关键词： 基因工程抗体   单链抗体   原核表达   纯化   复性  

摘要： 单链抗体是利用基因工程方法使抗体重链可变区(V)和轻链可变区(V)通过一段约5-25个aa的连接肽,首尾拼接而成的重组蛋白。本实验所研究的抗肺癌单链抗体(LC-1 single-chain FV,LC-1 ScFv)是由抗肺癌杂交瘤细胞株(LC-1)分泌的单克隆抗体经过基因改造得到的,是具有与抗原结合能力的最小抗体片段。目前,由于单链抗体的优越性,它在许多肿瘤疾病的临床诊断及免疫治疗中已经取得广泛的应用,如体内显像、放射免疫治疗、免疫毒素治疗等。本实验的目的是利用基因工程技术获得有活性的抗肺癌单链抗体。 本实验从高分泌量和活力较高的抗肺癌杂交瘤单克隆细胞株中抽提总RNA,反转录成cDNA。设计引物从cDNA中PCR克隆出抗体的重链和轻链基因,克隆到T载体保存并测序,并且通过酶切鉴定。将重链和轻链基因经重叠延伸PCR法构建为单链抗体形式,回收并与T载体连接,转化大肠杆菌。以上游引物Vsbak和下游引物Vsfor为引物,以T-ScFv’为模板PCR,对单链抗体基因进行改造得到ScFv。回收PCR产物,酶切后连接于pET-22b(+)质粒构建成pET22-ScFv质粒。转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后,重组蛋白得到高效表达而形成包涵体。抽提包涵体蛋白,得到较纯的目的蛋白,通过蛋白复性技术使之复性,本文对复性条件进行了摸索。用Ni-NTA树脂纯化出目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析其纯度,并初步分析目的蛋白活性。竞争ELISA实验表明产物具有与天然抗体相近的活力。 本实验成功地构建了pET22-ScFv基因,然后利用大肠杆菌表达系统以包涵体的形式表达了pET22-ScFv蛋白,表达产物为分子量31kD左右的蛋白分子,与预期一致。大量表达目的蛋白,并对表达的蛋白质进行了纯化和复性,获得了具有与天热抗体相近活力的LC-1 ScFv。 本实验获得了能够与LC-1肺腺癌单抗相关抗原反应的ScFv,从而为其靶向诊断、治疗及进一步基因工程改造奠定了基础。此外,我们还可以应用基因工程技术得到ScFv融合蛋白,它和ScFv一样能在各个表达系统中得到有效的表达,可以大规模生产抗体融合蛋白,具有很大的应用潜力。

关键词： 猪口蹄疫   科技动态   饲料添加剂   特种饲料   基因工程疫苗   食品安全   抗菌剂   左旋咪唑   英国   大不列颠及北爱尔兰联合王国  

关键词： 猪口蹄疫   零排放   注册证书   基因工程疫苗   生猪产品   口蹄疫病毒   鼻病毒   畜禽粪便   兽药残留   农产品流通企业   家畜传染病   猪肉质量   新兽药   克一   产地认定   行业动态  

摘要： 猪口蹄疫基因工程疫苗获“一类新兽药注册证书” 2006年2月22日,由复旦大学、上海市农业科学院、浙江省农业科学院和中国农科院兰州兽医研究所合作完成的“猪口蹄疫O型基因工程疫苗”,在上海复旦大学通过成果鉴定,并获得农业部颁发的“一类新兽药注册证书”。该项技术成果是国内外首先研制成功的可应用于商业化生产的猪口蹄疫O型基因工程疫苗。口蹄疫被国际兽疫局列为A类家畜传染病,危害牛、猪、羊等偶蹄类动物,传播迅速、感染率高,一旦暴发疫情造成的

