关键词： 高新技术   科学技术   液晶电视   视频领域   青光眼   猪口蹄疫   信息技术应用   宽带接入   卵寄生蜂   IPTV   信息产业部   新粒子   基因工程疫苗  

摘要： IT AVS 国标定局 IPTV 发展进入加速轨道近日,中国音、视频领域的第一个民族标准 AVS 已经获得信息产业部的批准。业界预测,这一标准的确立将大大推动中国 IPTV 的进程。“十一五”规划建议中,国家强调要增强自主创新能力,并且明确了对自主重点技术标准的扶持态度,除软件、芯片外,数字音视频技术名列第三。中国音、视频领域的第一族标准 AVS 获得信息产业部的批准,正是我国民族技术自主创新能力得到提高的体现。在编码效率上,AVS 比传统的 MPEG-2效率高了二至三倍,在计算资源的消耗上降低了30％-50％。AVS 除了技术先进、性能稳定之外,重要的是其拥有完全自主知识产权,在专利费用方面远远比 MPEG-4和 H.264这两种国际标准要低。

关键词： CD2   OX34   单克隆抗体   可变区基因   克隆   表达   Fab   嵌合抗体   嵌合Fab  

摘要： 目的：本实验设计引物分别克隆抗人CD2单抗OX34 Fd和轻链基因以及轻、重链可变区基因V和V，然后将OX34 Fd和轻链基因克隆入噬菌体展示载体pComb3;将轻、重链可变区基因V和V先后克隆入人-鼠嵌合Fab抗体的通用噬菌体展示载体pComb3C，得到OX34的Fab片段抗体展示载体pComb3／Fab-gⅢ和嵌合Fab片段抗体展示载体pComb3C／cFab-gⅢ，以噬菌体展示Fab抗体的形式对其特异性和亲和力进行验证。之后，切除载体gⅢ序列，构建成OX34—Fab和OX34—cFab的分泌性表达载体，在大肠杆菌中进行诱导表达、纯化，并进行初步的功能鉴定。 方法： 1、鼠抗人CD2抗体轻、重链基因片段的扩增 从杂交瘤细胞株中提取总RNA。设计引物，利用RT-PCR扩增抗体Fd和轻链基因以及轻、重链可变区基因V和V，得到目的片段。分别连入pMD18—T载体后，进行序列测定，并利用相应的软件对序列进行分析。 2、鼠抗人CD2 Fab片段抗体的制备 将轻链及Fd基因依次克隆到载体pComb3中，建成噬菌体表达载体pComb3／Fab-gⅢ。转化大肠杆菌XL1-blue，并利用辅助噬菌体M13K07进行挽救，得到噬菌体展示Fab抗

关键词： 体细胞克隆   克隆牛   胚胎移植   首例   犊牛   卵移   基因工程疫苗   小猪   鼻病毒   口蹄疫病毒   超量排卵   超数排卵   流感病毒群   禽流感病毒   科技动态   超快速冷冻   禽类  

关键词： 猪水肿病   产类志贺毒素大肠杆菌   ELISA   SLT-IIeB基因   表达   基因工程亚单位疫苗   免疫原性  

摘要： 猪水肿病(Porcine Edema disease，ED)是仔猪常见的一种急性致死性传染病，主要由某些特定血清型产类志贺毒素大肠杆菌(Shiga-like toxin Escherichia coli，SLTEC)引起的肠毒血症。以胃大弯、肠系膜及脑部水肿为特征，常伴有共济失调、麻痹或惊厥等神经症状，主要发生于断奶仔猪。采食量大、生长快、体况健壮的猪最为常见。发病率通常为10％～35％，病死率可高达90％。猪群水肿病血清抗体的检测对预防和控制该病的爆发具有十分重要的意义。类志贺毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)是直接导致猪水肿病发生的主要毒力因子，其是由一分子A亚基和5分子的B亚基共同组成的聚合体。A亚基是该毒素的主要毒力亚单位，为毒素的酶活性部位，具有细胞毒性作用。B亚基没有毒性而具有免疫原性，是水肿病毒素的主要保护性抗原。本研究是针对SLT-Ⅱe的B亚基，初步建立一种特异、敏感、能对所有血清型猪水肿病大肠杆菌做出检测的血清学检测方法，为新型疫苗的研究奠定基础。 ***-ⅡeB、SLT-Ⅱe3B基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 参照国外报道的Escherichia coli S1191菌株(M21534)，设计了两对特异性引物，以本地分离的猪水肿病大肠杆菌鄂E(Ee)株基因组为模板，PCR扩增出去掉信号肽和跨膜区的类志贺毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)B亚基的序列，再利用限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ将SLT-ⅡeB基因融和串联起来，筛选得到一个三拷贝SLT-ⅡeB基因。将单拷贝和三拷贝SLT-ⅡeB基因克隆到原核表达载体pGEX-KG，构建重组质粒pGEX-SLT-ⅡeB和pGEX-SLT-Ⅱe3B。序列测定证实，SLT-ⅡeB基因全长204bp，编码68个氨基酸，未发生任何碱基突变，与NCBI上所发表的12个SLT-ⅡeB序列：AY368993、AY332411、X81417、X81416、X81415、AJ567999、AJ567998、AJ298298、AJ249351、AB252836、M36727、M21534核苷酸同源性都是100％。SLT-Ⅱe3B基因全长630bp，编码210个氨基酸，与GenBank中M21534的序列同源性达到99.9％，只有第536处的点突变，由C变成T(C→T)，相应的氨基酸序列由脯氨酸突变为亮氨酸(P→L)。原核表达载体pGEX-SLT-ⅡeB、pGEX-SLT-Ⅱe3B转化*** BL21(DE3)，在IPTG诱导下获得表达，大小与预期结果相符。表达产物均以包涵体形式产生，通过提取包涵体——十二烷基肌氨酸钠变性——透析复性的生化提纯步骤来获取有生物学活性的重组蛋白。Western blot检测证实表达蛋白与猪水肿病标准阳性血清反应，具有良好的免疫学活性。同时用表达产物免疫SPF昆明系小鼠能够诱导产生较高水平的抗体，为亚单位疫苗的研究奠定基础。 2．猪水肿病SLT-Ⅱe3B-ELISA诊断方法的建立 将经纯化、变性、复性等处理后的GST-SLT-Ⅱe3B蛋白作为抗原，包被ELISA

