关键词： HEV   人鼠嵌合基因工程抗体   单克隆抗体  

摘要： 目的:制备抗戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)的人鼠嵌合基因工程抗体并研究其中和保护作用及特性。方法:将已获得的抗HEV鼠源单克隆抗体基因序列进行优化,设计人鼠嵌合的工程化抗体基因序列,将其克隆入真核表达载体;表达载体共转染293F细胞进行表达优化,高效制备基因工程化抗体;通过酶联免疫反应(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫荧光及HEV细胞感染模型,研究工程化抗体的结合能力及中和活性。结果:成功构建基因工程化人鼠嵌合HEV保护性抗体表达载体,在293F表达系统中实现高效表达。抗体表达产率达30 mg/L,亲和力为1.202×10^-8mol/L。免疫荧光检测结果显示抗体能够灵敏、特异地与已感染HEV的Kernow细胞结合,实时荧光定量PCR检测结果显示抗体可保护易感的C3A细胞不被HEV感染。结论:基因工程化抗体抗体具有高效的HEV结合能力及中和作用,能有效阻断HEV感染,并实现低成本高效表达。

关键词： 蓝色花   基因工程   B基因   蓝色色素  

摘要： 基因是生命的基本构造和性能,也是影响生物特性的重要因素。科学家应用基因工程将一种生物的基因嫁接代另一种生物的细胞里,可以实现对生物遗传性状的改造。部分花基因中缺乏蓝色基因,而蓝色花又具有独特的欣赏价值。将含有控制合成蓝色色素的B基因的花朵中的B基因通过分离、合成,再逆转录之后接入受体花朵细胞,使该基因在受体细胞中稳定下来,并遗传给子代,就可以得到美丽的蓝色花朵。本文就来分析蓝色花形成的基因工程进展和有效的育种策略。旨在为蓝色花培育提供一些参考建议。

关键词： 基因工程疫苗   病毒基因工程   康复者   疫苗研发   重组质粒构建   中国医药集团   基因序列   工程菌  

摘要： 新冠病毒基因工程疫苗研发,已完成基因序列合成2月15日,中国医药集团有限公司在京披露,该集团与中国疾病预防控制中心合作,新型冠状病毒疫苗的研发已经取得进展。国药集团旗下的国药中生研究院启动了新型冠状病毒基因工程疫苗研发,现已完成了基因序列合成,正在进行重组质粒构建和工程菌筛选工作。据介绍,研究发现在新冠康复者血浆中,有着丰富的新型冠状病毒综合抗体。为此,国药中生在研究中还提出了“用新冠康复者血浆治疗危重患者”的建议,并已获得科技部紧急立项。目前国药中生已按照国家卫健委和国家药监局的标准制备了新冠康复者血浆,并用于11名危重病人治疗。

关键词： 基因工程   玉米育种   应用现状  

摘要： 玉米是一种非常重要的粮食作物,相关的育种工作者都十分的重视育种工作的进行,培育出性状优良的玉米品种,实现这一目标可以有效的借助基因工程对于玉米育种影响。当前,转基因玉米也已经在全世界范围内得到了研究,很多的国家也建立了相对比较完整的玉米转基因理论和技术体系,我国也不例外,基于此,文章也对于基因工程在玉米育种中的应用现状进行了探究。

关键词： 狂犬病   糖蛋白   重组表达   基因工程疫苗  

摘要： 狂犬病病毒糖蛋白(RVGP)是唯一暴露于病毒颗粒表面的抗原,能够诱导宿主产生中和抗体,也是唯一存在于所有新型狂犬病疫苗中的病毒成分。本文综述了国内外学者利用原核系统,以及包括酵母系统、植物系统、昆虫细胞系统在内的真核系统和哺乳动物细胞系统、病毒载体系统来表达具有免疫原性的重组狂犬病病毒糖蛋白(rRVGP),并对其与天然RVGP在结构和激发机体免疫反应方面的相似性进行的相关研究,为狂犬病基因工程新型疫苗提供研究思路。

关键词： 牛   传染性鼻气管炎病毒   基因缺失疫苗   活载体疫苗   亚单位疫苗   DNA疫苗  

摘要： 牛传染性鼻气管炎病毒属于疱疹病毒I型,可导致牛发生高度接触性、病毒性传染病,病牛和带毒牛是主要传染源,感染牛出现结膜炎、脑炎和流产等临床症状,危害较大。牛传染性鼻气管炎病毒具有潜伏感染特征,可以潜伏在三叉神经节等部位,在机体抵抗力下降时就会发病,潜伏感染的牛可以长期带毒并不断向外界排毒。控制该病主要通过疫苗免疫,当前牛传染性鼻气管炎疫苗主要包括传统的灭活苗、弱毒苗以及基因工程疫苗,其中基因工程疫苗是一种新型疫苗,包括基因缺失疫苗、活载体疫苗、亚单位疫苗及DNA疫苗,各种疫苗各有优点。本文主要综述牛传染性鼻气管炎基因工程疫苗的最新研究进展,为该病的综合防控奠定基础,供参考。

