关键词： 鼻咽癌   抗独特型抗体   原核表达   单链抗体   基因工程   生物活性  

摘要： 目的：构建鼻咽癌人源抗独特型抗体基因原核表达载体pET25b(+)-G22，用原核系统表达出抗独特型基因工程抗体，并进行动物实验，为抗鼻咽癌疫苗的制备奠定基础。 方法：PCR扩增G22 ScFv基因，重组至原核表达载体pET25b(+)中，构建重组表达载体并将其转化入大肠杆菌BL21(DE3)。通过摸索诱导表达条件来提高目的基因的原核表达水平和可溶性融合蛋白的含量。将提取的可溶性和包涵体形式的G22 ScFv蛋白经His-tag磁珠蛋白纯化试剂盒纯化。包涵体形式的重组蛋白经初步洗涤纯化后，溶于8M尿素溶液中再用磁珠纯化，然后用稀释法复性。SDS-PAGE分析蛋白纯度，用Western blot方法和不连续非变性凝胶电泳检测表达的融合蛋白活性。将纯化的G22 ScFv蛋白作为抗原接种于BALB／c小鼠背部皮下，共免疫4次，免疫完后分4批取小鼠血清，然后处死小鼠取其脾脏，制备单个脾细胞悬液。用间接ELISA、竞争抑制ELISA测血清抗体，用流式细胞术检测免疫鼠脾细胞的CD4<'+>、CD8<'+>表型变化。 结果：酶切和序列分析表明重组至表达载体pET25b(+)的基因与G22 ScFv基因一致。重组蛋白在原核细胞中以可溶和不可溶两种表达形式存在，但以不溶的包涵体形式为主。低温(30℃)能利于可溶性G22 ScFv融合蛋白的产生，而1mM浓度的IPTG诱导5小时，蛋白总产量可达最高。包涵体形式的G22 ScFv经2％脱氧胆酸钠的初步洗涤，可除去大量的细菌杂蛋白。用His-tag磁珠纯化G22 ScFv，经SDS-PAGE电泳检测纯度可达95％以上。用含有甘油、精氨酸、氧化型和还原型谷胱甘肽的复性缓冲液可利于包涵体的复性。经Western Blot证实G22 ScFv具有抗原特异性：非变性PAGE电泳说明复性后的包涵体有生物活性。融合蛋白免疫小鼠后可诱导产生Ab3，产生的Ab3能竞争性抑制FC2 McAb(针对鼻咽癌的单抗)与鼻咽癌细胞HNE2表面抗原的结合；并可刺激小鼠的脾细胞CD4<'+>T细胞、CD8<'+>T细胞升高。 结论：成功构建了原核表达载体pET25b(+)一G22，并表达出目的蛋白G22 ScFv。较低温度利于可溶性融合蛋白的表达，较高的IPTG浓度可增强目的蛋白表达。包涵体蛋白经变性后，可在体外复性成功。 表达的融合蛋白具有免疫原性。G22抗独特型单链抗体可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，为抗独特型单链抗体的临床应用提供了一定的实验依据。

