关键词： 大肠杆菌   基因工程疫苗   重组蛋白   戊型肝炎疫苗   人乳头瘤病毒疫苗   脑膜炎球菌疫苗  

摘要： 大肠杆菌具有生长快速、培养成本低、遗传背景清楚等特点,已被广泛地应用于重组蛋白类药物的表达和生产。近年来,几种基于大肠杆菌表达的基因工程疫苗已投入市场(戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、脑膜炎球菌疫苗等)或进入临床研究(流感A型疫苗、疟疾疫苗、炭疽疫苗等),显示了大肠杆菌表达系统在疫苗研发中良好的应用前景。本文综述了大肠杆菌原核表达系统在基因工程疫苗研究中的应用与策略优化,包括已上市或进入临床疫苗的概述、大肠杆菌表达系统用于疫苗生产的可优化策略(二硫键形成、糖基化以及内毒素去除等),为大肠杆菌重组表达策略改进和基因工程疫苗的研发提供参考。

关键词： 科学突破   结构熵   社区识别   链路预测   基因工程疫苗  

摘要： 创新发展是世界各经济体的战略发展要点。创新意味着范式的改变、劳动力的解放、生产效率的提高,进而实现社会经济、文化和技术的全面进步。从各国家地区的战略部署来看,突破性创新是部署的重点,其蕴含巨大的经济、科研和国家战略价值。突破性创新作为创新这一概念的下位类,具有非线性、创新性和影响力等多种特征。且特征量化难度大,因此识别和预测的难度较大。如果能对突破性创新进行识别和预测,可以先一步进行科研资金的优化配置、科研人员的合理调度和科研资源的重点投入,率先取得重点领域的科学突破和完成技术转型变革,占领技术高地。科学论文作为科学创新的重要载体,是突破性创新研究的重要数据来源。通过对科学论文的内容解读识别突破性创新,有助于深入了解突破性创新的发展规律和特点,对于后续研究的开展和管理决策的制定有重要作用。当前,已有研究对于突破性创新的测度大多从创新性、新颖性或者学科交叉性等较为单一的维度开展,也就是大多以某一个具体特征作为突破口进行测度,这就忽略了知识发展是一个整体动态发展这一基本特征,突破性创新的出现是依据每个知识单元之间的连接共同作用下的结果。本研究以科学论文作为主要的研究对象,没有将技术内容考虑在内,是以科学突破主题为研究对象,针对的是领域级别的科学研究,尝试对这类主题进行识别与预测。主要以主题词共现网络作为知识网络的代项,以科学突破主题会对知识网络整体状态造成“影响”作为突破口进行识别和预测。而其中网络状态的变化就是通过“结构熵”进行测度。因此构建了一套基于熵值的领域科学突破主题识别与预测方法。从而能从知识网络整体发展的视角识别科学突破。该项研究能补充当前突破性创新研究的理论研究,并具备一定的现实应用意义。本研究主要内容主要包括以下三个方面:首先,对创新领域内涵较为接近的几个概念从定性和定量两个维度进行了辨析,梳理了当前已有研究提出的突破性创新所应该具备的特征和识别方法的不足,最后明确了在识别突破性创新时需要重点关注的特征,为后续本研究提出的方法模型体系提供了理论支撑。之后,提出了基于熵值识别和预测科学突破的方法体系。熵值即是知识网络状态测度的指标。首先是就结构熵与知识网络状态之间的关系进行阐述,再梳理已有的结构熵构建方法,归并其优缺点,在既考虑知识网络的组成“节点”和“边”,又考虑知识发展特征“非广延性”的基础上,构建本研究的结构熵指标。之后从网络动态发展（结构熵发生改变的重要时间点）、识别重要主题（对网络结构熵影响较大的社区）和识别重要节点（对网络结构熵影响较大的节点和网络结构熵影响力发生突变的节点）等三方面对科学突破展开识别和预测。最后,在实证阶段是以“基因工程疫苗”领域的科学论文作为研究对象开展。在识别阶段主要是从结构熵的三方面开展,同时在识别阶段还与现有的新兴主题识别和突变主题识别结果进行了比对。预测阶段首先是通过链路预测方法构建预测的新网络,再从重要主题和重要主题词两方面进行科学突破的筛选。最后通过专家评估方法的有效性。实证结果证明,本文所提出的基于熵值的科学突破的识别和预测方法在基因工程疫苗领域有一定的应用价值,在知识体量越发巨大的今天,能在一定程度上对领域科学突破进行识别和预测,减轻人力筛选的负担,更快速高效地实现探测。本文包括图20幅,表格26个。

