关键词： 微囊藻   胞外碱性磷酸酶   PhoX   噬菌体展示技术   驼源纳米抗体   免疫荧光技术  

摘要： 以微囊藻为优势种的蓝藻水华问题已备受关注。磷是微囊藻大量生长所必须营养元素,因此,弄清磷代谢的过程十分必要。水体中的有机磷是蓝藻的重要磷源,胞外碱性磷酸酶PhoX在这一代谢过程中起关键作用,微囊藻的PhoX迄今尚未被研究确认。对微囊藻PhoX进行准确定量,也是厘清水华暴发水体中磷代谢过程所的重要环节,然而迄今并无有效手段。本实验基于对铜绿微囊藻Microcysits aeruginosa *** PCC7806(*** PCC7806)基因组的分析,寻找到了一个可能是胞外碱性磷酸酶PhoX的基因(Accession ***79942.1),并对这一基因进行了大肠杆菌表达,继而对表达的酶进行了一系列的酶学性质分析,对该酶进行了确认;探究了*** PCC7806中碱性磷酸酶基因phoX,phoA在不同磷条件下的表达响应;以*** PCC7806的胞外碱性磷酸酶蛋白作为抗原,基于噬菌体展示技术,在商品化的驼源纳米抗体库中筛选特异性的基因工程抗体,为PhoX的定量开发精确有效的工具。具体研究结果如下:(1)通过构建表达载体,表达、纯化微囊藻phoX基因,对该蛋白进行一系列性质分析。Western-blot和SDS-PAGE结果表示该目的蛋白的分子量大小约为88 k Da,与预期表达的大小吻合。生物信息学分析显示该蛋白含735个氨基酸残基;其二级结构的α-螺旋主要分布在氮端;蛋白质翻译后修饰的预测存在大量的糖基化和磷酸化位点;该蛋白为亲水蛋白,无跨膜结构域,但具有氮端Tat-way信号肽;以上这些均与胞外碱性磷酸酶的特征相符。表达出的PhoX表现出磷酸二酯酶和磷酸单酯酶活性,确认该蛋白为碱性磷酸酶。该酶的最适温度为37℃,最适p H值为10;作为辅酶的二价金属离子中Mg活性最高,其他依次为Co、Ca、Zn和Mn,Ni抑制该酶。(2)将在BG11培养基中培养到对数期的*** PCC7806分别转移到无磷(BG11(-P))、无机磷(BG11)和有机磷(BG11(-P+AMP))培养基中进行培养,分别在0,2,4,6 h取藻细胞进行RT-q PCR实验,分析胞外碱性磷酸酶蛋白编码基因phoX和胞内碱性磷酸酶phoA基因的表达以及细胞总体碱性磷酸酶活性的变化。结果显示不同环境磷对phoX的表达有显著的响应。在缺磷培养基(BG11(-P))中培养时,phoX表达在2 h时达到最高水平,然后在4 h下降到一个低水平。(3)基因分析显示PhoX在微囊藻属中的高度保守性,与其他蓝藻均有较大的差异。以*** PCC7806的PhoX蛋白为抗原,基于噬菌体展示技术,从驼源纳米抗体库中筛选基因工程抗体。经过三轮的淘筛,最终得到4个VHH抗体。对其中(阳性/阴性)P/N值为10.35的3H进行表达His-tag亲和柱纯化,获得了18 k Da的抗体蛋白VHH-3H。对该抗体进行FITC荧光化标记,免疫荧光反应验证了荧光化抗体FITC-VHH-3H对微囊藻胞外碱性磷酸酶有特异性结合能力。并通过ELISA对纳米抗体VHH-3H的特异性进行了验证。该抗体可用于水体中微囊藻碱性磷酸酶的分析,也可用于环境水样中微囊藻细胞的鉴定。

