关键词： 抗寄生虫药物   重要寄生虫病   基因工程疫苗   人兽共患寄生虫病   卫生研究所   流行病学   科研成果   生化代谢  

摘要： 栉风沐雨砥砺奋进,春华秋实桃李满园。寄生生物学研究团队至今已走过四十余载,四十载的章回,不忘初心,直济沧海;四十载的光阴,砥砺前行,日月齐辉。筚路蓝缕奋力行,一代一代寄生虫人以兼容并蓄的气度和严谨求实的精神一直致力于动物源及人兽共患寄生虫病基础理论和综合防控技术研究,主要开展寄生虫的生化代谢、致病机理、流行病学与综合防控等应用基础研究,研发新型抗寄生虫药物和基因工程疫苗,取得了一系列科研成果和良好的社会效益,为畜禽重要寄生虫病的综合防控提供技术支撑。

关键词： 新城疫病毒   传统疫苗   基因工程疫苗  

摘要： 新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的禽类的一种急性烈性传染病,严重危害养禽业的发展。在疫苗接种免疫压力下,NDV演化出不同的基因型,且各基因型毒株之间不能较好地提供交叉保护,导致临床上多见非典型新城疫与高抗体家禽发生NDV感染。目前,疫苗免疫仍是预防该病的重要措施,随着其病原学与分子生物学技术的发展,研究者研发了不同类型的ND疫苗。论文就新城疫病毒的病原分子特征、传统疫苗及新型基因工程疫苗的研究现状及发展前景进行综述,旨在为我国新城疫的防控及新城疫疫苗的研发提供一定的参考。

关键词： IBRV   常规疫苗   基因工程疫苗   防控  

摘要： 牛传染性鼻气管炎(infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)即牛疱疹病毒1型(BoHV-1)感染所引起的一种高度接触性传染病。该病给我国养牛业带来了巨大的经济损失。由于缺乏有效的治疗性药物,疫苗免疫仍然是防控该病的有效措施。当前,牛传染性鼻气管炎疫苗主要包括灭活疫苗、弱毒疫苗2种常规疫苗和亚单位疫苗、DNA疫苗、IBRV基因缺失疫苗、病毒活载体疫苗4种基因工程疫苗,各种疫苗各有优点。现对上述疫苗的最新研究进展进行综述,以期为IBRV疫苗的研究与开发提供参考。

关键词： 动物疾病防治   基因工程疫苗   生物技术  

摘要： 传染性疾病的危害范围较广、种类较多,严重影响了动物的安全.而且,有些传染性疾病也会通过不同的途径传播到人类身上,进而威胁着人的身体健康.当前,对相当一部分的传染病仍然没有有效的控制手段,在这样的环境下,疾病预防就显得非常重要.基因工程是一门新兴的科学技术,现代生物技术的发展也促使了基因工程疫苗的出现,且随着技术的不断发展,该技术在动物的疾病防治中得到了长足的应用.