关键词： 犬细小病毒   单链抗体   原核表达   中和活性   临床治疗  

摘要： 犬细小病毒疾病是由细小病毒科成员犬细小病毒(CPV)感染引起的,是一种高危险性、高接触性、呈急性发病的烈性传染病。该病传染性强和死亡率高的特点给我国犬类及宠物饲养业造成了极大的经济损失和影响。目前应用于临床治疗的抗犬细小病毒单克隆抗体都是鼠源的,应用于犬体治疗时存在被免疫系统识别产生犬抗鼠抗体,很快被清除等问题;另一方面,单克隆抗体基因容易在较长的传代过程中丢失,且在真核细胞中获得抗体的方法成本很高。因此,近年来单链抗体(scFv)由于其免疫原性弱,相较简单和低成本的制备工艺而发展为目前研究最多的基因工程抗体之一。为了获得成本低且具有治疗效果的scFv,减小犬细小病毒病的临床治疗压力,本研究旨在利用大肠杆菌表达系统制备抗CPV的scFv,检测其生物活性并进行初步应用。方法为以实验室前期制备获得的,可以分泌具有中和活性的抗CPV VP2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株为基础,提取该杂交瘤细胞的总RNA,反转录合成cDNA链,以此为模板扩增并获得了抗体的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因;将可变区基因连接至原核表达载体pOPE101,成功构建重组质粒pOPE-scFv;测序结果与抗体基因数据库比对,获得了抗体可变区序列,VH基因大小为387bp,VL基因大小为393bp。重组质粒转化XL1-blue感受态细胞经IPTG诱导表达,经SD S-PAGE和Western blot验证分析蛋白大小约为35ku,与预期结果相符。为了提高scFv的表达量,构建了同时表达抗体可变区基因、Erv1基因以及DsbC基因的重组质粒pET23b-GB,经转化Rosetta感受态细胞诱导表达,SDS-PAGE和Western blot结果表明scFv表达量得到明显提高且可以被抗His标签抗体识别。利用His标签树脂亲和层析纯化scFv浓度为1.120mg/mL;经酶联免疫吸附试验(ELISA)结果表明原核表达的scFv可与VP2蛋白抗原结合活性;经间接免疫荧光实验表明scFv可与CPV和FPV特异性结合;经微量细胞中和实验证明scFv保留了中和CPV和FPV的活性,对CPV的中和效价为1:40(0.028mg/mL),对FPV中和效价为1:20(0.056mg/mL)。建立感染CPV动物模型,发病犬在连续注射scFv 3天后恢复健康,证明原核表达的scF v可以对感染CPV的犬产生治疗保护效果。本研究获得了抗CPV VP2蛋白抗体的可变区序列,在实现原核表达的基础上提升了其表达量,经以上研究结果表明本研究制备的scFv具有治疗犬细小病毒病的应用前景。