关键词： 结核杆菌热休克蛋白70   乙型脑炎   E蛋白主要抗原片段   中和表位   Th1反应  

摘要： 流行性乙型脑炎（简称乙脑）属于黄病毒科，引起人类或马的中枢神经系统感染以及猪的流产，能通过持续感染的蚊子传播给人，并且主要在脊椎动物宿主内存在，特别是具有较高病毒血症的猪和鸟类，在人类乙脑主要引起致死率较高的脑炎，致死率从20-50％，但是绝大多数的幸存者都具有中枢神经系统的后遗症;在家养动物如猪和马，主要引起脑炎，流产甚至死亡。与黄病毒科的其它成员类似，为单链正股RNA，长度为11kb，编码一个含多聚蛋白的开放性阅读框，这个多聚蛋白可通过蛋白酶切割成至少11个蛋白，该病毒的结构蛋白包括衣壳蛋白，膜蛋白和囊膜蛋白，位于5’端三分之一的区域，而非结构蛋白从NS1到NS5位于阅读框其余的区域。 目前用于猪的乙脑疫苗包括弱毒苗和灭活苗，但是有关它们的安全性，生产和使用费用等问题越来越突出。WHO正在呼吁改善和研制新型乙脑疫苗，乙脑病毒的E蛋白与病毒和细胞受体结合，膜融合有关，也是引起中和抗体及宿主保护的主要免疫蛋白。结核杆菌热休克蛋白70具有分子佐剂和载体效应，是结核杆菌的主要抗原成分之一，可诱导和增强机体体液免疫和细胞免疫的发生，因此用该基因与一些传染病或寄生虫病病原体的抗原基因融合表达以制备疫苗，借助它的载体分子效应和佐剂作用，以提高病原体抗原的免疫原性和疫苗的免疫预防效果。 本文将结核杆菌热休克蛋白70与乙型脑炎E蛋白主要抗原片段在毕赤酵母中进行融合表达免疫小鼠，用以研究hsp70对免疫反应的影响，此外还对结核杆菌hsp70与抗原肽以何种方式共同作用才能发挥其佐剂效应进行了研究，根据报道结核杆菌hsp70分为两个区域，N末端为ATPase区，C末端为肽连接区，其中肽连接区为hsp70中真正行使佐剂功能的区域，因此本文将E蛋白主要抗原片段与肽连接区进行融合表达并免疫，研究肽连接区的分子佐剂功能;另外，将已报道的E蛋白上的中和表位与结核杆菌hsp70在大肠杆菌中融合表达，将其免疫效果与乙脑弱毒苗SA14-14-2进行比较。实验结果如下： 1，结核杆菌热休克蛋白70及其功能域肽连接区对乙型脑炎E蛋白主要抗原片段引起的免疫反应的影响。 在本实验室已构建的原核表达载体（含乙脑疫苗株SA14-14-2株E蛋白基因主要抗原片段）的基础上用巴斯德毕赤酵母系统表达，该片段长1113bp，编码371个氨基