关键词： 传染性喉气管炎病毒   基因工程疫苗   保护率  

摘要： 通过对家禽不同品种(SPF鸡、蛋鸡),不同日龄段(1、7日龄),不同免疫途径(刺种、注射)接种侯豆平(鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程苗),来研究不同免疫途径、不同日龄免疫与免疫效果的相关性,从而为基层养殖人员临床应用提供更科学的理论依据.实验结果表明侯豆平以注射和刺种两种途径免疫1日龄SPF鸡;1日龄、7日龄蛋鸡均对传染性喉气管炎有很好的保护效果,保护率均在80%以上,且注射效果更好些,同时两种接种途径对鸡群增重影响不显著.

关键词： 犬细小病毒   基因工程抗体   HEK-293F细胞   犬源化  

摘要： 犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)感染引起,严重危害犬类健康的传染病,具有发病率高、传染性强、死亡率高等特点。目前犬细小病毒病没有特效药物,目前采用的单克隆抗体在CPV感染早期有良好的治疗效果,但单克隆抗体为鼠源,具有较高的免疫原性,不能连续注射。本研究通过对已有单克隆抗体进行犬源化改造,制备适合犬用的免疫原性低的抗CPV抗体药物。首先对已有抗CPV的杂交瘤细胞株4H8进行鉴定,4H8抗体亚型为IgG,亲和力常数6个Ka平均值为1.02×1011 L/mol,只与CPV VLPs反应。经RACE-PCR提取4H8抗体可变区序列,用NCBI IgBLAST分析。将4H8抗体可变区序列与在ENA网站上查到的鼠源抗体恒定区序列组装,分别构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-L和pcDNA3.1(+)-H,共转染HEK-293、HEK-293F细胞进行表达。采用间接ELISA检测鼠源CPV基因工程抗体(CA)的表达量,CA在HEK-293F细胞中的表达量为5.97 mg/L;血凝抑制、中和试验检测其生物活性,CA在HEK-293细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:2、1:152,在HEK-293F细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:2、1:1 290。纯化CA后进行SDS-PAGE分析在55和25 Ku处出现条带;间接免疫荧光检测,CA能与CPV发生特异性结合。确定经过改造的CA依然保持活性后,进行犬源化改造。将4H8抗体可变区序列与在NCBI网站上查到的犬源抗体恒定区序列组装,分别构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-cL和pcDNA3.1(+)-cH,按照CA的方法进行表达和检测犬源CPV基因工程抗体(CCA)。CCA在HEK-293细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:2、1:203,在HEK-293F细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:2和1:2 580。CCA经Protein A亲和层析柱纯化后纯度在95%以上,血抑和中和效价分别为1:2和1:32 768。经BCA法检测CCA在HEK-293F细胞中的表达量为89.65 mg/L。SDS-PAGE分析CCA在55和25 Ku处出现条带,Western-blot检测重链能与兔抗犬IgG-HRP结合,间接免疫荧光检测CCA能中和CPV。以上结果表明,本研究在HEK-293F细胞中成功表达具有中和活性、纯度高、免疫原性低的犬源化CPV基因工程抗体。