关键词： 神经坏死病毒   反向遗传操作系统   B2蛋白   基因工程疫苗   环路示踪  

摘要： 神经坏死病毒（nervous necrosis virus,NNV）属于Betanodavirus病毒属,引起鱼类的病毒性神经坏死（viral nervous necrosis,VNN）,主要侵蚀鱼类的中枢神经系统,使受感染部位出现细胞空泡化病变。神经坏死病毒在全球范围内造成了幼鱼和成年鱼类的高致病率和高死亡率,极大地影响了海水以及淡水水产养殖业的发展。NNV为无包膜的单链正义双节段RNA病毒,包含基因组RNA1和RNA2以及转录产生的亚基因组RNA3分别编码RNA依赖的RNA聚合酶、衣壳蛋白以及B2蛋白。目前市场上针对神经坏死病毒感染多以预防为主,在水平以及垂直层面进行消毒控制病毒传播和感染,而针对神经坏死病毒的疫苗的研究较少,且主要以灭活疫苗以及衣壳蛋白等构建的亚单位疫苗为主,存在着保护力不够、使用需伴有佐剂等弊端。因此本课题拟对神经坏死病毒进行减毒改造,为后续疫苗的研究提供一种新思路。1、首先构建了一套反向遗传操作系统用于神经坏死病毒的体外拯救,以便于后续的遗传操作实验。本实验基于三套不同启动子策略的NNV包装质粒,摸索了四种不同的拯救方案（T7原核启动子转染B7GG细胞并与SSN-1细胞共培养、CMV真核启动子转染293T细胞、T7原核与CMV真核双启动子转染293T与B7GG混合培养细胞、T7原核启动子转染B7GG细胞）,最终成功建立了一套适合于神经坏死病毒的拯救系统（T7原核启动子转染B7GG细胞）。2、利用建立的反向遗传操作系统对神经坏死病毒B2蛋白进行突变构建NNV病毒致弱毒株,并体外拯救出神经坏死病毒B2蛋白突变株病毒。对B2蛋白突变株病毒进行了病毒增殖曲线的测定,拯救的未突变病毒以及B2蛋白突变株病毒的增殖速度相比于NNV野生毒株更为缓慢,但病毒增殖能力有所降低;在对细胞毒性蛋白Endo-G和抗病毒通路相关蛋白Mx1的荧光定量检测中,拯救的未突变病毒和B2蛋白突变株病毒引起的两种蛋白表达均远低于野生毒株。同时在B2蛋白突变株病毒感染斑马鱼在体实验中,B2蛋白突变株病毒引起的C反应蛋白以及肿瘤坏死因子的表达水平较野生毒株相比降低,同时在转基因斑马鱼在体注射实验中,脑部空洞化病变程度减弱。因此,构建的NNV病毒B2蛋白突变株毒力减弱,有助于后续基于B2蛋白突变株病毒的基因工程疫苗开发。3、另外,根据神经坏死病毒对神经系统的高度嗜性,对病毒的RNA1区段进行改造,在3’端添加了具有神经环路标记功能的标签,以此来尝试将神经坏死病毒开发成鱼类的神经环路示踪病毒。在RNA1区段的3’端使用蛋白linker（GGGGS）添加e GFP的C端短肽（E11）,利用反向遗传操作系统进行病毒体外拯救后,SSN-1敏感系细胞的感染实验、RT-PCR检测以及带有e GFP的N端（G1-10）转基因斑马鱼在体实验均无法检测到病毒。再次使用更加短小的HA标签和首尾不同位置以及不同连接序列的尝试,最终在使用2倍蛋白linker和F2A将HA标签连接在神经坏死病毒的3’尾端两种改造方式中,通过RT-PCR可以检测到病毒RNA依赖的RNA聚合酶的表达,以及细胞免疫荧光实验可以检测到HA标签的表达,同时在转基因斑马鱼在体注射实验中同样可以检测到NNV病毒的存在。综上,我们建立了体外拯救神经坏死病毒的方法,并且成功构建出B2蛋白突变株病毒,一定程度上降低了对宿主的毒性作用;另外确定了使用2倍蛋白linker和F2A在病毒基因组上添加HA短肽的方法,为NNV病毒作为神经环路示踪的研究提供了可能。由于病毒基因组的局限性和拯救系统的不完善,在病毒的拯救效率和增殖能力上与野生毒株相比有一定差距,因此还需进一步的摸索和优化。