关键词： EG95基因   霍乱毒素B亚单位   克隆   原核表达   叶绿体基因工程   口服疫苗  

摘要： 细粒棘球蚴病又称囊型包虫病,是由细粒棘球绦虫的续绦期幼虫引起的一种严重危害健康的人畜共患寄生虫病。该病流行于中国,俄罗斯,非洲部分地区,澳大利亚和南美洲南部。疫苗是防治囊型包虫病的一种重要途径,该疫苗研究领域涉及死疫苗、分子疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗和重组伤寒沙门氏杆菌疫苗等。Eg95抗原在细粒棘球绦虫六钩蚴期表达,该基因在所有株系间是高度保守的。Eg95是一种可以诱导机体免疫保护的有效的疫苗候选分子。 霍乱毒素是霍乱弧菌分泌的一种不耐热肠毒素,霍乱毒素B亚单位能与大多数哺乳动物细胞表面都有的神经节苷脂GM1-ganglioside结合,能够激发较强的免疫反应,既可以作为粘膜免疫佐剂,也可以作为抗原的载体蛋白或导向分子。 利用RT-PCR从细粒棘球绦虫六钩蚴中扩增了EG95 cDNA,构建了pUC57/EG95载体。并自霍乱弧菌(菌株)提取DNA并用特异引物扩增出CTxB基因,通过DNA重组技术,构建CTxB与Eg95融合基因,并亚克隆至原核表达载体pET-28a上,构建了原核表达载体pET-28a/Eg95/CTxB,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经抗生素筛选获得重组子。经DNA测序,证明重组质粒序列完全符合预期设计。 重组质粒中的CTxB基因大小为375bp,为了便于构建融合基因,其终止密码子TGA在设计引物时就特意敲除。从六钩蚴中克隆到了EG95 cDNA,序列长度为481bp,包括471 bp的开放阅读框,可表达16.5KDa的EG95抗原,经与Genbank序列比对,发现其与澳大利亚EG95抗原基因序列完全一致。由此,整个CTxB-EG95重组基因长度为846bp,预期表达31KDa的融合蛋白。随后将该表达质粒转化大肠埃希氏菌BL21菌株,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下,重组菌株表达了融合蛋白质。经SDS-PAGE电泳对诱导菌体分离结果显示,重组表达质粒表达了约31KDa的目的条带。Western-blotting试验表明,该融合表达产物可与霍乱毒素抗体特异结合。说明该融合蛋白得到了正确的表达。 用重组质粒pET-28a/Eg95/CTxB克隆融合基因CTxB-Eg95,并酶切连接到含有叶绿体基因rp12-trnH-psbA-trnK、叶绿体PpsbA基因启动子和终止子、选择标记基因aadA的载体pLCT-B,构建了叶绿体转化及表达载体pLCT-B/Eg95/CTxB。通过基因

关键词： 人源抗体   基因工程   噬菌体展示技术   人类免疫缺陷病毒   艾滋病  

摘要： AIDS已经严重威胁着人类的生命健康。尽管许多研究者对AIDS疫苗的研究做出了不少的努力，然而，到目前为止，尚没有一种疫苗在HIV感染的预防控制中获得良好的免疫效果。近年来，有关HIV-1中和抗体在HIV-1感染者体内的作用的研究取得了很大的进展，使许多研究者重新重视对HIV-1中和抗体的研究。目前的许多研究表明，针对HIV的中和表位主要存在于gp160。 本课题运用噬菌体抗体库技术，以期获得人源抗HIV-1gp160基因工程抗体。首先采集具有HIV-1中和抗体的感染者外周血，分离淋巴细胞后提取总RNA，反转录为cDNA第一链，然后利用一组人源抗体IgG1Fab段基因的引物对抗体的重链Fd段和轻链基因分别进行PCR扩增，再将扩增后的轻链、重链基因先后克隆到pComb3X载体，转化***1-Blue，在辅助噬菌体的作用下，构建了噬菌体抗体库，库容为2.07x106，最后用预包被gp160的ELISA板对噬菌体抗体库进行筛选，经过三轮“吸附-洗脱-富集”的筛选过程，将获得的阳性克隆进行诱导表达，表达产物经ELISA检测，结果获得30株抗HIV-1Fab克隆。对所获得的30株阳性克隆的轻链和重链基因进行了测序、运用EMBL-EBI数据库提供的PairwiseAlignmentAlgorithms对所获得的轻链基因序列和重链基因序列进行了同源性比较，结果获得了9条轻链基因(7条为λ链，2条为κ链)，15条重链基因；通过与HIV序列数据库中的基因序列进行比较，发现所获得的基因序列和已经申请专利的部分抗HIV-1gp120抗体的基因序列有较高的同源性(轻链同源性在60～90％之间；重链同源性在68～92％之间)。通过与IMGT抗体数据库中抗体基因标准序列进行比较分析，分析了我们获得的这些阳性克隆的CDRs序列；并对获得的阳性克隆进行了特异性鉴定。 下一步我们将对表达产物进行体外中和试验，对具有中和活性的Fab进行全抗体表达，并进一步研究其特性。

关键词： 猪口蹄疫   基因工程疫苗   控释尿素  

摘要： 中国农大通过基因发现猪高产奥秘通过基因可以发现猪高产的奥秘,还可以据此提高种猪产仔的数量。这项研究成果由中国农业大学生物学院主持完成。该成果总体达到国际领先水平。中国农业大学的专家以国际上繁殖力最高的我国地方品种二花脸猪和欧洲商业品种猪等为研究素材,利用候选基因策略,对2万头