关键词： 大田软海绵酸   单克隆抗体   基因工程抗体   纳米颗粒   酶联免疫分析  

摘要： 大田软海绵酸（Okadaic acid,OA）是一种聚醚类海洋生物毒素,具有一定的生物毒性,其产生于环境中的赤潮藻类,通过贝类滤食性行为富集后引起一系列环境污染问题并危害水产品安全,因此开展OA毒素快速灵敏检测是环境分析中重要内容之一。本文通过体内诱导制备抗OA腹水并从中纯化出抗OA单克隆抗体,并以此为基础进行了基因工程的制备和表达探索,并建立不同金纳米颗粒标记抗体的酶联免疫分析ELISA方法,实现了对OA海洋毒素的灵敏分析。主要内容包括如下:第一章,绪论。概述了OA性质及其检测技术进展,阐述了不同抗体的特点及其在海洋毒素中的分析应用,提出了论文选题依据和主要研究内容。第二章,抗OA单克隆抗体制备及其性能表征。基于小鼠体内诱导法制备抗OA单克隆抗体（anti-OA-Mc Ab）;开展anti-OA-Mc Ab性能分析,测定抗体亚型、特异性、亲和力等参数。研究表明,抗体效价达到1:128000,结合活性良好抗体亚型为Ig G1,亲和力常数Kaff为1.4×10～9 L/mol,具有高亲和力、高特异性。第三章,基于基因工程技术探索制备抗OA单链抗体和嵌合Ig G抗体。开展了总RNA提取、c DNA合成和抗体V和V基因扩增,利用SOE-PCR技术组装制备了抗OA单链抗体sc Fv,并构建了p BD-his6-mbp-linker-OA-sc Fv、p SUMO-linker-OA-sc Fv、p Trx-Tig-linker-OA-sc Fv重组融合表达载体以及p ET28a-SP3-H-linker-OA-V、p ET28a-SP3-L-linker-OA-V抗OA嵌合Ig G重组抗体表达载体,进行体外表达后,对抗体蛋白进行了性能表征。研究发现,重组质粒基因测序一致性高,基因工程抗体蛋白溶解性良好,但是存在明显的非特异性吸附。第四章,基于金纳米颗粒标记单克隆抗体的ELISA方法研究及应用。合成了胶体金Au NPs、金纳米花Au NFs、纳米金负载铂复合颗粒Pt@Au NPs,作为抗OA单克隆抗体的载体,构建基于不同金纳米颗粒标记抗体的OA检测ELISA法。结果表明,基于三种金纳米颗粒的ELISA方法检测限分别为0.15 ng/m L、0.076 ng/m L、0.070 ng/m L,比传统ELISA方法灵敏度高5～10倍。以Pt@Au NPs标记抗体对牡蛎、贻贝、花蛤样品进行OA检测分析,在10 ng/m L、5 ng/m L、1 ng/m L浓度下的加标回收率为97.67±2.30%～108.49±8.33%,性能稳定,为ELISA检测OA提供了新的灵敏分析技术。

关键词： 重组腺病毒   禽4型腺病毒   鸡传染性法氏囊病病毒   HAdV-5   基因工程疫苗   AdEasy系统  

摘要： 禽4型腺病毒（Fowladenovirusserotype-4，FAdV-4）和鸡传染性法氏囊病病毒（Infectiousbursaldiseasevirus，IBDV）是困扰养禽业的两大重要禽病原体，这两种病原的流行传播给全球养禽业带来了巨大经济损失，严重阻碍了全球养禽业的健康发展。疫苗是防控这两种病原体的主要手段，且新型基因工程疫苗是当前疫苗研究的热点。研究表明，Fiber2蛋白和VP2蛋白分别是禽4型腺病毒和鸡传染性法氏囊病病毒的主要结构蛋白，具有较好的免疫原性，是研制基因工程疫苗理想的靶蛋白。复制缺陷型HAdV-5（Humanadenovirusserotype-5）载体是目前基因传递和表达的有效载体，具有安全性好、外源基因负载量大等优点。因此本研究运用AdEasy系统构建了分别表达FAdV-4-Fiber2蛋白和IBDV-VP2蛋白的重组腺病毒并对其免疫保护效果进行了评估，以期为FAdV-4和IBDV基因工程疫苗的研发奠定基础。　　本研究运用同源重组的方法分别将PCR扩增的fiber2和vp2基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-GOI中，获得重组质粒pAdTrack-Fiber2和pAdTrack-VP2。随后将限制性内切酶PmeⅠ线性化的pAdTrack-Fiber2和pAdTrack-VP2转化至含有腺病毒骨架质粒的BJ5183感受态细胞中，通过菌内同源重组构建重组质粒pAd-Fiber2和pAd-VP2。用限制性内切酶PacⅠ将pAd-Fiber2和pAd-VP2线性化，并将线性化产物转染至HEK293A细胞，获得分别表达Fiber2蛋白和VP2蛋白的重组腺病毒rAd-Fiber2和rAd-VP2。通过PCR方法可检测到目的基因fiber2和vp2，并且测序完全一致。Westernblot结果进一步表明Fiber2蛋白和VP2蛋白在复制缺陷型HAdV-5载体中成功表达。将重组腺病毒rAd-Fiber2和rAd-VP2纯化后测得滴度分别为7.98×109GFU/mL和6.72×109GFU/mL。　　为评估重组腺病毒rAd-Fiber2和rAd-VP2的免疫保护效果，将纯化后的重组腺病毒rAd-Fiber2和rAd-VP2接种至3日龄SPF鸡，分别于免疫后7d、14d、21d和28d采血检测抗体水平，并于免疫后28d进行攻毒试验。免疫rAd-Fiber2和rAd-VP2的SPF鸡未出现因免疫引起的局部或全身不良反应，说明重组腺病毒的安全性较好。免疫rAd-VP2的SPF鸡在免疫后第21d开始检测到抗体的产生，并继续升高至28d，抗体的增长趋势与商品化IBDV活载体疫苗威力克基本一致，且攻毒保护试验表明，rAd-VP2可有效预防IBDV强毒株的攻击，保护率达100%。免疫rAd-Fiber2的SPF鸡产生的抗体水平明显低于免疫FAdV-4灭活疫苗组，FAdV-4强毒株攻毒后存活率为80%。综上所述，复制缺陷型HAdV-5载体可作为FAdV-4和IBDV免疫原性基因的传递载体，在FAdV-4和IBDV基因工程疫苗研发方面有着广阔的应用前景，对于FAdV-4和IBDV的防控具有重要意义。