关键词： 科技新闻   科技报道   技术发展规划   基因工程疫苗   高原铁路   自主创新能力   北京谱仪   新粒子   细胞库  

关键词： 猪2型圆环病毒   ORF2基因   表达   重组伪狂犬病病毒   二价基因工程疫苗   免疫原性  

摘要： 猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)不仅可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)，而且也与猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、猪先天性震擅、母猪繁殖障碍、猪增生性和坏死性肺炎等疾病密切相关。自从19世纪90年代发现可致猪的疾病以来，PCV2病毒在世界各国迅速蔓延。目前PCV2在猪群的感染率非常高，造成猪的生长缓慢，饲料报酬下降，同时侵害猪的免疫系统，导致猪的免疫机能下降，造成其它疾病的大暴发，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。我国也于2000年检测到了该病毒的存在，该病毒在我国猪群的感染率近乎50％，给我国的养猪业也造成了严重的打击。目前对于该病毒的防制主要是依靠疫苗，而由于该病毒在细胞上增殖滴度很低，发展传统的灭活疫苗和弱毒疫苗非常困难，因此用现代基因工程手段构建的第二代新型疫苗，必然在该病毒的防制上具有重要作用。本研究以编码PCV2核衣壳蛋白的ORF2基因为研究对象，实现了ORF2基因在真核细胞中的表达，并进一步将ORF2基因插入核酸疫苗载体构建了ORF2基因的核酸疫苗和“自杀性”DNA疫苗;同时将具有蛋白转导功能的BVP22基因与ORF2基因在核酸疫苗和“自杀性”DNA疫苗中融合表达，通过蛋白转导增强疫苗的免疫效应;以伪狂犬病毒弱毒株TK/gE/LacZ为亲本毒，构建了表达ORF2基因的重组伪狂犬病毒TK儋E/ORF2;同时对构建的PCV2疫苗进行了动物试验，以探索一种可用于PCV2防制的新型疫苗。 ***2 ORF2及BHV-1 VP22基因在真核细胞中的表达及定位研究 通过PCR方法扩增PCV2 ORF2基因和BHV-1 VP22基因，将扩增的基因连入T载体克隆测序后，用HindⅢ和BglⅡ双酶切将ORF2基因切下，连入pEGFP-N1载体的HindⅢ肌和BamHⅠ双酶切位点，得到ORF2基因的真核表达质粒pNORF2。用BamHⅠ和BglⅡ将BVP22基因从T载体上切下，连入pEGFP-NI载体的BamHⅠ位点，得到BVP22基因的真核表达质粒pNBVP22。通过脂质体转染的方法，将pEGFP-N1、pNORF2和pNBVP22质粒分别转染到Hela细胞中，转染18 h后在倒置荧光显微镜下观察荧光，可见转染pNORF2的Hela细胞有绿色荧光表达，且明显分布于核周，转染pNBVP22的细胞也有荧光表达，荧光主要分布于核周，而在细胞质中也发现有大量的荧光，转染pEGFP-N1的细胞则在整个细胞都可见散在荧光。以上结果说明了我们克隆的ORF2基因、BVP22基因在真核细胞中成功表达，为基因工程疫苗的研究奠定了基础。 ***2核酸疫苗的构建、免疫效应研究，以及BVP22基因免疫增强效应研究 PCR扩增PCV2 ORF2和BVP22基因，将ORF2基因克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+)，构建了PCV2的核酸疫苗pCORF2，同时分别将具有蛋白转导功能的BVP22基因分别克隆到ORF2基因的上游和下游，使二者融合表达，构建pCORF2BVP22、pCBVP22ORF2质粒。将上述质粒以及空载体pCDNA3.1肌肉免疫BALB/c小白鼠，共免疫2次，间隔2周，分别于首免后2周和二免后4周采血，用ELISA法检测体液抗体。实验结果显示，通过两次免疫后，加入蛋白转导的核酸疫苗组产生了PCV2特异性抗体，而单独用ORF2基因构建的核酸疫苗的免疫原性比较弱，证明BVP22可增强核酸疫苗的免疫效果，其中以BVP22在ORF2上游效果更好，可作为PCV2防制的一种候选疫苗 ***2“自杀性”DNA疫苗的构建、免疫效应研究，以及BVP22在“自杀性”DNA疫苗中的免增强效应研究 将PCV2 ORF2基因克隆到“自杀性”DNA疫苗载体pSCA1和pSHAME2a，构建了ORF2的“自杀性”DNA疫苗pSORF2和pMORF2。进一步将BVP22基因插入ORF2基因的上游，构建了pSBVP22ORF2、pMBVP22ORF2“自杀性”DNA疫苗载体。肌肉注射免疫BALB/c小白鼠，首免后2周加强免疫一次，分别于首免后2周和6周采血，用ELISA方法检测血清体液抗体水平。从ELISA检测结果可以看出，一次免疫后2周即可刺激小白鼠产生针对PCV2的特异性体液抗体，而BVP22蛋白转导的效果在“自杀性”DNA疫苗中的效果并不明显。 4．表达PCV2 ORF2基因的重组伪狂犬疫苗毒株的构建 将ORF2基因插入伪狂犬病毒重组转移载体plECMV，构建ORF2基因的重组转移质粒pIEORF2。用EcoRⅠ酶切伪狂犬病毒疫苗株Tk/gE/LacZ基因组，与重组转移质粒pIEORF2共转染IBRS-2细胞。收集病变细胞，经空斑纯化和PCR筛选，获得了新的重组病毒Tk/gE

