关键词： 基因工程嵌合抗体   猫细小病毒   哺乳动物表达系统  

摘要： 猫细小病毒(Feline parvovirus,FPV)又名猫泛白细胞减少症病毒,病猫临床表现以高热、呕吐、腹泻、脱水以及循环血流中白细胞减少为特点。FPV的宿主包括家养和野生猫科动物(Feliformia亚目)和一些野生犬科动物(Caniformia亚目),如浣熊和狐狸。因其感染性强致死率高被人们逐渐重视。目前临床针对FPV抗体治疗主要依赖于抗血清,市售的血清多是鼠源单克隆抗体(Monoclonal antibody,MAb),虽有一定疗效但由于是异源性蛋白应用于体内易产生过敏反应,无法连续注射,治疗效果不佳。近年来,因其基因工程嵌合抗体可以在保留原鼠源抗体的亲和力和特异性基础上降低鼠源性单克隆抗体的免疫原性,并通过连接不同的恒定区基因从而改变抗体的效应功能等优势已发展为目前研究最多的基因工程抗体之一。本实验旨在通过哺乳动物细胞表达具有中和FPV活性的鼠-猫嵌合抗体,降低鼠源单克隆抗体在猫体内引起的免疫副反应。通过克隆具有FPV中和活性的MAb(4F6)的重轻链可变区基因及猫天然抗体(NAb)重轻链恒定区基因,通过重叠延伸PCR获得鼠-猫重组重轻链基因片段(C/C),分别克隆至p FUSE-m Ig G1-Fc载体上,构建嵌合抗体表达载体(p MC-C、p MC-C),菌落PCR鉴定正确后转染CHO-K1细胞,使用100μg/m L博来霉素(Zeocin)筛选,有限稀释法将其单克隆纯化后经双抗体夹心ELISA与Western-blot筛选出同时表达鼠-猫重组重轻链基因的细胞株(CHO-MC),构建CHO-MC细胞系传代至15代,双抗体夹心ELISA测定不同代次细胞培养上清中的抗体效价,将纯化鉴定正确的鼠-猫嵌合抗体调整浓度为1mg/m L,间接ELISA检测嵌合抗体的效价,中和活性试验测定其对病毒感染细胞的中和活性。结果显示,鼠-猫嵌合抗体重轻链经SDS-PAGE分离大小分别为55 ku、25 ku,Western blot显示鼠源恒定区替换为猫源NAb的恒定区,双抗体夹心ELISA显示CHO-MC细胞系在传代至15代仍能稳定表达嵌合抗体,间接免疫荧光试验显示该嵌合抗体能够与抗猫Ig G和FPV特异性结合,ELISA及中和效价分别为1:1280(0.78μg/m L)和1:16(62.5μg/m L)。上述结果表明,本研究在保留了原猫细小病毒MAb 4F6中和活性的基础上,通过哺乳动物细胞表达出抗FPV的鼠-猫嵌合抗体,达到了减少抗体用于异种动物免疫源性的目的。

关键词： 残余宿主DNA   实时荧光定量PCR   重组诺如病毒VLP疫苗   汉逊酵母  

摘要： 目的建立汉逊酵母表达的重组诺如病毒基因工程疫苗中残余宿主DNA实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测方法,并进行验证。方法采用磁珠法提取汉逊酵母基因组DNA,获得标准品,建立q PCR标准曲线,并进行专属性、线性、准确度、精密度和耐用性验证。结果专属性验证结果显示,与对照制剂(注射用水、缓冲液、Vero细胞和CHO细胞培养上清DNA)相比,建立的方法对汉逊酵母DNA具有特异性扩增曲线;线性验证中5次试验标准曲线相关系数(R2)均>0.98;准确度验证试验不同浓度样品的加标回收率在95.12%~105.72%之间,均在70%~130%范围内;重复性和中间精密度验证试验相对标准偏差(RSD)均小于30%;耐用性验证中,Proteinase K不同消化温度下检测结果的RSD为20.75%,不同蛋白浓度供试品检测结果的RSD为27.11%,均符合《中国药典》三部(2015版)要求。结论建立的方法专属性、线性、准确度、精密度和耐用性均符合要求,可用于检测重组诺如病毒类病毒颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗中残余宿主DNA。

关键词： 基因工程疫苗   水平传播   中和抗体   病毒分离  

摘要： 为研究表达猪瘟病毒E2蛋白的重组PRRSV疫苗株rPRRSV-E2能否在猪群中水平传播,本研究将15头PRRSV抗原抗体均为阴性,PRV、CSFV和PCV2抗原阴性的35日龄健康仔猪,随机分成3组,每组5头。A组接种rPRRSV-E2第5代细胞毒,剂量为105.0TCID50/头;B组为同居感染对照组,接种DMEM;Mock组接种DMEM,单独饲养。猪体免疫后第7 d采集血清、鼻拭子和肛拭子样品,进行病毒载量和PRRSV、CSFV的抗原抗体含量测定,共持续监测3个月;所有猪只在试验期间每天观察临床症状。结果显示:未接种疫苗的同居对照组猪只各时间点血清中均未检测到PRRSV,也未检测到针对PRRSV和CSFV的抗体。研究结果表明,rPRRSV-E2不能在猪群中水平传播。

关键词： 鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗   保护剂配方   冻干曲线  

摘要： 为筛选出理想的鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗的冻干工艺,保证疫苗产品质量及免疫效果,更好地服务于畜牧业。本试验从冻干保护剂配方与冻干曲线入手,将含有0.8%、1.0%、1.2%、1.5%的明胶5%蔗糖保护剂分别与表达鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒(rFPV_ILTVgB)抗原按规定配比,分别在21、24.5、28 h的冻干曲线下完成冻干,并对冻干后的制品检测其效价、真空度、剩余水分及物理性状。结果表明,有1.0%明胶5%蔗糖保护剂24.5 h或28 h冻干曲线和1.2%明胶5%蔗糖保护剂28 h的冻干曲线三种冻干工艺,其制品效价、真空度、剩余水分、物理性状均符合标准。因而采用1.0%明胶5%蔗糖的保护剂配方及24.5 h的冻干曲线是该制品较为理想的冻干工艺。