关键词： 微囊藻   胞外碱性磷酸酶   PhoX   噬菌体展示技术   驼源纳米抗体   免疫荧光技术  

摘要： 以微囊藻为优势种的蓝藻水华问题已备受关注。磷是微囊藻大量生长所必须营养元素,因此,弄清磷代谢的过程十分必要。水体中的有机磷是蓝藻的重要磷源,胞外碱性磷酸酶PhoX在这一代谢过程中起关键作用,微囊藻的PhoX迄今尚未被研究确认。对微囊藻PhoX进行准确定量,也是厘清水华暴发水体中磷代谢过程所的重要环节,然而迄今并无有效手段。本实验基于对铜绿微囊藻Microcysits aeruginosa *** PCC7806(*** PCC7806)基因组的分析,寻找到了一个可能是胞外碱性磷酸酶PhoX的基因(Accession ***79942.1),并对这一基因进行了大肠杆菌表达,继而对表达的酶进行了一系列的酶学性质分析,对该酶进行了确认;探究了*** PCC7806中碱性磷酸酶基因phoX,phoA在不同磷条件下的表达响应;以*** PCC7806的胞外碱性磷酸酶蛋白作为抗原,基于噬菌体展示技术,在商品化的驼源纳米抗体库中筛选特异性的基因工程抗体,为PhoX的定量开发精确有效的工具。具体研究结果如下:(1)通过构建表达载体,表达、纯化微囊藻phoX基因,对该蛋白进行一系列性质分析。Western-blot和SDS-PAGE结果表示该目的蛋白的分子量大小约为88 k Da,与预期表达的大小吻合。生物信息学分析显示该蛋白含735个氨基酸残基;其二级结构的α-螺旋主要分布在氮端;蛋白质翻译后修饰的预测存在大量的糖基化和磷酸化位点;该蛋白为亲水蛋白,无跨膜结构域,但具有氮端Tat-way信号肽;以上这些均与胞外碱性磷酸酶的特征相符。表达出的PhoX表现出磷酸二酯酶和磷酸单酯酶活性,确认该蛋白为碱性磷酸酶。该酶的最适温度为37℃,最适p H值为10;作为辅酶的二价金属离子中Mg活性最高,其他依次为Co、Ca、Zn和Mn,Ni抑制该酶。(2)将在BG11培养基中培养到对数期的*** PCC7806分别转移到无磷(BG11(-P))、无机磷(BG11)和有机磷(BG11(-P+AMP))培养基中进行培养,分别在0,2,4,6 h取藻细胞进行RT-q PCR实验,分析胞外碱性磷酸酶蛋白编码基因phoX和胞内碱性磷酸酶phoA基因的表达以及细胞总体碱性磷酸酶活性的变化。结果显示不同环境磷对phoX的表达有显著的响应。在缺磷培养基(BG11(-P))中培养时,phoX表达在2 h时达到最高水平,然后在4 h下降到一个低水平。(3)基因分析显示PhoX在微囊藻属中的高度保守性,与其他蓝藻均有较大的差异。以*** PCC7806的PhoX蛋白为抗原,基于噬菌体展示技术,从驼源纳米抗体库中筛选基因工程抗体。经过三轮的淘筛,最终得到4个VHH抗体。对其中(阳性/阴性)P/N值为10.35的3H进行表达His-tag亲和柱纯化,获得了18 k Da的抗体蛋白VHH-3H。对该抗体进行FITC荧光化标记,免疫荧光反应验证了荧光化抗体FITC-VHH-3H对微囊藻胞外碱性磷酸酶有特异性结合能力。并通过ELISA对纳米抗体VHH-3H的特异性进行了验证。该抗体可用于水体中微囊藻碱性磷酸酶的分析,也可用于环境水样中微囊藻细胞的鉴定。

