关键词： 牛病毒性腹泻病毒   E0蛋白   间接ELISA方法   基因工程疫苗   免疫检测  

摘要： 牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea, BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)引起的急性或持续性感染的疾病，该病由排泄物(唾液、尿液、粪便)以及直接接触进行水平传播，或由妊娠母牛通过胎盘感染犊牛进行垂直传播。该病可诱发多种临床症状，如发热、腹泻、流产、产奶量下降、呼吸系统疾病、繁殖障碍等。持续性感染牛(Persistant infection, PI)是该病的主要传染源，由于病畜机体产生免疫抑制，在群体中终生排毒，给世界养殖业带来了严重的危害。E0蛋白是BVDV特有的保护性抗原，其抗原多样性较低，能够刺激机体产生特异性中和抗体，因此在基因工程疫苗和免疫检测中得到了广泛应用。　　本实验将克隆得到的BVDVE0基因插入到pET-32a表达载体上，将经鉴定的阳性质粒转化到***(DE3)感受态细胞中，通过IPTG诱导表达获得BVDVE0蛋白，将经镍柱纯化的E0蛋白进行WesternBlot鉴定，结果显示诱导表达的重组E0蛋白与BVDV阳性血清可结合，具有反应原性。　　以重组BVDVE0蛋白为包被抗原建立间接ELISA方法，通过对反应条件进行优化，确定了抗原稀释浓度为1∶160、血清稀释浓度为1∶150、1.5%BSA封闭2h、酶标二抗稀释倍数为1∶3200孵育45min、底物作用时间为10min，并确定临界值为0.241。该方法具有良好的重复性、特异性和敏感性;与商业化试剂盒进行比较，总符合率为85.3%，说明该方法具有一定的准确性;同时应用该方法对吉林省四个地区的216份血清样本进行检测，阳性率为33.7%。　　本实验诱导表达纯化BVDV重组E0蛋白所以建立的ELISA方法可用于临床样品的检测。

关键词： NDV   F蛋白   HN蛋白   基因工程疫苗   杆状病毒表达系统  

摘要： 新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的鸡和多种禽类发病的急性、高度接触性传染病,是世界范围内危害最严重的禽类传染病之一。目前对于ND的防控主要依赖于疫苗接种,但在长期的免疫压力下,新基因型不断出现导致免疫失败和非典型性ND发生,表明了目前使用的疫苗仍需进一步改善。此外,常规疫苗还存在效能低、安全性差等问题,因此亟需研制针对当前流行毒株的新型ND疫苗。本研究使用我国主要流行毒株NDV基因Ⅶ型毒株作为疫苗株,利用昆虫杆状病毒表达系统表达了NDV的F蛋白和HN蛋白,制备了新城疫基因工程亚单位疫苗,并对其免疫效果进行了初步探究。本研究将NDV基因Ⅶ型毒株r GM的F及HN基因插入p Fast Bac1转递质粒,通过Bac-to-Bac表达系统获得了重组杆状病毒BV-F及BV-HN。利用间接免疫荧光试验和Western blot对表达的F及HN蛋白进行了检测和鉴定。间接免疫荧光试验结果表明表达的F及HN蛋白可以被NDV多克隆抗体及His-Tag标签抗体特异性识别;Western blot检测结果显示F蛋白可在昆虫细胞中成功表达并被部分裂解,可检测到大小约为60 k Da和50 k Da的条带;HN蛋白成功表达,可检测到大小约为63 k Da的条带。基于HN蛋白具有凝集红细胞的活性,对表达的HN蛋白进行血凝试验,结果显示HN蛋白血凝效价为2。为评估表达的F及HN蛋白的免疫原性,将成功表达的F及HN蛋白与佐剂MONTANIDETMISA 71 R VG按照4:6的比例混合后制备成亚单位疫苗。使用14日龄SPF鸡进行免疫攻毒试验,初步评估了该疫苗的免疫效果。免疫试验结果显示,F和HN蛋白亚单位疫苗在免疫后28天内HI抗体持续增长,其平均HI效价为4.625 log,平均中和抗体为4.5 log。而单独免疫F蛋白疫苗或单独免疫HN蛋白疫苗的SPF鸡,免疫后刺激机体产生的抗体水平较低。在二免后第15 d使用同源毒株以10EID/100μL进行攻毒试验,攻毒后连续14天观察各组SPF鸡的健康状况,并采集咽喉拭子和泄殖腔拭子检测排毒情况。攻毒试验结果表明,F和HN蛋白亚单位疫苗对SPF鸡有100%的保护效果。拭子排毒检测显示,仅在第3 d发现咽喉拭子有带毒情况。单独免疫F蛋白或HN蛋白疫苗的SPF鸡攻毒保护率均为80%,拭子排毒检测显示两组鸡均可排毒至第7 d。综上所述,本研究利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达了NDV F及HN蛋白,制备的NDV F和HN蛋白亚单位疫苗可对免疫鸡产生完全保护并有效减少排毒,为ND基因工程疫苗的研制提供了新思路,具有潜在的应用价值。