关键词： 猪流行性腹泻病毒   S蛋白   布鲁氏菌Omp16蛋白   乳酸菌   口服疫苗  

摘要： 猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是危害养猪业健康发展的重要疾病之一,具有急性、高度传染性的特征,给养猪业造成了严重的经济损失。疫苗免疫接种是预防PED最安全有效的方法,理想的疫苗可有效预防猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染,显著降低PEDV感染猪群的临床症状和死亡率,提高猪的生长性能。然而,传统的PED灭活苗和PED弱毒苗,免疫保护效果并不十分理想,因此,开发和研制速效、高效、长效的新型PED基因工程疫苗具有重要的实际意义。S蛋白是PEDV重要的结构蛋白和免疫原性抗原,携带主要的B淋巴细胞抗原表位,被认为是研制PED基因工程疫苗的主要靶点。Omp16是布鲁氏菌的一种外膜蛋白,不仅对细菌生长繁殖和维持其体内平衡很重要,而且还参与细菌粘附、胞外蛋白和多糖的分泌以及生物膜的形成等过程,具有黏膜免疫佐剂活性,可作为一种黏膜疫苗佐剂用于研制新型基因工程疫苗。本研究以合成质粒p UC57-Omp16-S为材料,克隆融合基因Omp16-S,构建重组乳酸菌pVE5523-Omp16-S/ATCC393,并进行小鼠免疫试验评价其免疫效果。结果显示成功构建了携带Omp16-S基因的重组乳酸菌pVE5523-Omp16-S/ATCC393,该重组乳酸菌经口服免疫小鼠能有效递呈其携带的外源基因,刺激免疫小鼠产生特异性的血清抗体,并诱发小鼠的细胞免疫反应,为今后新型PED基因工程疫苗的研制提供了新的思路。主要研究内容如下:*** S和Omp16双基因原核表达载体的构建本研究以合成质粒p UC57-Omp16-S为模板,设计扩增Omp16-S的上游引物F1和下游引物R1,扩增S的上游引物F2和下游引物R2,PCR分别扩增出1134 bp、660 bp的目的片段Omp16-S和S,将Omp16-S和S分别克隆至大肠杆菌表达载体p ET-28a(+)上,再转化到BL21(DE3)感受态细胞中,获得p ET28a-Omp16-/BL21(DE3)、p ET28a-S/BL21(DE3)重组菌,SDS-PAGE结果表明,Omp16-/BL21(DE3)和p ET28a-S/BL21(DE3)经IPTG诱导后,能表达出大小约为40KD的Omp16-S和23KD的S目的蛋白,目的蛋白经Magne His?蛋白纯化试剂盒纯化后浓度更大,纯度更高。*** S和Omp16双基因乳酸菌表达载体的构建本研究将合成质粒p UC57-Omp16-S通过Sal I和Eco R V双酶切获得目的基因Omp16-S,将其插入乳酸菌分泌表达载体pVE5523,转化到Top10中,获得pVE5523-Omp16-S质粒,PCR和酶切鉴定正确后,将pVE5523-Omp16-S质粒电转化入干酪乳杆菌ATCC393中,PCR和酶切鉴定结果表明:成功构建了插入Omp16-S基因的组干酪乳杆菌pVE5523-Omp16-S/ATCC393。3.携带PEDV S和Omp16双基因重组乳酸菌疫苗口服免疫原性研究将50只6周龄雌性C57/B6小鼠随机分成5组,分别以0.2 m L/只剂量灌胃免疫重组菌pVE5523-Omp16-S/ATCC393和空白菌ATCC393,以0.2 m L/只肌肉注射Omp16-S蛋白+CFA/IFA、Omp16-S蛋白、S蛋白,两周后加强免疫一次,在第二次免疫后2周对每组小鼠进行眼眶采血,测定血清样本中的IgG亚类(IgG1、IgG2a、IgG2b)抗体水平、血清IFN-γ、血清IL-4、血清IL-10。血清中的IgG亚类测定结果表明:pVE5523-Omp16-S/ATCC393、Omp16-S蛋白+CFA/IFA、Omp16-S蛋白、S蛋白在第二次免疫后2周均能诱导机体产生一定水平的针对PEDV的特异性血清抗体,且机体产生的IgG抗体亚类主要是IgG1,其次是IgG2a和IgG2b;血清中细胞因子测定结果表明:pVE5523-Omp16-S/ATCC393组、Omp16-S蛋白+CFA/IFA组和Omp16-S蛋白组免疫小鼠血清中γ干扰素、IL-4和IL-10分泌量分别与S蛋白组相比差异较显著(P<0.05),pVE5523-Omp16-S493-708/ATCC393组、Omp16-S493-708蛋白+CFA/IFA组和Omp16-S493-708蛋白组两两相比差异不显著(P>0.05)。