关键词： 水稻   条纹叶枯病   分子标记   数量性状座位(QTL)   RNA干扰   双链RNA   基因工程育种  

摘要： 水稻条纹叶枯病（Rice Stripe Disease）是由水稻条纹病毒（Rice Stripe Virus, RSV）引起的一种危害严重的水稻病毒病,通过灰飞虱刺吸以持久方式传播。该病害在我国最早发生于1963年。从上世纪90年代末开始,由于粳稻品种种植面积不断扩大,再加上种植制度改变和暖冬年份连续出现等因素,使得一度沉寂的水稻条纹叶枯病在江苏等地区又开始普遍发生,造成水稻大面积减产。过去对该病害的防治实践表明,只有培育和使用抗耐病品种才是防治该病最经济有效的途径。而目前使用的抗病品种抗源基础比较狭窄,主要是利用来自巴基斯坦籼稻Modan中的抗病基因Stv-bi,所以为了改变长期依靠单个基因抗性的现状,寻找新的抗病基因、培育优良抗病新品种成为当前防治水稻条纹叶枯病的首要任务。目前主要是通过传统的杂交育种来选育抗病新品种,但效率较低而且抗病鉴定也比较困难,而利用现代的基因工程技术来快速改良高产优质但感病的水稻品种则具有广阔的应用前景。所以本研究围绕条纹叶枯病抗性育种开展了两个方面的研究:一是寻找并定位新的抗病基因;二是利用新的基因工程技术来培育转基因抗病水稻。目前取得的研究结果如下: 1、利用抗病亲本籼稻Dular和感病亲本粳稻Balilla杂交构建的F2无性系群体,在2004和2005年,采用人工接虫传毒试验,分别以株系发病率和病级指数两个指标为表型值,鉴定两个亲本和226个F2无性系对RSV的抗性。利用Windows QTL Cartographer 2.0定位软件对RSV的抗性基因进行检测。以株系发病率为表型值共检测到3个QTLs,分别命名为qSTV-3、qSTV-11b、qSTV-11c。qSTV-3位于3号染色体标记区间RM7324-RM3586,qSTV-11b和qSTV-11c位于11号染色体上两个相邻区间RM287-RM209和RM209-RM21。两年重复试验定位的QTLs位置相同,但三个QTLs的LOD值和贡献率在年度间有差异。在2004年,3个QTLs的LOD值分别为3.08、26.81、22.89,贡献率分别为4.5%、46.73%、41.09%;2005年3个QTLs

关键词： 瑟氏泰勒虫   基因工程疫苗   临床应用试验  

摘要： 瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)病是由泰勒科、泰勒属(Theileria)的瑟氏泰勒虫寄生于牛体内的一种血液原虫病。目前该病主要以药物防治为主，但常用药物在体内有效浓度维持时间短，因此，本试验用其进行了瑟氏泰勒虫hsp-P33油佐剂基因工程疫苗对牛瑟氏泰勒虫病的临床防治研究。试验结果表明，hsp-p33油佐剂疫苗显示出较好的保护力，试验动物没有出现临床症状，通过血液检查，试验动物的PCV、RBC等血液指标均在正常范围内。该疫苗对牛瑟氏泰勒虫的保护期在50天左右。

关键词： 家禽产品   家禽业   兽药残留   禽流感   猪口蹄疫   动物防疫体系   兽医工作   畜牧业   牧业   基因工程疫苗   家禽养殖业   有机乳制品   肉鸡加工   动物疫病防控   消息   新闻   信使  

关键词： 转铁蛋白受体   嵌合抗体   增殖   凋亡   单链抗体   TfRscFv-GAL4融合蛋白   GAL4rec-SurvivinsiRNA-pGes靶向性   内吞作用   基因表达  