关键词： 科学突破   结构熵   社区识别   链路预测   基因工程疫苗  

摘要： 创新发展是世界各经济体的战略发展要点。创新意味着范式的改变、劳动力的解放、生产效率的提高,进而实现社会经济、文化和技术的全面进步。从各国家地区的战略部署来看,突破性创新是部署的重点,其蕴含巨大的经济、科研和国家战略价值。突破性创新作为创新这一概念的下位类,具有非线性、创新性和影响力等多种特征。且特征量化难度大,因此识别和预测的难度较大。如果能对突破性创新进行识别和预测,可以先一步进行科研资金的优化配置、科研人员的合理调度和科研资源的重点投入,率先取得重点领域的科学突破和完成技术转型变革,占领技术高地。科学论文作为科学创新的重要载体,是突破性创新研究的重要数据来源。通过对科学论文的内容解读识别突破性创新,有助于深入了解突破性创新的发展规律和特点,对于后续研究的开展和管理决策的制定有重要作用。当前,已有研究对于突破性创新的测度大多从创新性、新颖性或者学科交叉性等较为单一的维度开展,也就是大多以某一个具体特征作为突破口进行测度,这就忽略了知识发展是一个整体动态发展这一基本特征,突破性创新的出现是依据每个知识单元之间的连接共同作用下的结果。本研究以科学论文作为主要的研究对象,没有将技术内容考虑在内,是以科学突破主题为研究对象,针对的是领域级别的科学研究,尝试对这类主题进行识别与预测。主要以主题词共现网络作为知识网络的代项,以科学突破主题会对知识网络整体状态造成“影响”作为突破口进行识别和预测。而其中网络状态的变化就是通过“结构熵”进行测度。因此构建了一套基于熵值的领域科学突破主题识别与预测方法。从而能从知识网络整体发展的视角识别科学突破。该项研究能补充当前突破性创新研究的理论研究,并具备一定的现实应用意义。本研究主要内容主要包括以下三个方面:首先,对创新领域内涵较为接近的几个概念从定性和定量两个维度进行了辨析,梳理了当前已有研究提出的突破性创新所应该具备的特征和识别方法的不足,最后明确了在识别突破性创新时需要重点关注的特征,为后续本研究提出的方法模型体系提供了理论支撑。之后,提出了基于熵值识别和预测科学突破的方法体系。熵值即是知识网络状态测度的指标。首先是就结构熵与知识网络状态之间的关系进行阐述,再梳理已有的结构熵构建方法,归并其优缺点,在既考虑知识网络的组成“节点”和“边”,又考虑知识发展特征“非广延性”的基础上,构建本研究的结构熵指标。之后从网络动态发展（结构熵发生改变的重要时间点）、识别重要主题（对网络结构熵影响较大的社区）和识别重要节点（对网络结构熵影响较大的节点和网络结构熵影响力发生突变的节点）等三方面对科学突破展开识别和预测。最后,在实证阶段是以“基因工程疫苗”领域的科学论文作为研究对象开展。在识别阶段主要是从结构熵的三方面开展,同时在识别阶段还与现有的新兴主题识别和突变主题识别结果进行了比对。预测阶段首先是通过链路预测方法构建预测的新网络,再从重要主题和重要主题词两方面进行科学突破的筛选。最后通过专家评估方法的有效性。实证结果证明,本文所提出的基于熵值的科学突破的识别和预测方法在基因工程疫苗领域有一定的应用价值,在知识体量越发巨大的今天,能在一定程度上对领域科学突破进行识别和预测,减轻人力筛选的负担,更快速高效地实现探测。本文包括图20幅,表格26个。

关键词： 犬细小病毒   单链抗体   原核表达   中和活性   临床治疗  

摘要： 犬细小病毒疾病是由细小病毒科成员犬细小病毒(CPV)感染引起的,是一种高危险性、高接触性、呈急性发病的烈性传染病。该病传染性强和死亡率高的特点给我国犬类及宠物饲养业造成了极大的经济损失和影响。目前应用于临床治疗的抗犬细小病毒单克隆抗体都是鼠源的,应用于犬体治疗时存在被免疫系统识别产生犬抗鼠抗体,很快被清除等问题;另一方面,单克隆抗体基因容易在较长的传代过程中丢失,且在真核细胞中获得抗体的方法成本很高。因此,近年来单链抗体(scFv)由于其免疫原性弱,相较简单和低成本的制备工艺而发展为目前研究最多的基因工程抗体之一。为了获得成本低且具有治疗效果的scFv,减小犬细小病毒病的临床治疗压力,本研究旨在利用大肠杆菌表达系统制备抗CPV的scFv,检测其生物活性并进行初步应用。方法为以实验室前期制备获得的,可以分泌具有中和活性的抗CPV VP2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株为基础,提取该杂交瘤细胞的总RNA,反转录合成cDNA链,以此为模板扩增并获得了抗体的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因;将可变区基因连接至原核表达载体pOPE101,成功构建重组质粒pOPE-scFv;测序结果与抗体基因数据库比对,获得了抗体可变区序列,VH基因大小为387bp,VL基因大小为393bp。重组质粒转化XL1-blue感受态细胞经IPTG诱导表达,经SD S-PAGE和Western blot验证分析蛋白大小约为35ku,与预期结果相符。为了提高scFv的表达量,构建了同时表达抗体可变区基因、Erv1基因以及DsbC基因的重组质粒pET23b-GB,经转化Rosetta感受态细胞诱导表达,SDS-PAGE和Western blot结果表明scFv表达量得到明显提高且可以被抗His标签抗体识别。利用His标签树脂亲和层析纯化scFv浓度为1.120mg/mL;经酶联免疫吸附试验(ELISA)结果表明原核表达的scFv可与VP2蛋白抗原结合活性;经间接免疫荧光实验表明scFv可与CPV和FPV特异性结合;经微量细胞中和实验证明scFv保留了中和CPV和FPV的活性,对CPV的中和效价为1:40(0.028mg/mL),对FPV中和效价为1:20(0.056mg/mL)。建立感染CPV动物模型,发病犬在连续注射scFv 3天后恢复健康,证明原核表达的scF v可以对感染CPV的犬产生治疗保护效果。本研究获得了抗CPV VP2蛋白抗体的可变区序列,在实现原核表达的基础上提升了其表达量,经以上研究结果表明本研究制备的scFv具有治疗犬细小病毒病的应用前景。