关键词： 鸡传染性喉气管炎   防制现状   疫苗使用误区   基因工程疫苗  

摘要： 鸡传染性喉气管炎是危害现代养鸡业的一种重要的病毒性传染病。生产实际中对于本病的防制存在一些问题,例如不重视生物安全及饲养管理,对于疫苗的使用及防疫过程存在诸多误区,从而造成了其在一些区域发病增加或呈地方流行,给鸡群造成较大损失。采用综合防制措施,即在加强生物安全和饲养管理的基础上,注重疫苗的科学选择以及合理防疫,可对鸡传染性喉气管炎起到较好的防控效果;鸡传染性喉气管炎活疫苗仅限疫区使用,经点眼途径免疫一羽份即可产生良好的免疫反应。对于疫情重灾区,免疫两次活疫苗可产生较好的临床保护效果。

关键词： 基因工程技术   玉米育种  

摘要： 玉米是一种重要的粮食作物,也是一种经过基因改造的作物。1983年,随着世界上第一批转基因烟草的成功种植,转基因玉米在世界范围内得到了研究。目前,已建立了比较完整的玉米转基因理论和技术体系,包括:农杆菌Ti质粒介导的载体转化技术,基因枪和PEG直接将DNA引入玉米,花粉管通路和卵巢转化技术。