关键词： 胞外域   抗体   真核表达   细胞悬浮培养   酶联免疫吸附试验  

摘要： CD19特异性嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T cell,CART)在急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)的临床试验中取得了非常好的结果,显著改善了临床对于血液系统肿瘤的治疗方法。尽管CAR-CD19细胞疗法取得了巨大的成功,但约30%的患者发生了复发,研究表明在CAR-CD19复发病人B细胞表面CD19抗原存在明显的下调甚至直接转变为阴性,这可能是使用细胞疗法治疗后发生免疫逃逸的根本原因。近几年来,许多研究对于B细胞发生免疫逃逸的原因做了进一步阐述,其中复发原因包括可变剪接,系谱转换,双等位基因移码突变和内含子保留等一系列的复发机制。所以寻找新的靶点或者双靶点联合疗法对于ALL后期临床治疗具有重要意义。CD22主要表达于正常成熟B细胞表面和来源于B细胞的肿瘤细胞表面,主要抑制B细胞抗原受体(B cell antigen receptor,BCR)。CD22在复发病人的B细胞表面仍然可以被检测到,其可以作为治疗CART-CD19复发患者非常有前景的靶点。一些CD22相关的单克隆抗体药物也成功上市,用于治疗源于B细胞的淋巴细胞白血病。目前,噬菌体抗体库技术已经成为获得人源化高亲和力抗体的重要途径,被广泛应用到医学和生物领域。可通过体外或者体外反复多轮的淘选、富集、洗脱,快速筛选获得具有亲和力的基因工程抗体。为进一步开发针对CART-CD19复发以及CD22作为靶点疾病的细胞治疗产品或者抗体药物,本研究利用噬菌体抗体库筛选技术,从商业化人源化噬菌体抗体库Domain Antibody Library和Tomlinson I Library中筛选到两个具有高亲和力的基因工程抗体(一个为单域抗体(single domain antibody,sd Ab),一个为单链抗体(single chain variable fragment,sc Fv)。本研究主要结果如下:1.构建了CD22胞外域(CD22 extracellular domain,CD22ECD)表达质粒,通过瞬时转染HEK293FT悬浮细胞大量表达CD22胞外域蛋白,并通过亲和层析,离子交换层析和分子筛获得了高纯度且糖基化修饰完整的CD22胞外域蛋白。同时还筛选得到一株能够稳定表达CD22全长的293细胞株。2.使用商业化人源化噬菌体抗体库Domain Antibody Library和Tomlinson I Library,经过表达全长CD22 293细胞水平的一轮淘选,和三轮链霉亲和素-生物素磁珠固相淘选,分别获得了针对CD22靶点的单域抗体次级库和单链抗体次级库。对这两个淘选富集的抗体库采用酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immune Sorbent Assay,ELISA)进行单个克隆的筛选,分别获得一个具有较好亲和力的抗体片段。对这两个克隆进行测序和抗体序列分析,并通过ELISA实验初步测定了两个抗体的亲和能力。