摘要： 第一部分抗TfR人鼠嵌合抗体诱导K562细胞凋亡及其机制 【目的】在前期构建与表达抗转铁蛋白受体(TfR)人鼠嵌合抗体，以及研究其肿瘤组织相对特异性分布，并能介导ADCC和CDC效应的基础上，进一步探讨抗TfR人鼠嵌合抗体诱导K562细胞凋亡及其可能机制。 【方法】①复苏液氮中冻存的分泌抗TfR人鼠嵌合抗体的转染瘤细胞，通过G418筛选后，用ELISA检测转染瘤细胞培养上清TfR人鼠嵌合抗体的表达;②将分泌嵌合抗体的转染瘤细胞腹腔注射诱导裸鼠(Balb／c，nu／nu)腹水抗体，并经DEAE-Sephadex A-50离子交换柱层析法纯化;③将抗体以不同浓度与K562细胞孵育，以活细胞计数和MTT法检测其对K562细胞生长与增殖的影响;④用琼脂糖凝胶电泳，透射电镜和Annexin V-PI染色流式细胞术(FCM)检测K562细胞凋亡;⑤PI染色FCM检测抗体对K562细胞周期的影响;⑥采用细胞色素C释放试验和ELISA法检测凋亡细胞胞浆中细胞色素C和活化的caspase-8。 【结果】①1×10个转染瘤细胞在20％FCS的1640培养基中，培养5天的上清中分泌量为0.5μg／ml～5μg／ml。腹水所得纯化的抗体浓度可达1～2mg／ml左右，表明液氮中冻存两年的转染瘤细胞仍能稳定分泌抗TfR的人-鼠嵌合抗体;②抗TfR抗体可明显抑制K562细胞的增殖，在终浓度为25mg／ml到100mg／ml间具有剂量和时间的依赖性;③抗TfR抗体和K562细胞共孵育后，琼脂糖凝胶电泳可见典型的DNA梯形条带;用透射电镜可观察到有凋亡细胞形态学改变，细胞核不规则，核染色质凝集并着边，凋亡小体出现，其内可见染色质现象;FCM检测K562细胞凋亡率为13.08％±2.01％，表明抗TfR抗体能够诱导K562细胞发生凋亡，且具有时间-浓度依赖性;④PI染色流式细胞仪检测发现抗TfR抗体将K562细胞的细胞周期阻止在G1期;⑤细胞凋亡时胞浆中细胞色素C有增加但活化的caspase-8没有增加，表明该抗体通过线粒体死亡途径诱导K562细胞凋亡。 第二部分抗TfR-GAL4融合蛋白的构建、表达与鉴定 【目的】本研究构建TfR-GAL4的表达载体，并研究融合蛋白TfR-GAL4与肿瘤细胞结合的特异性。 【方法】①采用PCR技术从含有抗TfR质粒pUC19中扩增TfR基因片段，双酶切从含有GAL4质粒pABga14中获得GAL4的基因片段，将TfR和GAL4基因片段克隆至pET28a(+)表达载体中，进行测序;②将含抗TfR-GAL4-pET28a重组质粒转化大肠杆菌BL21中IPTG诱导表达;SDS-PAGE电泳及光密度扫描鉴定其表达，体外复性、透析;③采用GAL4抗体ELISA检测复性后的抗TfR-GAL4融合蛋白中GAL4活性;④采用GAL4抗体FCM检测复性后的抗TfR-GAL4融合蛋白与不同肿瘤细胞株的结合，免疫组化染色检测抗TfR-GAL4融合蛋白与胃癌组织芯片和乳腺癌组织芯片的结合特性。 【结果】①重组质粒TfR-GAL4-pET，用NcoⅠ／NotⅠ双酶切，经1％琼脂糖电泳鉴定可见约1200bp的酶切产物，符合融合基因的理论值，登陆http://***/blast分析所得基因序列含有TfR和GAL4序列，阅读框正确;表明重组表达载体TfR-GAL4-pET构建成功;②TfR-GAL4-pET重组表达载体阳性转化菌经IPTG诱导4h和6h时表达量最高，蛋白条带灰度扫描显示该特异性蛋白条带约占菌体总蛋白的45％和42.3％，融合蛋白以包涵体形式表达，分子量约为47KD左右，与理论计算值一致;通过纯化、复性后，所得TfR-GAL4融合蛋白的浓度为1.7mg／ml;③ELISA结果显示，复性后的TfR-GAL4融合蛋白能被鼠源性GAL4抗体特异性识别;表明复性后的TfR-GAL4融合蛋白中GAL4蛋白片段具有与抗体结合活性;④FCM检测结果显示，复性后的TfR-GAL4融合蛋白中TfR能与肿瘤细胞表面FfR结合，在所检测的7种肿瘤细胞株中，抗TfR-GAL4融合蛋白与肿瘤细胞结合率在54.11％到8.23％之间，TfR-GAL4组和鼠源性抗TfR抗体与各种肿瘤细胞的结合率无明显差别;组织芯片免疫组化技术检测结果显示，复性后的TfR-GAL4融合蛋白和鼠源性抗TfR抗体均能与胃癌组织芯片与乳腺癌组织芯片特异性结合，染色后胃癌组织芯片阳性率分别为75.32％和78.46％，乳腺癌两张组织芯片阳性率分别为63.25％和64.57％;在正常组织中除5例肝组织中为弱阳性外，在心、脾、肾上腺皮质、血管中均为阴性。以上结果表明，复性后的TfR-GAL4融合蛋白中TfR蛋白片段具有与肿瘤细胞结合的特异性。 第三部分TfR-GAL4融合