关键词： 雌酮-3-葡糖苷酸   孕二醇-3-葡糖苷酸   抗原结合片段   噬菌体展示   酶联免疫吸附测定  

摘要： 雌性激素包括雌激素与孕激素两大类,对女性发育和生殖功能至关重要。雌激素主要有雌酮、雌二醇和雌三醇,孕激素以孕酮为主。雌激素、孕激素水平是生殖监测中不可或缺的临床指标,性激素六项中就包含雌二醇和孕酮,对不孕症的病因诊断、疗效观察、预后判断及生殖生理作用机制的研究具有重要意义。国内外性激素常规检查方法以血清为样本,连续采血检测易引起病人心理压力,且存在安全风险,开发快速无创监测性激素水平方法有较大需求。近期研究发现,雌酮和孕酮的尿液代谢物,雌酮-3-葡糖苷酸(Estrone-3-glucuronide,E1G)和孕二醇-3-葡糖苷酸(Pregnanediol-3-glucuronide,PdG)浓度与血清雌酮孕酮浓度呈线性相关,使得通过尿液无创监控雌酮孕酮水平成为可能。但是E1G和PdG分子量低、免疫原性弱,是哺乳动物体内本身存在的代谢物,难以通过传统免疫方法稳定获得抗体,或高特异性和高亲和力抗体,成为此类检测产品开发的限制因素。随着基因工程和重组抗体技术的发展,第三代抗体尤其是抗原结合片段(Fragment antigen-binding,Fab),在制备小分子抗原抗体中展现出巨大潜力。结合体外展示技术,能高通量快速筛选出高亲和力高特异性抗体,且制备工艺简单、周期短,可应用于预防、诊断、治疗、检测等领域。本研究利用噬菌体展示技术分别构建了E1G和PdG的Fab抗体库,并通过3-4轮淘筛及酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)验证获得了E1G和PdG的Fab抗体,并对获得的抗体进行了序列分析。本研究主要结果如下:1.以半抗原E1G-BSA和PdG-BSA免疫小鼠,通过效价测定动态监测了小鼠体内相应抗体产生的趋势,结果表明两种半抗原免疫小鼠后均能产生高效价抗体。两种半抗原抗体效价在第9周达到峰值,E1G-BSA效价最高达到1:32000-1:64000,PdG-BSA效价达到1:16000-1:32000,且在小鼠体内抗体产生可维持约6周。2.选取免疫第9周的小鼠取脾脏,抽提脾细胞总RNA后通过反转录获得cDNA,再以cDNA为模板,经过三轮重叠延伸PCR得到Fab片段。通过酶切和连接构建了pComb3Xλ-Fab重组噬菌粒载体,电转化XL1-Blue菌得到两个库容分别为1.13×10和1.03×10的Fab噬菌体抗体库,其重组率分别约为78.57%和92.31%,背景连接率均为0%。3.对构建好的噬菌体抗体库分别进行3-4轮淘选,从富集到的阳性克隆中随机选择克隆进行可溶性抗体片段ELISA分析,获得了多个与E1G或PdG具有高亲和力的抗体。又从中选择了亲和力较好的共9个克隆进行Sanger测序和IMGT/V-QUEST比对,表明针对E1G或PdG的抗体具有类似的结构特征。随后选取两个亲和力较好的克隆E1G-F6和E1G-F8,对于E1G差别极小的三种小分子化合物进行了交叉反应测试,结果证实Fab抗体确实能够识别分子差异极小的小分子化合物。

关键词： 粘膜疫苗   原核表达   自杀质粒   CrisprCas9   VNN   E. ictaluri   ompN1   MCP   TonB   Crp  