关键词： 动物福利法   养猪业   种猪场   基因工程疫苗   猪口蹄疫   畜禽产品   中国农业科学院  

关键词： 肝细胞生长因子受体   噬菌体抗体库   亲和力成熟   内化抗体  

摘要： 随着恶性肿瘤对人类健康威胁的加剧，抗肿瘤研究已成为当今生命科学中极富挑战性且意义重大的领域。其中生物治疗作为手术、化疗和放疗等传统疗法外的第四种治疗手段，在肿瘤的综合治疗中发挥着愈来愈大的作用。研究发掘选择性作用于特定靶点的高效、低毒、特异性强的新型抗癌药物是当今抗肿瘤药物研究的重要方向。而以酪氨酸激酶为靶点的药物研发已成为国际抗肿瘤药物研究的热点，为此投入的研究经费也是其它任何一个非传统的肿瘤靶点药物研究所无法匹敌的。 蛋白酪氨酸激酶可分为受体型和非受体型两种，它们能催化ATP上的磷酸基转移到许多重要蛋白质的酪氨酸残基上，使其发生磷酸化。蛋白酪氨酸激酶在细胞内的信号通路中占据十分重要的地位，参与调节细胞的生长、分化、死亡等一系列生理过程。蛋白酪氨酸激酶功能的失调会引发生物体内的一系列疾病。已有的资料表明，超过50％的原癌基因和癌基因产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性，它们的异常表达将引起细胞增殖调控发生紊乱，进而导致肿瘤发生。此外，酪氨酸激酶的异常表达还与肿瘤的侵润和转移、肿瘤新生血管的生成、肿瘤的化疗抗性密切相关。

关键词： 蛇毒毒素   毒素蛋白   基因表达  

摘要： 巴斯德毕赤甲醇营养型酵母（Pichia Pastoris）属于低等的真核表达系统，与其他表达系统相比，具有遗传操作简单、蛋白折叠和二硫键加工能力较强、易于高密度发酵、蛋白表达量较高等优点，已经成为重组蛋白研究和商业化生产的重要表达系统之一。本论文讨论了抗ErbB2基因工程抗体和重组蛇毒毒素蛋白在毕赤酵母中表达，以及结构和功能关系研究中，主要包括以下三部分内容： 1．密码子优化的抗ErbB2单链抗体在Pichia中表达、纯化和活性鉴定。ErbB2／HER2／P185属于具有酪氨酸激酶的表皮生长因子受体家族，在细胞生长发育和组织分化中起到了重要作用，ErbB2过表达经常在细胞癌化和肿瘤发生中起关键的作用，因此成为肿瘤诊断和治疗的一个重要靶分子。本实验室研制了一株具有肿瘤生长抑制活性的抗ErbB2单克隆抗体mA21，并且构建和表达了工程化的单链嵌和抗体chA21。本研究就是在前期工作基础上合成了密码子优化的单链抗体scFv全基因，并且在Pichia酵母中获得了高效表达，进一步优化表达条件后单链抗体表达量达到了10mg/L。单链抗体经Ni2+亲和柱一步纯化后，即可用于晶体生长、亲和力测定等结构和功能研究。 2．抗ErbB2胞外区抗体A21的表位鉴定、晶体结构分析和抗肿瘤机理的初步研究。我们联合使用噬菌体随机肽库表面展示技术、抗原在原核系统中分段表达、抗原点突变扫描等实验精细测定了A21抗体识别的抗原表位和关键性残基。在蛋白质结构晶体实验室的帮组下解析了A21单链抗体2.1A分辨率的晶体结构。并且利用大分子对接软件，基于实验结果预测并验证了A21抗体与ErbB2抗原可能的相互作用模型。结果显示A21抗体主要识别ErbB2胞外区靠近N端I区的空间表位。我们还测定了A21抗体对肿瘤细胞株的增殖抑制活性、抗体的内吞作用、抗体对ErbB2磷酸化的影响、以及抗体诱导的ErbB2受体下调作用，进一步解释了A21抗体表位和抗体功能之间的联系。 3．重组蛇毒C型凝集素类似蛋白ACFI在Pichia酵母中表达、纯化和结构功能关系研究。蛇毒C型凝集素类似蛋白具有非常相似的二硫键连接的异二聚体结构，但是具有多种不同的生物学功能。ACFI是从皖南尖吻蝮蛇蛇毒中分离到的一种可以与凝血因子结合的具有抗凝活性的C型凝集素类似蛋白。我们设计了一种新的共转化策略，使用两个不同抗生素选择标记的载体用于筛选ACFI两个亚基共表达的重组菌株。结果显示，重组ACFI亚基在Pichia酵母中单独表达时形成同二聚体，共表达时则可以形成异二聚体。重组ACFI具有与天然蛋白类似的凝血因子结合活性和抗凝活性，但是重组亚基却没有这些功能，说明ACFI两个亚基对维持其正常的生物学功能具有非常重要和不可替代的作用。我们的结果提示Pichia系统在蛇毒C型凝集素类似蛋白结构和功能关系的研究中具有重要的应用价值。

