关键词： 幽门螺杆菌   疫苗   中性粒细胞活化蛋白   血溶素E   尿素酶   减毒鼠   伤寒沙门菌  

摘要： 研究目的:该研究包括以下两个目的:1,以常用的减毒鼠伤寒沙门氏菌作为载体,构建携带Hp的中性粒细胞活化蛋白(HP-NAP)基因的疫苗株;并免疫小鼠,研究表达HP-NAP的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株的免疫保护效果.2,构建携带大肠杆菌血溶素(hlyE)基因的减毒鼠伤寒沙门菌,并将hlyE与Hp的ureB融合表达构建疫苗株,免疫小鼠,研究hlyE对重组减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株免疫保护效果的增强作用.材料和方法:1.携带目的基因的原核表达质粒构建;Hp悉尼株(SS1)用改良Skirrow培养基,37℃微需氧培养;大肠杆菌K-12株用LB培养基,37℃过夜培养;分别收集细菌的基因组DNA.以Hp基因组DNA为模板,用聚合酶链反应(PCR)扩增HP-NAP基因.2.测序和同源性分析;挑选阳性克隆,提取质粒,以pTrc99A的通用引物分别对HP-NAP、ureB/hlyE基因进行序列测定;测序的核苷酸结果及根据核苷酸序列推测的氨基酸序列分别与GenBank中相关基因的核苷酸与氨基酸序列进行BLAST分析,比较它们的同源性.3.重组减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株的构建;插入NAP基因和ureB/hlyE融合基因的重组质粒,分别转化减毒鼠伤寒沙门菌过渡菌LB5000,抽提修饰后的重组质粒再转化减毒鼠伤寒沙门菌载体菌SL3261,挑选amp抗性的阳性菌落培养后,抽提质粒行酶切和PCR鉴定,获取阳性重组菌落分别命名为减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株SL3261(pTrc99A-NAP)和SL3261(pTrc99A-ureB/hlyE).4.目的蛋白在重组减毒鼠伤寒沙门氏菌中的表达和免疫原性分析;携带目的基因的重组SL3261菌和对照菌SL3261、SL3261(pTrc99A),37℃过夜培养后,转接到5ml培养基中诱导培养,5小时后收集处理细菌,进行SDS-PAGE电泳.电泳结果进行薄层扫描分析,分析所表达的目的蛋白在减毒鼠伤寒沙门菌中的表达水平和含量.5.重组减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株免疫鼠;雌性8周龄的Balb/c小鼠随机分为空白对照组、SL3261组、SL3261(pTrc99A)组、SL3261(pTrc99A -NAP)组、SL3261(pTrc99A-ureB)组和SL3261(pTrc99A-ureB/hlyE)组;空白组灌喂生理盐水,其他各组分别灌喂空SL3261菌,携带空质粒pTrc99A、pTrc99A-NAP、pTrc99A-ureB、pTrc99A-ureB/hlyE的重组减毒鼠伤寒沙门菌,剂量为10<'7>CFU/只,一周一次,免疫三次.最后一次免疫后四周,各组均予Hp SS1菌株(10<'7>CFU/只)攻击,攻击二次,隔日一次.6.重组减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株诱导的免疫保护效果; Hp攻击4周后,颈椎脱臼法处死小鼠,去除前胃,把腺胃组织分为两份,一份组织称重匀浆后涂布改良Skirrow培养基平板,37℃微需氧培养3天,计数Hp菌落数;一份组织中性福尔马林固定,石蜡包埋后,切片行改良Giemsa染色和常规HE染色,显微镜下观察胃组织Hp定植密度和胃组织病理学,并进行评分.7.统计分析;胃组织Hp定植密度评分、Hp定量培养结果和胃黏膜炎症评分用Mann-WhitneyU test进行检验.P<0.05为统计学有差异.所有检验均用SPSS 10.0 for windows软件包进行.结 论:1,利用基因工程的方法构建了以减毒鼠伤寒沙门菌为载体表达HP-NAP、UreB/hlyEHp疫苗株.2,免疫印迹实验证实重组疫苗株均有良好的免疫原性.3,表达HP-NAP、UreB/hlyE的重组疫苗株对实验小鼠有不同程度的免疫保护作用,可以明显降低小鼠胃内Hp的定植水平.4,表达融合蛋白ureB/hlyE的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株的免疫保护效果高于只表达ure的疫苗株.hlyE能一定程度地增强减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株的免疫效果,可以作为提高此类疫苗免疫效果的一种途径.