摘要： 病毒性神经坏死病(viral nervous necrosis,VNN)可引起鱼类病毒性神经坏死,是我国水产养殖中危害最大的病毒性疾病之一,特别是在我国东南沿海地区较为常见。该传染病的病原体为神经坏死病毒(Nervous necrosis virus,NNV),据报道,已有30多种海鱼在苗期和培养过程中受到VNN的影响,特别是对石斑鱼仔鱼和幼鱼造成很高的死亡率,给海洋鱼类养殖造成严重的经济损失。目前用于防治该病的疫苗主要是通过注射方式免疫的,但由于注射免疫的局限性。本实验旨在研究制备一种能通过粘膜免疫(口服粘膜免疫和浸泡粘膜免疫)石斑鱼从而有效防治病毒性神经坏死病的粘膜疫苗,以至于能够打破传统免疫的局限性。鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)是一种革兰氏阴性兼性胞内病原体,可引起鲶鱼(ESC)的肠败血症。该疾病最初被发现是在1976年的佐治亚州和阿拉巴马州的垂死鲶鱼中,它可以通过胃肠道、鳃、皮肤等粘膜组织或口腔、鼻孔(鼻子)进入鱼体引发斑点叉尾鮰肠败血症。研究表明鮰爱德华氏菌编码的外膜蛋白(OMP)N具有参与粘附和侵袭,赋予其毒力属性。其中编码的omp N1蛋白参与了鞭毛在内膜和外膜之间的肽聚糖层的锚定以及参与蛋白信号的转导,并且容易被受感染的宿主识别,所以我们认为omp N1蛋白具有跨膜作用,在鮰爱德华氏菌的跨粘膜致病机制中扮演一个重要的角色。Crp和Ton B蛋白是鮰爱德华氏菌编码的另外两种蛋白,他们参与ESC的发病过程,是***的重要毒力因子。综上所述,可以根据鮰爱德华氏菌的跨粘膜致病机理,并敲除其致病蛋白,将原本不具备黏膜免疫作用的鱼类神经坏死病毒的外壳蛋白MCP敲入到鮰爱德华氏菌的基因组并表达,制备相应的粘膜疫苗。目的:将鮰爱德华氏菌的外膜蛋白N1(omp N1)和神经坏死病毒的衣壳蛋白(MCP)融合,在工程菌中表达并纯化出一种具有跨粘膜免疫的基因重组融合蛋白(MCP-omp N1),为制备抗鱼类病毒性神经坏死病的粘膜免疫疫苗奠定基础。其次利用细菌基因编辑技术敲除鮰爱德华氏菌的潜在致病基因Ton B和Crp,并将神经坏死病毒的衣壳蛋白(MCP)基因敲入到缺失△Ton B的弱毒鮰爱德华氏菌基因组和野生型鮰爱德华氏菌的基因组并表达,获得的新菌株可用于制备预防神经坏死病毒和鮰爱德华氏菌的粘膜免疫疫苗。方法:1.利用从NCBI Gen Bank库里获得鱼类神经坏死病毒的外壳蛋白M CP与鮰爱德华氏菌的外膜蛋白omp N1的基因序列,并将两者进行了序列优化与全基因合成。分别构建原核表达载体:MCP-omp N1 p ET28a、MCP p ET28a、o mp N1 p ET28a,在大肠杆菌内分别诱导表达融合蛋白MCP-omp N1、MCP、omp N1,且利用包涵体纯化及透析复性获得MCP-omp N1、MCP、omp N1蛋白。然后利用纯化后MCP、omp N1蛋白作为抗原免疫小鼠,通过ELISA检测小鼠血清总Ig G水平和Western-blot检测抗血清的特异性。2.针对致病基因Crp和Ton B的敲除,分别构建基因敲除重组载体:Crp-sg RNA1-Donor SX Pcrispr、Crp-sg RNA3-Donor SX Pcrispr、Ton B-sg RNA-Donor SX Pcrispr,这些重组质粒分别电转化至鮰爱德华氏菌感受态细胞中,通过双抗性筛选、PCR、测序验证最终筛选出成功敲除Crp和Ton B的弱毒鮰爱德华氏菌株。3.外源基因MCP的敲入,分别构建基因敲入重组载体:MCP-Δ Ton B pK18mobsac B、MCP-p K18mobsac B,分别电转化至弱毒鮰爱德华氏菌株及野生型鮰爱德华氏菌中,依次通过卡那抗性、20%蔗糖、PCR、测序验证,最终获得成功敲入外源基因MCP的菌株。结果:***-PAGE结果显示原核表达纯化得到了较纯的MCP-omp N1融合蛋白,进一步的ELISA检测结果显示与PBS组相比,MCP及omp N1组的小鼠血清总Ig G水平显著升高。Western Blotting结果也表明了纯化得到MCP-omp N1融合蛋白具有MCP抗原性,也具有omp N1抗原性。2.基因敲除实验结果显示,电转化后通过卡那及氯霉素双抗性筛选出阳性单克隆,通过将其基因组提取后进行PCR,将PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,发现在目的条带均与未编辑的阴性对照基因小。再通过测序序列结果比对,结果显示△Crp1部分序列敲除及发生突变,△Crp3相比于原始Crp基因在372-452 bp处缺失80 bp,△Ton B相比于原始Ton B基因在336 bp～415 bp处缺失79 bp。以上的实验结果证明成功敲除了Crp和Ton B基因,获得弱毒

关键词： 牛病毒性腹泻病毒   E0蛋白   间接ELISA方法   基因工程疫苗   免疫检测  

摘要： 牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea, BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)引起的急性或持续性感染的疾病，该病由排泄物(唾液、尿液、粪便)以及直接接触进行水平传播，或由妊娠母牛通过胎盘感染犊牛进行垂直传播。该病可诱发多种临床症状，如发热、腹泻、流产、产奶量下降、呼吸系统疾病、繁殖障碍等。持续性感染牛(Persistant infection, PI)是该病的主要传染源，由于病畜机体产生免疫抑制，在群体中终生排毒，给世界养殖业带来了严重的危害。E0蛋白是BVDV特有的保护性抗原，其抗原多样性较低，能够刺激机体产生特异性中和抗体，因此在基因工程疫苗和免疫检测中得到了广泛应用。　　本实验将克隆得到的BVDVE0基因插入到pET-32a表达载体上，将经鉴定的阳性质粒转化到***(DE3)感受态细胞中，通过IPTG诱导表达获得BVDVE0蛋白，将经镍柱纯化的E0蛋白进行WesternBlot鉴定，结果显示诱导表达的重组E0蛋白与BVDV阳性血清可结合，具有反应原性。　　以重组BVDVE0蛋白为包被抗原建立间接ELISA方法，通过对反应条件进行优化，确定了抗原稀释浓度为1∶160、血清稀释浓度为1∶150、1.5%BSA封闭2h、酶标二抗稀释倍数为1∶3200孵育45min、底物作用时间为10min，并确定临界值为0.241。该方法具有良好的重复性、特异性和敏感性;与商业化试剂盒进行比较，总符合率为85.3%，说明该方法具有一定的准确性;同时应用该方法对吉林省四个地区的216份血清样本进行检测，阳性率为33.7%。　　本实验诱导表达纯化BVDV重组E0蛋白所以建立的ELISA方法可用于临床样品的检测。