关键词： 胞外域   抗体   真核表达   细胞悬浮培养   酶联免疫吸附试验  

摘要： CD19特异性嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T cell,CART)在急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)的临床试验中取得了非常好的结果,显著改善了临床对于血液系统肿瘤的治疗方法。尽管CAR-CD19细胞疗法取得了巨大的成功,但约30%的患者发生了复发,研究表明在CAR-CD19复发病人B细胞表面CD19抗原存在明显的下调甚至直接转变为阴性,这可能是使用细胞疗法治疗后发生免疫逃逸的根本原因。近几年来,许多研究对于B细胞发生免疫逃逸的原因做了进一步阐述,其中复发原因包括可变剪接,系谱转换,双等位基因移码突变和内含子保留等一系列的复发机制。所以寻找新的靶点或者双靶点联合疗法对于ALL后期临床治疗具有重要意义。CD22主要表达于正常成熟B细胞表面和来源于B细胞的肿瘤细胞表面,主要抑制B细胞抗原受体(B cell antigen receptor,BCR)。CD22在复发病人的B细胞表面仍然可以被检测到,其可以作为治疗CART-CD19复发患者非常有前景的靶点。一些CD22相关的单克隆抗体药物也成功上市,用于治疗源于B细胞的淋巴细胞白血病。目前,噬菌体抗体库技术已经成为获得人源化高亲和力抗体的重要途径,被广泛应用到医学和生物领域。可通过体外或者体外反复多轮的淘选、富集、洗脱,快速筛选获得具有亲和力的基因工程抗体。为进一步开发针对CART-CD19复发以及CD22作为靶点疾病的细胞治疗产品或者抗体药物,本研究利用噬菌体抗体库筛选技术,从商业化人源化噬菌体抗体库Domain Antibody Library和Tomlinson I Library中筛选到两个具有高亲和力的基因工程抗体(一个为单域抗体(single domain antibody,sd Ab),一个为单链抗体(single chain variable fragment,sc Fv)。本研究主要结果如下:1.构建了CD22胞外域(CD22 extracellular domain,CD22ECD)表达质粒,通过瞬时转染HEK293FT悬浮细胞大量表达CD22胞外域蛋白,并通过亲和层析,离子交换层析和分子筛获得了高纯度且糖基化修饰完整的CD22胞外域蛋白。同时还筛选得到一株能够稳定表达CD22全长的293细胞株。2.使用商业化人源化噬菌体抗体库Domain Antibody Library和Tomlinson I Library,经过表达全长CD22 293细胞水平的一轮淘选,和三轮链霉亲和素-生物素磁珠固相淘选,分别获得了针对CD22靶点的单域抗体次级库和单链抗体次级库。对这两个淘选富集的抗体库采用酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immune Sorbent Assay,ELISA)进行单个克隆的筛选,分别获得一个具有较好亲和力的抗体片段。对这两个克隆进行测序和抗体序列分析,并通过ELISA实验初步测定了两个抗体的亲和能力。