关键词： 疫苗研究   领域前沿   谭华荣   中科院   防治药物   基因工程疫苗   中国科学院院士   微生物  

摘要： 日前,中国科学院微生物研究所紧急启动科技计划,研制SARS病毒基因工程疫苗和防治药物,据悉,一个由病毒学与生物工程专家、中国科学院院士田波为顾问的SARS病毒工作小组已在该所成立,所内6个课题组同时投入这场艰巨的非典"阻击战"。在该所4月21日召集有关研究人员举行的动员会上,所长方荣祥、党委书记谭华荣提出,将动用所有领域前沿项目经费,开展治疗药物、工程疫苗研究,并表示"不要国家

关键词： 出口食品   猪伪狂犬病   基因工程疫苗   FDA  

关键词： 细粒棘球绦虫   融合蛋白   疫苗  

摘要： 背景与目的 包虫病是由细粒棘球绦虫的幼虫引起的一种人畜共患病，在我国牧区广泛流行，严重影响了牧区人民的健康并造成畜牧业的经济损失。目前对该病的控制主要以犬的驱虫和对牧民的预防教育为主，但在发展中国家效果较差。疫苗预防将是控制该病的理想途径。理论上，通过对中间宿主(羊、牛等家畜)或终末宿主采取有效的免疫保护均能切断细粒棘球绦虫生活史的循环链，阻断包虫病的流行。用于中间宿主(羊)的疫苗研究方面已取得较理想的结果。Lightowlers等报道了抗囊性包虫病的重组疫苗EG95，对羊的免疫保护率可达到96—100％，但由于牧区羊的数量巨大，牲畜疫苗免疫的实施费用较高，操作繁劳，难以被社会接受。 犬是细粒棘球绦虫的终末宿主，控制了犬的感染就中断了虫卵的传播，从而保护中间宿主(包括人)免受感染，且牧区犬的数量远少于牛、羊等家畜，因此对终末宿主犬的免疫保护应是非常有效的途径。Fu等用感染犬血清在一细粒棘球绦虫cDNA表达文库中筛选出一66kDa cDNA克隆EgA31，该cDNA克隆5′端表达多肽可引起显著的宿主体液免疫和细胞免疫。为了获得更好的抗原性及免疫原性，本研究通过原核表达系统获得EgA31 cDNA 3′端表达多肽，对其抗原性和免疫原性进行分析、鉴定，为进一步将EgA31用于诊断及疫苗的研究奠定基础。 材料和方法 (1) 通过PCR方法扩增EgA31cDNA，将得到的 翔狩班/班笼生华业了跷之 cDNA片断用限制性内切酶酶切，然后亚克隆入pGEx一SX一3表 达质粒，鉴定、筛选阳性质粒，DNA测序仪测序。 (2)将阳性重组质粒转化君seh。:s。hia。011 BLZI宿主菌， IPTG诱导重组质粒的表达，优化表达条件。大量表达融合蛋 白，GSTrapFF柱亲和层析纯化表达产物，SDS一PAGE鉴定表达 产物的分子量及纯化效果，Bradford法测定重组蛋白含量。 (3)用纯化的融合蛋白免疫豚鼠，获得抗血清，ELISA法检 测豚鼠抗体水平，Western blot法进行分析鉴定。 研究结果(1) PCR扩增得到50ObpcDNA片断，亚克隆入 pGEX载体，经酶切和PCR方法鉴定结果表明pGEx/EgA31重 组质粒成功构建。测序检验重组质粒中EgA3 IcDNA序列无误。 开放读码框正确。 (2)SDS一PAGE结果显示分离纯化的EgA31/GsT融合蛋白分 子量大小约为45kDa，GSTrapFF柱亲和层析纯化表达产物得到 较高纯度的融合蛋白，蛋白表达量可达到每升培养基15mg重 组蛋白。 (3)ELIsA结果显示EgA31/GST融合蛋白可激起豚鼠体内较 强的体液免疫反应，IgG水平明显增高。免疫豚鼠得到的抗血 清可与细粒棘球绦虫原头蝴总蛋白在66kDa处特异性反应。并 与其它虫体蛋白之间存在交叉反应。 结论(1)成功构建pGEX/EgA31重组质粒。 (2)EgA31/GST融合蛋白获得高效表达，并成功纯化，具备 被进一步制备为工程菌的条件。 (3)融合蛋白可激起豚鼠较强的体液免疫反应，并与其它虫 体蛋白之间存在交叉反应，为进一步将EgA31用于疫苗的研究 奠定基础，并为将其用于其它虫体疫苗提供可能。

关键词： 基因工程抗体   治疗   诊断   肿瘤  

摘要： 基因工程抗体 (GEA)发展十分迅速 ,利用其特异性的靶向作用 ,在肿瘤诊断、治疗及预后等方面已初步显示良好效果和广阔应用前景。随着研究的不断深入 ,基因工程抗体必将发挥更重要的作用。现综述基因工程抗体在肿瘤应用中的最新进展。