关键词： 仙居鸡   猪口蹄疫   黄羽肉鸡   科技简讯   基因工程疫苗   新鲜胚胎移植  

关键词： SARS冠状病毒   S蛋白   抗原表位   嵌合抗原基因   基因工程疫苗  

摘要： 目的 严重急性呼吸道综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)是一种新型急性传染性疾病,它的高死亡率严重威胁着人类的健康,在2004年仍有病例散发。其病原体是一种新的冠状病毒(SARS Coronavirus,SARS-CoV),来源于野生动物,SARS-CoV是单股正链RNA病毒,基因组全长约29.7kb,纤突蛋白(S)、囊膜蛋白(E)、基质蛋白(M)、及核衣壳蛋白(N)是它的主要结构蛋白。其中S蛋白是SARS-CoV主要的膜结合蛋白,为Ⅰ型跨膜糖蛋白,在致病过程中S蛋白是主要的毒力因子,在病毒吸附细胞受体、细胞融合及诱导中和抗体产生过程中发挥关键作用。为了预防SARS的再次流行,人们迫切需要一种安全有效的疫苗早日研制成功。目前有许多候选疫苗进入临床前研究,例如:灭活疫苗,DNA疫苗,多肽疫苗等。我们的实验是通过网络数据库结合生物信息学软件分析的方法,确定S蛋白中可能在SARS-CoV感染过程中起重要作用并具有较好抗原性参数的结构区域作为候选抗原表位,人工合成嵌合基因,体外表达后免疫家兔,为抗SARS基因工程疫苗的深入研究提供实验依据。 方法 1.抗原表位预测 运用生物信息学对SARS-CoV S蛋白的二级结构,亲水性,穿膜螺旋,N-糖基化位点,氨基酸序列的亲疏水性,表面可及性,分子刚性及抗原性参数进行预测分析,设计抗原表位多肽。 2.基因合成和测序鉴定 设计串联多表位的嵌合基因,命名为CAG,全长1274 bp由大连TaKaRa公司合成及测序验证。 ***嵌合基因的扩增