关键词： 狂犬病病毒   单链抗体   纳米抗体   真核表达  

摘要： 狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabiesvirus,RABV）引起的烈性嗜神经性疾病，无有效疗法，主要通过疫苗和免疫球蛋白进行暴露后预防来控制该病毒。人类预防狂犬病使用的免疫球蛋白是人源和马源免疫球蛋白，两者存在潜在血清病原污染且产量有限，因此，找到副作用小且生产成本低的替代抗体具有迫切需求。　　本研究从单链抗体、纳米抗体和受体3种不同的技术路线出发，将结合RABVG蛋白的抗体可变区或受体片段与IgG抗体的Fc区融合形成分泌型基因工程抗体或抗体类似物，并通过体外和体内病毒中和试验及暴露后治疗试验比较研究了这些候选分子的抗病毒效果。本研究选取人源单克隆抗体CR57和鼠源单克隆抗体3D11E3的重链和轻链可变区序列，通过柔性肽连接成单链抗体的可变区;选取4种纳米抗体213E6、213H7、212C12、VHH-RVG-2的重链可变区，及3种RABV受体nAChR、NCAM和p75NTR的G蛋白结合区，在这些分子片段的N端加入抗体κ链的分泌信号肽，C端融合抗体Fc片段和6个组氨酸标签，构建出融合表达重组抗体蛋白的质粒，通过转染细胞进行真核表达。利用Westernblot和FAVN等方法检测重组抗体的表达水平和体外中和病毒能力。试验结果显示，单链抗体CR57、3D11E3和纳米抗体213E6、213H7的中和病毒能力较强，体外中和能力强弱为213H7＞213E6≈CR57＞3D11E3，而纳米抗体VHH-RVG-2和含受体结构的抗体类似物均基本无中和能力。　　利用镍柱亲和层析纯化出单链抗体CR57、3D11E3和纳米抗体213E6、213H7的重组蛋白，进行体内中和试验和暴露后治疗试验。结果显示，1IU的CR57、213E6抗体及10IU的3D11E3和213H7抗体能够在体内100％中和RABV感染;50IU的4种抗体对暴露后小鼠均有一定的治疗效果或延长了生存期，纳米抗体的治疗效果优于单链抗体，暴露后3天颅内注射纳米抗体，小鼠存活率可达80％。　　本研究成功构建并真核表达了9种RABV基因工程抗体，测定了它们的病毒中和能力。将中和能力较强的单链抗体CR57、3D11E3及纳米抗体213H7、213E6的重组蛋白表达纯化后，通过动物实验比较研究了它们的体内中和能力及暴露后治疗效果。研究结果为进一步研制和优化抗狂犬病病毒的基因工程抗体提供参考数据和候选分子。

关键词： PEDV   单克隆抗体   基因工程抗体   瞬时转染   CHO-K1细胞  

摘要： 目的:从抗猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)杂交瘤细胞克隆抗体轻重链全长基因,并实现其在真核细胞中的表达。为建立体外生产抗PEDV单克隆抗体平台奠定基础。方法:利用抗体亚型鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体亚型,采用间接ELISA法检测抗PEDV单克隆抗体的效价与特异性。通过对杂交瘤细胞的染色体数目分析以及间接ELISA法测定其抗体分泌能力的变化,评估杂交瘤细胞株的稳定性。通过RT-PCR从杂交瘤细胞株获取抗体轻重链全长基因,通过酶切连接构建轻重链表达质粒p IRES2-Zs Green1-L和p IRES2-Zs Green1-H。将轻重链表达质粒共转染CHO-K1细胞,RT-PCR鉴定抗体基因在CHO-K1细胞中的转录,Western Blot鉴定抗体基因在CHO-K1细胞中的表达。利用间接ELISA法和Western Blot检测基因工程抗体的结合活性。分别用人血清白蛋白信号肽、人kappa轻链信号肽,小鼠kappa轻链信号肽、高斯荧光素酶信号肽替代轻链亲本信号肽,对轻链信号肽进行优化。结果:抗PEDV单克隆抗体重链亚型为IgG2a亚型,轻链亚型为Kappa亚型,抗体效价为1:8000左右,抗体特异性较好,与猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、经典猪瘟病毒(Classic swine fever virus,CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(Porcinetransmissiblegastroenteritisvirus,TGEV)、猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCo V)均没有交叉反应。杂交瘤细胞连续传代3个月,染色体数目恒定为96条,间接ELISA结果说明杂交瘤细胞在传代过程中分泌抗体的能力无明显变化。琼脂糖凝胶电泳与测序结果显示,成功构建真核表达质粒p IRES2-Zs Green1-L和p IRES2-Zs Green1-H。RT-PCR结果说明抗体轻重链基因在CHO-K1细胞中均得到了转录,Western Blot结果说明抗体基因在CHO-K1细胞中成功表达。ELISA和Western Blot结果表明PEDV基因工程抗体具有良好的生物学结合活性。对抗体轻链信号肽进行优化,发现小鼠kappa轻链信号肽介导抗体分泌的能力略优于亲本信号肽。结论:抗PEDV单克隆抗体的特异性以及亲和力较好。成功克隆到了抗体基因,并实现其在CHO-K1细胞中的瞬时表达。对轻链信号肽进行了优化,发现小鼠kappa轻链信号肽介导抗体分泌的能力略优于亲本信号肽。