关键词： NDV   F蛋白   HN蛋白   基因工程疫苗   杆状病毒表达系统  

摘要： 新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的鸡和多种禽类发病的急性、高度接触性传染病,是世界范围内危害最严重的禽类传染病之一。目前对于ND的防控主要依赖于疫苗接种,但在长期的免疫压力下,新基因型不断出现导致免疫失败和非典型性ND发生,表明了目前使用的疫苗仍需进一步改善。此外,常规疫苗还存在效能低、安全性差等问题,因此亟需研制针对当前流行毒株的新型ND疫苗。本研究使用我国主要流行毒株NDV基因Ⅶ型毒株作为疫苗株,利用昆虫杆状病毒表达系统表达了NDV的F蛋白和HN蛋白,制备了新城疫基因工程亚单位疫苗,并对其免疫效果进行了初步探究。本研究将NDV基因Ⅶ型毒株r GM的F及HN基因插入p Fast Bac1转递质粒,通过Bac-to-Bac表达系统获得了重组杆状病毒BV-F及BV-HN。利用间接免疫荧光试验和Western blot对表达的F及HN蛋白进行了检测和鉴定。间接免疫荧光试验结果表明表达的F及HN蛋白可以被NDV多克隆抗体及His-Tag标签抗体特异性识别;Western blot检测结果显示F蛋白可在昆虫细胞中成功表达并被部分裂解,可检测到大小约为60 k Da和50 k Da的条带;HN蛋白成功表达,可检测到大小约为63 k Da的条带。基于HN蛋白具有凝集红细胞的活性,对表达的HN蛋白进行血凝试验,结果显示HN蛋白血凝效价为2。为评估表达的F及HN蛋白的免疫原性,将成功表达的F及HN蛋白与佐剂MONTANIDETMISA 71 R VG按照4:6的比例混合后制备成亚单位疫苗。使用14日龄SPF鸡进行免疫攻毒试验,初步评估了该疫苗的免疫效果。免疫试验结果显示,F和HN蛋白亚单位疫苗在免疫后28天内HI抗体持续增长,其平均HI效价为4.625 log,平均中和抗体为4.5 log。而单独免疫F蛋白疫苗或单独免疫HN蛋白疫苗的SPF鸡,免疫后刺激机体产生的抗体水平较低。在二免后第15 d使用同源毒株以10EID/100μL进行攻毒试验,攻毒后连续14天观察各组SPF鸡的健康状况,并采集咽喉拭子和泄殖腔拭子检测排毒情况。攻毒试验结果表明,F和HN蛋白亚单位疫苗对SPF鸡有100%的保护效果。拭子排毒检测显示,仅在第3 d发现咽喉拭子有带毒情况。单独免疫F蛋白或HN蛋白疫苗的SPF鸡攻毒保护率均为80%,拭子排毒检测显示两组鸡均可排毒至第7 d。综上所述,本研究利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达了NDV F及HN蛋白,制备的NDV F和HN蛋白亚单位疫苗可对免疫鸡产生完全保护并有效减少排毒,为ND基因工程疫苗的研制提供了新思路,具有潜在的应用价值。