关键词： 阿尔茨海默病   β-淀粉样蛋白   B细胞表位   基因工程疫苗   老年性痴呆   原核表达  

摘要： 老年性痴呆(Alzheimerdisease，AD)是以认知功能障碍为主的中枢神经系统慢性退行性疾病。它的主要病理特征是脑内细胞外老年斑沉积、细胞内神经纤维缠结以及神经元丢失。关于AD的发病机制有多种假说，而其中的Aβ毒性学说是大多数人所认可的。 针对Aβ与AD的关系，人们提出了AD的免疫治疗。1999年Schenk等人用Aβ42免疫治疗AD转基因动物模型，产生了特异性的抗Aβ42抗体，阻止和减少了淀粉样斑块的形成，而且提高接种鼠的认知能力。随后其他实验室也证实Aβ42免疫的有效性。但是2002年以Aβ42为疫苗的临床Ⅱ期实验中，约6％病人出现了脑膜脑炎症状。分析认为，Aβ42肽C末端的T细胞表位激发了Th1反应从而出现炎症反应。因此在随后的研究中，为了避免T细胞抗原表位激发的Th1反应，研究者又提出用Aβ亚单位疫苗治疗AD。 在实验室的前期工作基础上，本实验优化制备和纯化了Aβ亚单位疫苗。在设计时为了避免细胞免疫反应保证强的体液免疫反应，去除了Aβ的T细胞抗原表位保留了Aβ的B细胞抗原表位，并用多个重复B细胞抗原表位增加抗原的免疫原性；去除了目的基因前面的一段载体序列。选用更理想的纯化标签和载体来优化构建原核表达载体，使能更快速和简便纯化获得目的蛋白。 材料与方法 1.原核表达载体pQE-4×Aβ1-15-O的优化构建及鉴定 根据人Aβ42的第1-15个氨基酸序列即Aβ1-15的氨基酸序列，选用大肠杆菌优选密码子，设计目的基因序列。目的基因序列用柔性肽连接四个Aβ1-15组成，前面两个Aβ1-15和后面两个Aβ1-15都是由两个甘氨基酸即Gly-Gly连接，中间的两个Aβ1-15之间由甘氨酸和丝氨基酸即Gly-Ser-Ser-Gly连接。用两对引物分别扩增前面两个Aβ1-15和后面两个Aβ1-15，获得基因片断。将两个目的基因片段纯化后分别克隆入pGEM-TEasy载体，转化感受态细菌后挑取阳性菌落扩大培养，基因测序及提取质粒酶切鉴定得到重组质粒。将从阳性重组质粒中纯化酶切出的目的基因片段后面两个Aβ1-15克隆入原核表达质粒pQE-30a中，转化至感受态细菌挑取阳性克隆培养，提取质粒经酶切鉴定得到阳性重组载体。之后纯化酶切出目的基因片段前面两个Aβ1-15，和用同样的酶酶切纯化的后面两个Aβ1-15和质粒pQE-30的阳性重组载体，在连接酶的作用下连接，转化至感受态细菌EcoliDH5α挑取阳性克隆培养，提取质粒酶切鉴定得到重组表达载体pQE-4×Aβ1-15-O。 2.重组表达载体pQE-4×Aβ1-is-O的原核表达 制备***15感受态细胞，从***5α菌中提取重组原核表达载体pQE-4×Aβ1-15-O，纯化后转化入***15中，优化表达条件，用1mmol/L的IPTG浓度和在30℃条件下诱导表达，表达后超声破碎裂解菌体，取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳及Western-Blotting鉴定。 3.目的蛋白的小量纯化及鉴定 培养100ml细菌诱导表达，表达后超声破碎裂解菌体，用his-tagNi2+亲和纯化树脂进行金属亲和层析纯化获得目的蛋白4×Aβ1-15，将目的蛋白用SDS-PAGE电泳观察其纯度，用Western-Blotting鉴定其免疫反应性。 结果 1.构建了原核表达载体pQE-4×Aβ1-15-OPCR扩增获得目的基因片断1-2×Aβ1-15和2-2×Aβ1-15，目的基因片断T/A克隆后酶切和测序鉴定得到阳性重组载体pGEM-T-1-2×Aβ1-15和pGEM-T-2-2×Aβ1-15。从pGEM-T-2-2×Aβ1-15酶切得到的2-2×Aβ1-15连接到pQE-30a上的到阳性重组载体pQE-30-2-2×Aβ1-15。酶切pGEM-T-1-2×Aβ1-15后获得的1-2×Aβ1-15和用相同的酶酶切的pQE-30-2-2×Aβ1-15连接，获得阳性重组载体pQE-4×Aβ1-15-O。 ***-4×Aβ1-15-O表达目的蛋白 pQE-4×Aβ1-15-O在***15中诱导表达的产物SDS-PAGE电泳显示，目的蛋白主要呈可溶性表达，约占细菌总蛋白的15％。目的蛋白条带在SDS-PAGE中显示的相对分子质量约为21KD，比理论计算的相对分子质量9.1KD大。 3.纯化获得有免疫反应性的目的蛋白pQE-4×Aβ1-15-O在***15中诱导