关键词： 基因工程嵌合抗体   猫细小病毒   哺乳动物表达系统  

摘要： 猫细小病毒(Feline parvovirus,FPV)又名猫泛白细胞减少症病毒,病猫临床表现以高热、呕吐、腹泻、脱水以及循环血流中白细胞减少为特点。FPV的宿主包括家养和野生猫科动物(Feliformia亚目)和一些野生犬科动物(Caniformia亚目),如浣熊和狐狸。因其感染性强致死率高被人们逐渐重视。目前临床针对FPV抗体治疗主要依赖于抗血清,市售的血清多是鼠源单克隆抗体(Monoclonal antibody,MAb),虽有一定疗效但由于是异源性蛋白应用于体内易产生过敏反应,无法连续注射,治疗效果不佳。近年来,因其基因工程嵌合抗体可以在保留原鼠源抗体的亲和力和特异性基础上降低鼠源性单克隆抗体的免疫原性,并通过连接不同的恒定区基因从而改变抗体的效应功能等优势已发展为目前研究最多的基因工程抗体之一。本实验旨在通过哺乳动物细胞表达具有中和FPV活性的鼠-猫嵌合抗体,降低鼠源单克隆抗体在猫体内引起的免疫副反应。通过克隆具有FPV中和活性的MAb(4F6)的重轻链可变区基因及猫天然抗体(NAb)重轻链恒定区基因,通过重叠延伸PCR获得鼠-猫重组重轻链基因片段(C/C),分别克隆至p FUSE-m Ig G1-Fc载体上,构建嵌合抗体表达载体(p MC-C、p MC-C),菌落PCR鉴定正确后转染CHO-K1细胞,使用100μg/m L博来霉素(Zeocin)筛选,有限稀释法将其单克隆纯化后经双抗体夹心ELISA与Western-blot筛选出同时表达鼠-猫重组重轻链基因的细胞株(CHO-MC),构建CHO-MC细胞系传代至15代,双抗体夹心ELISA测定不同代次细胞培养上清中的抗体效价,将纯化鉴定正确的鼠-猫嵌合抗体调整浓度为1mg/m L,间接ELISA检测嵌合抗体的效价,中和活性试验测定其对病毒感染细胞的中和活性。结果显示,鼠-猫嵌合抗体重轻链经SDS-PAGE分离大小分别为55 ku、25 ku,Western blot显示鼠源恒定区替换为猫源NAb的恒定区,双抗体夹心ELISA显示CHO-MC细胞系在传代至15代仍能稳定表达嵌合抗体,间接免疫荧光试验显示该嵌合抗体能够与抗猫Ig G和FPV特异性结合,ELISA及中和效价分别为1:1280(0.78μg/m L)和1:16(62.5μg/m L)。上述结果表明,本研究在保留了原猫细小病毒MAb 4F6中和活性的基础上,通过哺乳动物细胞表达出抗FPV的鼠-猫嵌合抗体,达到了减少抗体用于异种动物免疫源性的目的。

关键词： 残余宿主DNA   实时荧光定量PCR   重组诺如病毒VLP疫苗   汉逊酵母  

摘要： 目的建立汉逊酵母表达的重组诺如病毒基因工程疫苗中残余宿主DNA实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测方法,并进行验证。方法采用磁珠法提取汉逊酵母基因组DNA,获得标准品,建立q PCR标准曲线,并进行专属性、线性、准确度、精密度和耐用性验证。结果专属性验证结果显示,与对照制剂(注射用水、缓冲液、Vero细胞和CHO细胞培养上清DNA)相比,建立的方法对汉逊酵母DNA具有特异性扩增曲线;线性验证中5次试验标准曲线相关系数(R2)均>0.98;准确度验证试验不同浓度样品的加标回收率在95.12%~105.72%之间,均在70%~130%范围内;重复性和中间精密度验证试验相对标准偏差(RSD)均小于30%;耐用性验证中,Proteinase K不同消化温度下检测结果的RSD为20.75%,不同蛋白浓度供试品检测结果的RSD为27.11%,均符合《中国药典》三部(2015版)要求。结论建立的方法专属性、线性、准确度、精密度和耐用性均符合要求,可用于检测重组诺如病毒类病毒颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗中残余宿主DNA。