关键词： 自主创新能力   科技创新能力   基因工程疫苗   口蹄疫病毒   鼻病毒   创新型城市   激光照排系统   杂交小麦   城市综合竞争力   沈阳建筑大学   人才发展战略   小麦高产   重大专项   建筑节能   资讯  

关键词： 狮头鹅   岭南黄鸡   肌肉生长抑制激素   克隆   表达   猪基因工程疫苗   研制  

摘要： 肌肉生长抑制激素(myostatin，MSTN)是骨骼肌的负调控因子，是影响肌肉生长与发育的重要因素。为了促进猪生长后期肌肉的快速增长，就需要消除MSTN对肌肉的负调控作用。本研究通过基因工程的手段，从狮头鹅大腿肌肉中获得MSTN作为免疫原，并采用不同的免疫佐剂，制备了肌肉生长抑制激素的基因工程疫苗，对生长肥育猪进行主动免疫，使猪产生抗MSTN抗体，以颉颃体内产生的肌肉生长抑制激素，促进猪肌肉的生长，并分别比较以油乳剂和脂质体为免疫佐剂的两种疫苗免疫效果。 1．狮头鹅肌肉生长抑制素基因成熟肽的克隆及其在大肠杆菌中的表达 根据扩增的狮头鹅的MSTN基因cDNA全长序列以及成熟肽序列，设计一对引物，并分别在两引物前设计2个酶切位点BamH Ⅰ和Sac Ⅰ，亚克隆狮头鹅肌肉生长抑制激素的成熟肽蛋白编码基因，然后将特异性片段连接到pMD18-T载体，经酶切、PCR鉴定后，构建了狮头鹅原核单纯表达载体pRSETA-MSTN-m，经测序鉴定表明所克隆的MSTN成熟肽基因与Genebank上发表的鸡(AF019621)、猪(AY208121)和家鹅(AF440862)的MSTN-m核苷酸序列同源性分别可达到92％、88％、99％。而翻译后的成熟蛋白氨基酸序列与鸡、猪和家鹅的同源性可以分别达到100％、100％及99.1％，通过IPTG诱导表达重组MSTN-m成熟蛋白，经SDS-PAGE电泳分析，原核表达产物为18.5KD的重组蛋白，为下一步制作促进猪肌肉生长的基因工程疫苗奠定了基础。 ***重组蛋白的变、复性研究及Western-blotting试验 在重组MSTN-m获得表达的基础上，收集诱导表达4h的大肠杆菌BL21(DE3)菌液，用高浓度的尿素液裂解及溶解包涵体，经SDS-PAGE电泳显示，上清中有大量的表达的目的蛋白，然后经过Ni-NTA Resin对带有6个组氨酸标签的目的蛋白纯化，SDS-PAGE电泳显示纯化效果比较理想。随后进行了Western-blotting试验鉴定，证实所表达蛋白即为MSTN成熟肽蛋白，并具有免疫原性。 3．岭南黄鸡肌肉生长抑制素基因成熟肽的克隆及其真核表达载体的构建 根据Genebank上登录的鸡的MSTN基因cDNA全长序列以及成熟肽序列设计一对引物，并分别在两引物前设计2个酶切位点EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ，亚克隆岭南黄鸡肌肉生长抑制激素的成熟肽蛋白编码基因，然后将特异性片段连接到pMD18-T载体，经酶切、PCR鉴定，构建了岭南黄鸡真核单纯表达载体pPICZαA-MSTN-m。经测序