关键词： 微囊藻毒素   噬菌体抗体库   基因工程抗体   链置换技术   定点突变   可溶性表达   免疫分析  

摘要： 蓝藻产生的微囊藻毒素(MCs)是一类小分子生物毒素,可造成水体、土壤环境以及农产品和食品的污染。已报道的MCs超过200种,其中MC-LR亚型毒性最强、危害最普遍,属2B类致癌物,世界卫生组织规定其在饮用水中的最大残留限量为1.0μg/L。探寻MCs快速高灵敏监测方法,一直是业内探索的热点。本研究借助噬菌体展示抗体库,以及抗体高通量筛选与特性修饰等技术手段,用多种渠道研制了具有MC-LR高灵敏结合能力的异源基因工程抗体(GEAb),并建立了相应免疫学分析方法用于其快速高灵敏检测,具体研究的内容如下:(一)MC-LR驼源纳米抗体筛选与应用。将MC-LR偶联到KLH和BSA上,形成MC-LR-KLH和MC-LR-BSA复合物,分别作为富集和筛选的包被抗原,经4轮富集淘筛,从驼源噬菌体纳米抗体库中获得20个阳性克隆。阳性反应最强的ANAb12,ANAb9和ANAb7基因被克隆到p ET26b(+)载体上,并导入*** BL21中进行可溶性表达。以获得的ANAb12,ANAb9和ANAb7纳米抗体蛋白建立IC-ELISAs测定MC-LR,结果显示,它们的最低检出限分别达到0.06,0.08和0.12μg/L;经MC-LR同系物交叉反应分析,3个纳米抗体对MC-RR,MC-YR和MC-WR均具有较强识别能力,交叉反应率达到82.7%～116.9%。上述IC-ELISAs对MC-LR在自来水中的添加回收测试,回收率为84.0%～106.5%,变异系数为3.4%～10.6%,表明检测方法具有良好的精确性和稳定性。(二)MC-LR免疫兔源抗体库构建及其sc Fv筛选与应用。以MC-LR-KLH为免疫原,经5轮免疫,供试兔血清滴度达到1:2500000。以兔脾脏总RNA反转录的c DNA为模板,设计特异性引物分别扩V、V基因进而拼接成为sc Fv基因,经克隆到p IT2噬菌粒载体上并转入*** TG1中,成功构建库容量为3.26×10 cfu/m L的MC-LR免疫兔源噬菌体sc Fv库。以MC-LR-BSA为包被抗原,经4轮富集淘筛,从库中获得18个阳性克隆。将阳性反应最强的Rsc Fv3基因导入*** HB2151中进行可溶性表达制备其sc Fv蛋白。以获得的MC-LR p Abs和MC-LR Rsc Fv3-sc Fv蛋白建立IC-ELISAs测定MC-LR,结果显示,它们的最低检出限分别达到0.03和0.05μg/L;经MC-LR同系物交叉反应分析,两种抗体对MC-RR,MC-WR和MC-YR均具有较强识别能力,交叉反应率达到56%～136%。以MC-LR Rsc Fv3-sc Fv蛋白建立的IC-ELISA对MC-LR在自来水、瓶装饮用水和湖水样品中的添加回收测试,回收率为86.8%～106%,变异系数为1.8%～10.8%,表明检测方法具有良好的精确性和稳定性。(三)MC-LR免疫鼠源抗体库构建及其sc Fv筛选与应用。以MC-LR-BSA为免疫原,经5轮免疫,供试小鼠血清滴度达到1:3600000。以鼠脾脏总RNA反转录的c DNA为模板,设计特异性引物分别扩增V、V基因进而拼接成为sc Fv基因,经克隆到p IT2噬菌粒载体上并转入*** TG1中,成功构建库容量为8.67×10 cfu/m L的MC-LR免疫鼠源噬菌体抗体库。以MC-LR-KLH为包被抗原,经4轮富集淘筛,从库中获得16个阳性克隆。将阳性反应最强的Msc Fv7基因导入*** HB2151中进行可溶性表达制备其Msc Fv-sc Fv蛋白。以Msc Fv7-sc Fv蛋白建立IC-ELISA检测MC-LR,结果显示,它的最低检出限达到0.044μg/L;经MC-LR同系物交叉反应分析,其对MC-RR和MC-YR均具有较强识别能力,交叉反应率分别为85.9%和93.1%。该IC-ELISA对MC-LR在自来水、瓶装饮用水和湖水样品中的添加回收测试,回收率为81.2%～106.3%,变异系数为2.62%～10.22%,表明检测方法具有良好的精确性和稳定性。(四)MC-LR AV-MV重组及其活性修饰与应用。为了获得结合活性和热稳定性更高的MC-LR GEAb,以ANAb12和Msc Fv7为模板,借助链置换技术,将两者重链区域(V)拼接形成AV-MV重组抗体,经ELISA测定,其对MC-LR的结合活性和热稳定性分别比ANAb12和Msc Fv7均有所提高。为了进一步改进AV-MV的抗原结合活性,对其MV-CDR3区域进行了定点突变,成功构建库容量为8.99×10 cfu/m L的噬菌体展示AV-MV突变抗体库。以MC-LR-KLH为包被抗原,经3轮富集淘筛,从突变库中获得15个阳性突变克隆,其中5个反应值高于原初AV-MV。将阳性反应