关键词： 微囊藻毒素   噬菌体抗体库   基因工程抗体   链置换技术   定点突变   可溶性表达   免疫分析  

摘要： 蓝藻产生的微囊藻毒素(MCs)是一类小分子生物毒素,可造成水体、土壤环境以及农产品和食品的污染。已报道的MCs超过200种,其中MC-LR亚型毒性最强、危害最普遍,属2B类致癌物,世界卫生组织规定其在饮用水中的最大残留限量为1.0μg/L。探寻MCs快速高灵敏监测方法,一直是业内探索的热点。本研究借助噬菌体展示抗体库,以及抗体高通量筛选与特性修饰等技术手段,用多种渠道研制了具有MC-LR高灵敏结合能力的异源基因工程抗体(GEAb),并建立了相应免疫学分析方法用于其快速高灵敏检测,具体研究的内容如下:(一)MC-LR驼源纳米抗体筛选与应用。将MC-LR偶联到KLH和BSA上,形成MC-LR-KLH和MC-LR-BSA复合物,分别作为富集和筛选的包被抗原,经4轮富集淘筛,从驼源噬菌体纳米抗体库中获得20个阳性克隆。阳性反应最强的ANAb12,ANAb9和ANAb7基因被克隆到p ET26b(+)载体上,并导入*** BL21中进行可溶性表达。以获得的ANAb12,ANAb9和ANAb7纳米抗体蛋白建立IC-ELISAs测定MC-LR,结果显示,它们的最低检出限分别达到0.06,0.08和0.12μg/L;经MC-LR同系物交叉反应分析,3个纳米抗体对MC-RR,MC-YR和MC-WR均具有较强识别能力,交叉反应率达到82.7%～116.9%。上述IC-ELISAs对MC-LR在自来水中的添加回收测试,回收率为84.0%～106.5%,变异系数为3.4%～10.6%,表明检测方法具有良好的精确性和稳定性。(二)MC-LR免疫兔源抗体库构建及其sc Fv筛选与应用。以MC-LR-KLH为免疫原,经5轮免疫,供试兔血清滴度达到1:2500000。以兔脾脏总RNA反转录的c DNA为模板,设计特异性引物分别扩V、V基因进而拼接成为sc Fv基因,经克隆到p IT2噬菌粒载体上并转入*** TG1中,成功构建库容量为3.26×10 cfu/m L的MC-LR免疫兔源噬菌体sc Fv库。以MC-LR-BSA为包被抗原,经4轮富集淘筛,从库中获得18个阳性克隆。将阳性反应最强的Rsc Fv3基因导入*** HB2151中进行可溶性表达制备其sc Fv蛋白。以获得的MC-LR p Abs和MC-LR Rsc Fv3-sc Fv蛋白建立IC-ELISAs测定MC-LR,结果显示,它们的最低检出限分别达到0.03和0.05μg/L;经MC-LR同系物交叉反应分析,两种抗体对MC-RR,MC-WR和MC-YR均具有较强识别能力,交叉反应率达到56%～136%。以MC-LR Rsc Fv3-sc Fv蛋白建立的IC-ELISA对MC-LR在自来水、瓶装饮用水和湖水样品中的添加回收测试,回收率为86.8%～106%,变异系数为1.8%～10.8%,表明检测方法具有良好的精确性和稳定性。(三)MC-LR免疫鼠源抗体库构建及其sc Fv筛选与应用。以MC-LR-BSA为免疫原,经5轮免疫,供试小鼠血清滴度达到1:3600000。以鼠脾脏总RNA反转录的c DNA为模板,设计特异性引物分别扩增V、V基因进而拼接成为sc Fv基因,经克隆到p IT2噬菌粒载体上并转入*** TG1中,成功构建库容量为8.67×10 cfu/m L的MC-LR免疫鼠源噬菌体抗体库。以MC-LR-KLH为包被抗原,经4轮富集淘筛,从库中获得16个阳性克隆。将阳性反应最强的Msc Fv7基因导入*** HB2151中进行可溶性表达制备其Msc Fv-sc Fv蛋白。以Msc Fv7-sc Fv蛋白建立IC-ELISA检测MC-LR,结果显示,它的最低检出限达到0.044μg/L;经MC-LR同系物交叉反应分析,其对MC-RR和MC-YR均具有较强识别能力,交叉反应率分别为85.9%和93.1%。该IC-ELISA对MC-LR在自来水、瓶装饮用水和湖水样品中的添加回收测试,回收率为81.2%～106.3%,变异系数为2.62%～10.22%,表明检测方法具有良好的精确性和稳定性。(四)MC-LR AV-MV重组及其活性修饰与应用。为了获得结合活性和热稳定性更高的MC-LR GEAb,以ANAb12和Msc Fv7为模板,借助链置换技术,将两者重链区域(V)拼接形成AV-MV重组抗体,经ELISA测定,其对MC-LR的结合活性和热稳定性分别比ANAb12和Msc Fv7均有所提高。为了进一步改进AV-MV的抗原结合活性,对其MV-CDR3区域进行了定点突变,成功构建库容量为8.99×10 cfu/m L的噬菌体展示AV-MV突变抗体库。以MC-LR-KLH为包被抗原,经3轮富集淘筛,从突变库中获得15个阳性突变克隆,其中5个反应值高于原初AV-MV。将阳性反应