关键词： 大肠杆菌   基因工程疫苗   重组蛋白   戊型肝炎疫苗   人乳头瘤病毒疫苗   脑膜炎球菌疫苗  

摘要： 大肠杆菌具有生长快速、培养成本低、遗传背景清楚等特点,已被广泛地应用于重组蛋白类药物的表达和生产。近年来,几种基于大肠杆菌表达的基因工程疫苗已投入市场(戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、脑膜炎球菌疫苗等)或进入临床研究(流感A型疫苗、疟疾疫苗、炭疽疫苗等),显示了大肠杆菌表达系统在疫苗研发中良好的应用前景。本文综述了大肠杆菌原核表达系统在基因工程疫苗研究中的应用与策略优化,包括已上市或进入临床疫苗的概述、大肠杆菌表达系统用于疫苗生产的可优化策略(二硫键形成、糖基化以及内毒素去除等),为大肠杆菌重组表达策略改进和基因工程疫苗的研发提供参考。

关键词： 生物技术育种   基因工程育种   农作物品种   单倍体育种   农业新品种   人类生活水平   细胞工程育种   传统育种方法  

摘要： 一、生物技术在农业育种方面的应用随着社会的不断发展和人类生活水平的不断提高,人类对农作物的产量与质量都提出了更高的要求,这就要求人类不断培育出新的农作物品种。传统育种方法具有周期长、成本高、效率低等缺点。而生物技术育种效率高,可以在短时间内培育出高产、优质、抗虫等农业新品种。生物技术育种包括细胞工程育种、基因工程育种、单倍体育种。

关键词： 多氧霉素   链霉菌   紫外诱变   ExoCET直接克隆   基因工程育种  

摘要： 多氧霉素是一种抑制几丁质生物合成的广谱抗真菌类抗生素,对多种真菌引起的农作物病害具有显著的防治效果,且对人和动植物无害,是一种绿色安全的生物农药,目前仍然是全球应用最广泛的抗真菌农药之一。多氧霉素的主要作用机制在于竞争性抑制真菌细胞壁合成中几丁质合成酶的活性,因此对农作物真菌病害具有显著的防治效果。现代农业的发展对于绿色生物农药的需求日益增长,本研究的目的是构建多氧霉素关键活性成分——多氧霉素B的高产菌株。从一株自土壤环境中分离得到的金色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)出发,首先通过紫外诱变初步筛选多氧霉素B的高产突变菌株;然后利用ExoCET直接克隆技术对多氧霉素基因簇pol进行克隆,并在基因簇第1个基因上游分别添加原始启动子和kasOp*强启动子,通过整合酶phiC31将基因簇整合到突变株染色体上构建pol倍增菌株,HPLC-MS检测比较多氧霉素B的产量。通过紫外诱变育种和筛选获得了链霉菌突变株Pol-12菌株,其产量较野生型菌株提高了1.2倍。为进一步提高多氧霉素产量,利用ExoCET直接克隆技术将pol克隆至p15A载体,并通过接合转移转化Pol-12菌株获得pol倍增菌株*** Pol-12::Pori-pol(M1)和*** Pol-12::PkasOp*-pol(M2)。与受体菌Pol-12相比,菌株M1和M2多氧霉素B的产量分别提高了22倍和33倍。因此得出结论:紫外随机诱变育种联合基因工程定向育种可有效应用于多氧霉素高产菌株的构建,增加基因簇的拷贝数以及强启动子插入有效提高了多氧霉素B的产量。

关键词： 基因工程育种   育种工作者   转基因抗虫棉   棉花种质资源   野生种质   抗虫基因   特异种质   远缘杂交  

摘要： 棉花种质创新与新品种培育的研究现状,自20世纪50年代起我国育种工作者利用系统选育手段创造了以提高产量为主的高产种质材料;在60年代以后,利用远缘杂交手段育成一大批具有野生种质的特异种质材料;80年代后期,基因工程育种在棉花中取得突破性进展,首例转基因抗虫棉在美国问世,从此棉花基因工程育种蓬勃发展起来.我国克隆出了棉花抗虫基因,育成转基因单价抗虫棉和转基因双价抗虫棉.2008-2019年,我国已育成转基因新品种160多个,累计推广5亿余亩,占国内市场份额96%以上,经济效益十分显著.

关键词： 甜瓜   基因组学   基因定位   分子育种  

摘要： 综述了近年来甜瓜基因组学、重要基因挖掘及基因定位、分子标记育种、基因工程育种等分子育种领域最新进展及甜瓜分子育种中存在的问题与展望,为推进甜瓜种质资源的合理高效利用,育成优质抗病甜瓜新品种提供新技术与方法。

关键词： 甲型肝炎   疫苗   抗原   佐剂   基因工程疫苗   联合疫苗   冻干疫苗  

摘要： 甲型肝炎是一种由甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)引起的急性传染性疾病,HAV在人群中主要通过粪口途径传播。甲肝流行情况与当地的卫生状况密切相关,有明显的季节性,常呈周期性爆发流行,传染源是急性期病人和亚临床感染者。每年大约有150万人因感染HAV而表现出临床症状,接种甲肝疫苗是预防和控制甲肝流行的最有效措施。本文通过检索和分析大量期刊和专利文献,对甲型肝炎疫苗的研究进展进行了总结。