关键词： 基因工程疫苗   水平传播   中和抗体   病毒分离  

摘要： 为研究表达猪瘟病毒E2蛋白的重组PRRSV疫苗株rPRRSV-E2能否在猪群中水平传播,本研究将15头PRRSV抗原抗体均为阴性,PRV、CSFV和PCV2抗原阴性的35日龄健康仔猪,随机分成3组,每组5头。A组接种rPRRSV-E2第5代细胞毒,剂量为105.0TCID50/头;B组为同居感染对照组,接种DMEM;Mock组接种DMEM,单独饲养。猪体免疫后第7 d采集血清、鼻拭子和肛拭子样品,进行病毒载量和PRRSV、CSFV的抗原抗体含量测定,共持续监测3个月;所有猪只在试验期间每天观察临床症状。结果显示:未接种疫苗的同居对照组猪只各时间点血清中均未检测到PRRSV,也未检测到针对PRRSV和CSFV的抗体。研究结果表明,rPRRSV-E2不能在猪群中水平传播。

关键词： 鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗   保护剂配方   冻干曲线  

摘要： 为筛选出理想的鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗的冻干工艺,保证疫苗产品质量及免疫效果,更好地服务于畜牧业。本试验从冻干保护剂配方与冻干曲线入手,将含有0.8%、1.0%、1.2%、1.5%的明胶5%蔗糖保护剂分别与表达鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒(rFPV_ILTVgB)抗原按规定配比,分别在21、24.5、28 h的冻干曲线下完成冻干,并对冻干后的制品检测其效价、真空度、剩余水分及物理性状。结果表明,有1.0%明胶5%蔗糖保护剂24.5 h或28 h冻干曲线和1.2%明胶5%蔗糖保护剂28 h的冻干曲线三种冻干工艺,其制品效价、真空度、剩余水分、物理性状均符合标准。因而采用1.0%明胶5%蔗糖的保护剂配方及24.5 h的冻干曲线是该制品较为理想的冻干工艺。

关键词： 大肠杆菌   基因工程疫苗   重组蛋白   戊型肝炎疫苗   人乳头瘤病毒疫苗   脑膜炎球菌疫苗  

摘要： 大肠杆菌具有生长快速、培养成本低、遗传背景清楚等特点,已被广泛地应用于重组蛋白类药物的表达和生产。近年来,几种基于大肠杆菌表达的基因工程疫苗已投入市场(戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、脑膜炎球菌疫苗等)或进入临床研究(流感A型疫苗、疟疾疫苗、炭疽疫苗等),显示了大肠杆菌表达系统在疫苗研发中良好的应用前景。本文综述了大肠杆菌原核表达系统在基因工程疫苗研究中的应用与策略优化,包括已上市或进入临床疫苗的概述、大肠杆菌表达系统用于疫苗生产的可优化策略(二硫键形成、糖基化以及内毒素去除等),为大肠杆菌重组表达策略改进和基因工程疫苗的研发提供参考。

关键词： 生物技术育种   基因工程育种   农作物品种   单倍体育种   农业新品种   人类生活水平   细胞工程育种   传统育种方法  

摘要： 一、生物技术在农业育种方面的应用随着社会的不断发展和人类生活水平的不断提高,人类对农作物的产量与质量都提出了更高的要求,这就要求人类不断培育出新的农作物品种。传统育种方法具有周期长、成本高、效率低等缺点。而生物技术育种效率高,可以在短时间内培育出高产、优质、抗虫等农业新品种。生物技术育种包括细胞工程育种、基因工程育种、单倍体育种。