关键词： 水稻育种   基因工程育种   矮化育种   基因工程技术   田间试验   杂交水稻   绿色革命   粮食安全  

摘要： 水稻是我国主要的粮食作物,水稻的产量将会对我国的粮食安全以及社会经济的发展等产生至关重要的影响.水稻育种的质量将会直接影响到水稻的品质与水稻的产量,例如,矮化育种带来了绿色革命,杂交水稻的开发等,这些都是通过水稻育种所带来的巨大优势.随着水稻育种技术的不断完善,育种的进步变得更加困难,在此背景下,基因工程技术在水稻育种中的应用为人们提供了新的途径,通过基因工程技术,能推动育种的进步,目前,世界范围内进入田间试验的转基因植物已经超过的500种,这些都是基因工程技术所带来的优势,推动了基因工程育种的发展.

摘要： 6月16日,中国科学院上海巴斯德研究所与江苏中慧元通生物科技有限公司（简称'江苏中慧元通生物'）就新冠病毒肺炎（COVID-19）基因工程疫苗（毕赤酵母）在全球范围内的研发、生产和商业转化签署合作协议。根据协议,上海巴斯德所疫苗学与抗病毒策略研究团队将与江苏中慧元通生物项目团队联合攻关,发挥上海巴斯德所的疫苗创新优势和江苏中慧元通生物的疫苗

关键词： 鸡传染性喉气管炎   防制现状   疫苗使用误区   基因工程疫苗  

摘要： 鸡传染性喉气管炎是危害现代养鸡业的一种重要的病毒性传染病,生产实际中对于该病的防制存在一些问题,例如不重视生物安全及饲养管理,对于疫苗的使用及防疫过程也存在诸多误区,从而造成了其在一些区域发病增加或呈地方性流行,造成较大损失.采用综合防制措施,即在加强生物安全和饲养管理的基础上,注重疫苗的科学选择和合理防疫,可对鸡传染性喉气管炎起到较好的防控效果;鸡传染性喉气管炎活疫苗仅限疫区使用,经点眼途径免疫1羽份/羽即可产生良好的免疫反应.对于疫情重灾区,免疫两次活疫苗可产生较好的临床保护效果.

关键词： 多目标优化   核心专利挖掘   超体积函数   基因工程疫苗  

摘要： 专利是技术信息最有效的载体,挖掘核心专利可以为组织机构以及个体的创新实践活动提供更加高效的背景技术支撑,对把握某领域技术发展水平,推动技术进步具有重要意义。本文对当前核心专利识别的研究现状进行调研分析,并在前人研究的基础上提出基于多目标优化方法的核心专利挖掘模式,选取基因工程疫苗领域的专利数据进行了实证分析。本文筛选了9项专利指标作为对象并归类到专利技术价值、经济价值、法律价值三个目标下,基于此运用超体积函数进行测度,最终识别出200项核心专利,为全面了解该领域的技术发展现状以及当前的核心专利识别研究提供方法借鉴。

关键词： 发酵工程   基因工程育种   土壤微生物学   研究与开发   微生物育种   细胞工程   微生物生态学   微生物菌种  

摘要： 该实验室1991年12月组建,从事发酵工程、酶工程、细胞工程、基因工程、食用菌、农业微生物育种和免疫领域的研究与开发,主要研究学科有微生物、植物的基因工程育种、微生物菌种资源学、微生物的基因工程育种、发酵工程、生物防治、微生物肥料学、土壤微生物学、微生物生态学免疫微生物和保健功能食品等。

关键词： 花青素苷   转基因   分子育种  

摘要： 蓝色花观赏价值高,花色成因复杂。目前,在蓝色花色形成机理和基因工程育种研究方面取得了大量的研究进展。综述了蓝色花形成的化学、生理学和分子生物学机理,利用基因工程技术培育蓝色花的育种实践:包括转入花青素苷合成途径上的关键酶基因,抑制内源竞争酶基因,转入液泡pH值调节基因和金属离子转运蛋白基因等。在此基础上总结出几种蓝色花基因工程育种的基本策略,以期为蓝色花基因工程育种提供参考。

关键词： 基因工程   疫苗   动物疫病   疾病防治   应用设施  

摘要： 随着我国环境污染问题日益严重,动物在生存过程中面临的疾病威胁日益增多。为有效预防动物疫病,人们为动物的生存提供了健康环境。研究人员利用现代先进的生物学方法提高了疫苗的稳定性和安全性。