关键词： 帕金森氏病相关蛋白   神经退行性变   原核表达   噬菌体展示技术   基因工程抗体   昆虫-杆状病毒表达系统   可传播性海绵状脑病  

摘要： 第一部分：帕金森氏病相关蛋白α-synuclein的表达纯化及生物学功能的初步研究 α-synuclein蛋白（SNCP）广泛存在于大脑内，是一种脂结合的突触前蛋白。最近发现α-synuclein基因（SNCA）的突变与家族性帕金森病（Parkinson’s disease，PD）相关，提示它可能为此类疾病发生的分子桥梁而成为研究的热点。因此，进一步研究该蛋白的结构和功能对理解SNCP在神经系统疾病中的作用有着重要的意义。14-3—3蛋白是高度保守的、所有真核生物细胞中都普遍存在的一类蛋白调控家族，它在细胞的信号转导中起着至关重要的作用。由于14-3-3蛋白也与PD密切相关，SNCP与14-3-3蛋白的在结构和功能上存在着高度的一致性，探讨SNCP与14-3-3蛋白可能的分子间作用对进一步了解PD以及相关的神经退行性疾病的致病机理有着重要意义。 本研究从人神经母细胞瘤系SH-SY5Y细胞中提取总RNA，逆转录成cDNA，利用PCR技术扩增获得SNCA，测序正确后亚克隆至原核表达载体pQE-30-GST，在大肠杆菌中表达GST-SNCP融合蛋白，融合蛋白通过Ni-NTA Agarose亲和层析柱进行纯化。用纯化的SNCP蛋白免疫新西兰大白兔，制备了SNCP多克隆抗体，抗血清的ELISA效价达到1:32000。产生的抗体具有良好的免疫反应性，能够识别基因工程表达的SNCP，并且也能识别动物脑组织中天然的SNCP。 通过免疫共沉淀、GST pull down和ELISA等技术证明SNCP能够在体外与14-3-3蛋白发生分子间相互作用；为了进一步证明SNCP也与在脑组织中天然的14-3-3蛋白发生作用，本研究利用GST pull down以及His pull down方法进行实验，结果证明SNCP能够和脑组织中的14-3-3蛋白发生相互作用。这些结果从分子水平提供了SNCP与14-3-3蛋白相互作用的实验证据，为进一步了解SCNP的结构和功能及其在中枢神经系统退行性疾病的作用提供了必要的实验基础。 第二部分：PrP特异性基因工程Fab抗体和IgG全抗体的制备 可传播性海绵状脑病（Transmissible spongiform encephalopathies，TSE）是一类累及多种动物和人类中枢神经系统的致死性退行性疾病，潜伏期长，100％死亡。在人类主要表现为克一雅氏病（Creutzfeldt-Jakob disease，CJD），包括有散发性、家族遗传性和获得性。共同的病理改变为中枢神经系统神经元退行性变性、脑实质中淀粉样变性形成斑块和空洞、呈海绵状，胶质细胞增生，并且存在正常朊蛋白的异构体PrP<'Sc >。目前认为是由一种新型的由蛋白质组成而缺乏核酸的感染因子-PrP<'Sc >引起，其前体为存在于神经元细胞的正常膜蛋白PrP<'C >。对于该病目前还没有特异性的诊断和治疗方法，抗体在Prion的研究中起着极为重要的作用。 本研究利用噬菌体抗体库技术，以获得鼠源抗PrP抗体，并进行了全基因的表达。首先用纯化的HaPrP23-231，GST-HuPrP23-65，HuPrP23-231，以及HuPrPl06-126（人工合成）免疫BALB／c小鼠，由于HuPrPl06-126分子量小于2000 Dalton，属于半抗原，采用化学偶联法将短肽与血蓝蛋白（KLH）偶联。每种蛋白免疫5只BALB／c小鼠，共免疫4次，每只小鼠腹部皮下多点注射100μg抗原（溶于200μ生理盐水中）。免疫3次取尾血检测抗体效价，发现用HaPrP23-231免疫的小鼠可产生较高效价的抗体，可以用于下一步实验。 取脾后提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，以其为模板进行免疫球蛋白Fab区基因的特异性PCR扩增，将轻链和重链Fd段基因分别构建到pCom3质粒中，电转化XL1-Blue菌，构建噬菌体抗体库。通过对轻重链插入率的鉴定，和噬菌体浓度的滴定确定库中的有效克隆数约为10<'5>-10<'6>。 用纯化的HaPrP23-231作为固相抗原对原始抗体库进行筛选，经过四轮“吸附-洗脱-富集”的过程后获得了12株阳性克隆。我们将获得的克隆在大肠杆菌中对它们进行了可溶性表达。我们挑取5株进行序列分析，并将结果与GenBank中已知序列库中的IgG序列进行比较，证明它们是新的抗体序列，得到了两株不同的抗体，分别命名为IV-66和IV-78。我们用亲和层析法对Fab抗体进行了纯化，通过免疫印迹实验发现纯化后的抗体免疫反应性及特异性都得到了提高。免疫印迹分析时发现，两株单抗都能与重组的PrP蛋白反应，而且可以