关键词:
猪流行性腹泻病毒
S蛋白
布鲁氏菌Omp16蛋白
乳酸菌
口服疫苗
摘要:
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是危害养猪业健康发展的重要疾病之一,具有急性、高度传染性的特征,给养猪业造成了严重的经济损失。疫苗免疫接种是预防PED最安全有效的方法,理想的疫苗可有效预防猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染,显著降低PEDV感染猪群的临床症状和死亡率,提高猪的生长性能。然而,传统的PED灭活苗和PED弱毒苗,免疫保护效果并不十分理想,因此,开发和研制速效、高效、长效的新型PED基因工程疫苗具有重要的实际意义。S蛋白是PEDV重要的结构蛋白和免疫原性抗原,携带主要的B淋巴细胞抗原表位,被认为是研制PED基因工程疫苗的主要靶点。Omp16是布鲁氏菌的一种外膜蛋白,不仅对细菌生长繁殖和维持其体内平衡很重要,而且还参与细菌粘附、胞外蛋白和多糖的分泌以及生物膜的形成等过程,具有黏膜免疫佐剂活性,可作为一种黏膜疫苗佐剂用于研制新型基因工程疫苗。本研究以合成质粒p UC57-Omp16-S为材料,克隆融合基因Omp16-S,构建重组乳酸菌pVE5523-Omp16-S/ATCC393,并进行小鼠免疫试验评价其免疫效果。结果显示成功构建了携带Omp16-S基因的重组乳酸菌pVE5523-Omp16-S/ATCC393,该重组乳酸菌经口服免疫小鼠能有效递呈其携带的外源基因,刺激免疫小鼠产生特异性的血清抗体,并诱发小鼠的细胞免疫反应,为今后新型PED基因工程疫苗的研制提供了新的思路。主要研究内容如下:*** S和Omp16双基因原核表达载体的构建本研究以合成质粒p UC57-Omp16-S为模板,设计扩增Omp16-S的上游引物F1和下游引物R1,扩增S的上游引物F2和下游引物R2,PCR分别扩增出1134 bp、660 bp的目的片段Omp16-S和S,将Omp16-S和S分别克隆至大肠杆菌表达载体p ET-28a(+)上,再转化到BL21(DE3)感受态细胞中,获得p ET28a-Omp16-/BL21(DE3)、p ET28a-S/BL21(DE3)重组菌,SDS-PAGE结果表明,Omp16-/BL21(DE3)和p ET28a-S/BL21(DE3)经IPTG诱导后,能表达出大小约为40KD的Omp16-S和23KD的S目的蛋白,目的蛋白经Magne His?蛋白纯化试剂盒纯化后浓度更大,纯度更高。*** S和Omp16双基因乳酸菌表达载体的构建本研究将合成质粒p UC57-Omp16-S通过Sal I和Eco R V双酶切获得目的基因Omp16-S,将其插入乳酸菌分泌表达载体pVE5523,转化到Top10中,获得pVE5523-Omp16-S质粒,PCR和酶切鉴定正确后,将pVE5523-Omp16-S质粒电转化入干酪乳杆菌ATCC393中,PCR和酶切鉴定结果表明:成功构建了插入Omp16-S基因的组干酪乳杆菌pVE5523-Omp16-S/ATCC393。3.携带PEDV S和Omp16双基因重组乳酸菌疫苗口服免疫原性研究将50只6周龄雌性C57/B6小鼠随机分成5组,分别以0.2 m L/只剂量灌胃免疫重组菌pVE5523-Omp16-S/ATCC393和空白菌ATCC393,以0.2 m L/只肌肉注射Omp16-S蛋白+CFA/IFA、Omp16-S蛋白、S蛋白,两周后加强免疫一次,在第二次免疫后2周对每组小鼠进行眼眶采血,测定血清样本中的IgG亚类(IgG1、IgG2a、IgG2b)抗体水平、血清IFN-γ、血清IL-4、血清IL-10。血清中的IgG亚类测定结果表明:pVE5523-Omp16-S/ATCC393、Omp16-S蛋白+CFA/IFA、Omp16-S蛋白、S蛋白在第二次免疫后2周均能诱导机体产生一定水平的针对PEDV的特异性血清抗体,且机体产生的IgG抗体亚类主要是IgG1,其次是IgG2a和IgG2b;血清中细胞因子测定结果表明:pVE5523-Omp16-S/ATCC393组、Omp16-S蛋白+CFA/IFA组和Omp16-S蛋白组免疫小鼠血清中γ干扰素、IL-4和IL-10分泌量分别与S蛋白组相比差异较显著(P<0.05),pVE5523-Omp16-S493-708/ATCC393组、Omp16-S493-708蛋白+CFA/IFA组和Omp16-S493-708蛋白组两两相比差异不显著(P>0.05)。