关键词： 狂犬病病毒   单链抗体   纳米抗体   真核表达  

摘要： 狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabiesvirus,RABV）引起的烈性嗜神经性疾病，无有效疗法，主要通过疫苗和免疫球蛋白进行暴露后预防来控制该病毒。人类预防狂犬病使用的免疫球蛋白是人源和马源免疫球蛋白，两者存在潜在血清病原污染且产量有限，因此，找到副作用小且生产成本低的替代抗体具有迫切需求。　　本研究从单链抗体、纳米抗体和受体3种不同的技术路线出发，将结合RABVG蛋白的抗体可变区或受体片段与IgG抗体的Fc区融合形成分泌型基因工程抗体或抗体类似物，并通过体外和体内病毒中和试验及暴露后治疗试验比较研究了这些候选分子的抗病毒效果。本研究选取人源单克隆抗体CR57和鼠源单克隆抗体3D11E3的重链和轻链可变区序列，通过柔性肽连接成单链抗体的可变区;选取4种纳米抗体213E6、213H7、212C12、VHH-RVG-2的重链可变区，及3种RABV受体nAChR、NCAM和p75NTR的G蛋白结合区，在这些分子片段的N端加入抗体κ链的分泌信号肽，C端融合抗体Fc片段和6个组氨酸标签，构建出融合表达重组抗体蛋白的质粒，通过转染细胞进行真核表达。利用Westernblot和FAVN等方法检测重组抗体的表达水平和体外中和病毒能力。试验结果显示，单链抗体CR57、3D11E3和纳米抗体213E6、213H7的中和病毒能力较强，体外中和能力强弱为213H7＞213E6≈CR57＞3D11E3，而纳米抗体VHH-RVG-2和含受体结构的抗体类似物均基本无中和能力。　　利用镍柱亲和层析纯化出单链抗体CR57、3D11E3和纳米抗体213E6、213H7的重组蛋白，进行体内中和试验和暴露后治疗试验。结果显示，1IU的CR57、213E6抗体及10IU的3D11E3和213H7抗体能够在体内100％中和RABV感染;50IU的4种抗体对暴露后小鼠均有一定的治疗效果或延长了生存期，纳米抗体的治疗效果优于单链抗体，暴露后3天颅内注射纳米抗体，小鼠存活率可达80％。　　本研究成功构建并真核表达了9种RABV基因工程抗体，测定了它们的病毒中和能力。将中和能力较强的单链抗体CR57、3D11E3及纳米抗体213H7、213E6的重组蛋白表达纯化后，通过动物实验比较研究了它们的体内中和能力及暴露后治疗效果。研究结果为进一步研制和优化抗狂犬病病毒的基因工程抗体提供参考数据和候选分子。

关键词： PEDV   单克隆抗体   基因工程抗体   瞬时转染   CHO-K1细胞  

摘要： 目的:从抗猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)杂交瘤细胞克隆抗体轻重链全长基因,并实现其在真核细胞中的表达。为建立体外生产抗PEDV单克隆抗体平台奠定基础。方法:利用抗体亚型鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体亚型,采用间接ELISA法检测抗PEDV单克隆抗体的效价与特异性。通过对杂交瘤细胞的染色体数目分析以及间接ELISA法测定其抗体分泌能力的变化,评估杂交瘤细胞株的稳定性。通过RT-PCR从杂交瘤细胞株获取抗体轻重链全长基因,通过酶切连接构建轻重链表达质粒p IRES2-Zs Green1-L和p IRES2-Zs Green1-H。将轻重链表达质粒共转染CHO-K1细胞,RT-PCR鉴定抗体基因在CHO-K1细胞中的转录,Western Blot鉴定抗体基因在CHO-K1细胞中的表达。利用间接ELISA法和Western Blot检测基因工程抗体的结合活性。分别用人血清白蛋白信号肽、人kappa轻链信号肽,小鼠kappa轻链信号肽、高斯荧光素酶信号肽替代轻链亲本信号肽,对轻链信号肽进行优化。结果:抗PEDV单克隆抗体重链亚型为IgG2a亚型,轻链亚型为Kappa亚型,抗体效价为1:8000左右,抗体特异性较好,与猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、经典猪瘟病毒(Classic swine fever virus,CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(Porcinetransmissiblegastroenteritisvirus,TGEV)、猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCo V)均没有交叉反应。杂交瘤细胞连续传代3个月,染色体数目恒定为96条,间接ELISA结果说明杂交瘤细胞在传代过程中分泌抗体的能力无明显变化。琼脂糖凝胶电泳与测序结果显示,成功构建真核表达质粒p IRES2-Zs Green1-L和p IRES2-Zs Green1-H。RT-PCR结果说明抗体轻重链基因在CHO-K1细胞中均得到了转录,Western Blot结果说明抗体基因在CHO-K1细胞中成功表达。ELISA和Western Blot结果表明PEDV基因工程抗体具有良好的生物学结合活性。对抗体轻链信号肽进行优化,发现小鼠kappa轻链信号肽介导抗体分泌的能力略优于亲本信号肽。结论:抗PEDV单克隆抗体的特异性以及亲和力较好。成功克隆到了抗体基因,并实现其在CHO-K1细胞中的瞬时表达。对轻链信号肽进行了优化,发现小鼠kappa轻链信号肽介导抗体分泌的能力略优于亲本信号肽。