关键词： 口蹄疫病毒   动物保健   杂志社   鼻病毒   期刊社   出版社   替米考星   兽药   猪口蹄疫   基因工程疫苗   营养机理   口蹄疫疫苗   禽流感   共轭亚油酸   金丝桃素  

关键词： 肉毒毒素   表位   噬菌体展示   中和抗体  

摘要： 肉毒神经毒素(Clostridium botulinum neurotoxins BoNT)是由肉毒梭菌产生的目前已知毒力最强的毒素蛋白。成熟的毒素分子是由二硫键连接的重链与轻链组成。现有的研究证明BoNT的重链可诱导机体产生具有保护作用的中和抗体，但其抗原表位的定位尚不清楚，本研究的目的即通过生物信息学手段进行表位预测，尝试建立基于表位预测的快速获得针对表位肽的特异性抗体的技术路线，为抗B型肉毒毒素基因工程抗体的研究提供新的思路。 本研究首先应用生物信息学手段，根据B型肉毒毒素重链的一级结构，利用ANTHWINE，Goldkey等分析软件，结合网络服务器，综合参考亲水性，可及性，柔韧性，及二级结构等多种参数预测合成了8条表位肽序列，体内外的免疫学试验证明8条表位肽均具有免疫原性及免疫反应性，是很好的免疫原，表位肽免疫的小鼠可不同程度抵御毒素分子的攻击。 在表位预测的基础上，利用噬菌体展示技术，以表位肽为免疫原，免疫BALB／C小鼠，取脾淋巴细胞，克隆全套抗体可变区基因，利用序列重叠延伸法，按VH-linker-VL的拼接方式，通过20次电转化构建了库容为1.6×10的单链抗体免疫文库。以表位肽为筛选靶标，通过3-4轮的富集筛选及竞争抑制实验得到与表位肽特异结合的噬菌体单链抗体。其中针对6，7，8号表位肽的噬菌体单链抗体ScFv-P6-12，ScFv-P7-8，ScFv-P8-12可延长100LDBoNT／B攻击小鼠的死亡时间，具有中和保护作用。 将筛选到的一株针对P8表位肽的单链抗体ScFv-P8-12与MBP融合表达，通过与人源抗体的同源比对，结合计算机辅助设计及PCR点突变技术，替换框架区中与人源抗体差异较大同时不影响CDR功能的残基，对融合抗体进行初步的人源化改造。改造后的抗体保持亲本抗体的结合活性及对动物的中和保护作用，利用SPR技术经BIAcore仪器分析表明改造后抗体的亲和力为1.34×10M。以上研究表明，

关键词： 基因工程抗体   Anti-HBsAg   Fab   分离纯化   组合层析  

摘要： 目的： 寻找一套适合重组基因工程抗体Anti-HBsAg Fab的分离纯化路线，为Anti-HBsAg Fab后期产业化生产奠定理论基础。 方法： 1．选择和验证阳离子交换介质(Streamline SP)从大肠杆菌中初步分离纯化Anti-HBsAg Fab最适吸附条件：利用试管法分别测定平衡缓冲液在不同pH和不同离子强度下阳离子交换介质Streamline SP对预分离纯化蛋白的吸附效果，分别用1mlSP预装柱及自装28ml Streamline SP柱进行离子交换层析以验证吸附效果。 2．选择及验证疏水作用层析初步纯化Anti-HBsAg Fab的适宜条件：利用1ml疏水介质预装柱试剂盒选择纯化Anti-HBsAg Fab的最佳疏水介质，确定疏水介质之后，利用1ml Phenyl Sepharose high sub疏水预装柱选择疏水作用层析的适宜纯化条件，最后，在小试规模的水平上验证疏水作用层析分离纯化Anti-HBsAg Fab的可行性。 3．小试规模非特异组合层析分离纯化基因工程抗体Anti-HBsAg Fab初步尝试：按实验设计的扩张柱床阳离子吸附层析——疏水作用层析——凝胶过滤层析非特异组合层析性纯化工艺路线分离纯化Anti-HBsAg Fab。 结果： 1．用阳离子交换介质(Streamline SP)从大肠杆菌中初步分离纯化