关键词： EIAV   env   gag   蛋白疫苗   DNA疫苗,重组痘苗病毒   免疫应答   艾滋病  

摘要： 该研究以本实验室构建的pDLV和pLN质粒为模板,采用PCR的方法分别扩增出EIAV DLV疫苗株和LN强毒株的env和gag基因,测序结果可知DLV Env蛋白比LN Env蛋白少2个N-L连接糖基化位点,均位于gp90内.利用B<,AC>-To-B<,AC>杆状病毒表达系统将序列正确的目的基因片段转移至含杆状病毒基因组的大质粒Bacmid上,然后转染Sf9昆虫细胞,获得的重组病毒扩增后,再大量感染Sf9昆虫细胞,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,重组杆状病毒正确地表达了目的蛋白.根据上述EIAV DLV和LN的env和gag基因的测序结果设计突变引物,采用PCR搭接突变的方法去除痘苗病毒早期转录终止子TTTTTNT序列,将突变后的EIAV DLV和LN的menv和mgag基因克隆到pSC65痘苗病毒表达载体pE/L启动子的下游,得到的重组质粒转染已预先感染了痘苗病毒天坛株的TK<'->143细胞,经Budr加压和蓝白斑筛选挑选和纯化重组病毒,抗体染色和Westerm blot鉴定结果表明,重组痘苗病毒正确地表达了目的蛋白.

关键词： 单克隆抗体T2-2   诊断   治疗   基因工程抗体   HLA-E   细胞毒作用   NK细胞   抑制效应  

摘要： 第一部分:抗体T2-2用于肿瘤诊断和治疗的实验研究;抗体作为疾病预防、诊断和治疗制剂已有百余年历史.1975年Kohler和Milstein首次建立B细胞杂交瘤技术,制备出高度均一的单克隆抗体,又称细胞工程抗体.近十余年来,基因工程抗体成为生物技术产业的热点.该文拟研制针对肺癌的特异性抗体,并探讨其用于肺癌诊断和治疗的可能性.

关键词： 肝癌,单克隆抗体,可变区基因,克隆,表达,Fab,嵌合抗体,嵌合Fab,复性  

摘要： 目的： 利用大肠杆菌高效表达肝癌相关抗原HAb18G胞外区片段，并分析其与相应抗体的结合活性，进而明确表达产物用于鉴定和筛选基因工程抗体的可行性。设计引物分别克隆抗人肝癌单抗HAb18 Fd和轻链基因以及轻、重链可变区基因V和V，并构建成Fab抗体的形式对其可靠性和准确性进行验证。之后，利用克隆的抗体基因构建嵌合IgG抗体表达载体，转染SP2／O细胞进行稳定表达、纯化和鉴定。将轻、重链可变区基因V和V先后克隆入一个人鼠嵌合Fab抗体的通用载体，构建成cFab的分泌性表达载体，在大肠杆菌中进行诱导表达、纯化和鉴定。同时分别构建cFd和cL的原核非融合表达载体，诱导表达后，进行cFab复性的研究和产物鉴定。最终，对制备的三种基因工程抗体的抗原结合能力进行鉴定和初步比较。 方法：根据研究目的，实验内容共分为六个部分，操作方法简述如下。 1．肝癌相关抗原HAb18G胞外区片段的原核表达与免疫学活性分析 以克隆载体pBluescript KS(+)／HAb18G为模板，应用PCR技术扩增出HAb18G胞外区基因片段。克隆入原核表达载体pGEX-4T-3后，酶切及测序鉴定阳性重组子。之后，通过IPTG进行诱导表达，并利用SDS-PAGE和Western-blot检测蛋白表达情况。对表达产物进行纯化及复性等处理后，采用ELISA等方法检测其 第四军医大学博士学位论文 免疫学的特性。 2．抗人肝癌单克隆抗体HAbls轻、重链基因的克隆与鉴定 从杂交瘤细胞株中 提取总NA，利用RT－PCR扩增抗体Fd和轻链基因以及轻、重链可变区基 因人和 V。，分别连入 pMD18T载体后，进行序列测定并利用相应的软件对 序列进行分析。然后，将轻链及Fd基因依次克隆到载体pComb3中，构建成 噬菌体展示型表达载体pComb3／FdglllL。转化大肠杆菌XLlb山e并利用辅 助噬菌体M13卜＊进行挽救，收获噬菌体后利用间接＊NSA检测其抗原特异 性。另外，酶切去除载体pComb3／FdglllL的gill片段后，直接用连接酶将 其环化为分泌型的表达载体pComb3／Fab。转化大肠杆菌并诱导其表达，同时 采用ELISA和免疫荧光法检测表达产物的特异性。 3．抗人肝癌基因工程嵌合IgG抗体的构建和表达 分别以克隆载体 pMD 18－T／VH和 pMD 18－T／VL为模板，用设计的含有相应酶切位点和内含子剪 切位点的特异引物扩增 HAb 8轻、重链可变区基因。克隆入真核表达载体 pDHL后，酶切及测序鉴定阳性重组载体pDHL／chHAbls。之后转染SP2／0 细胞，经 MTX筛选获得抗性克隆。采用有限稀释法单克隆化 PDHL／ChHAbl 阳性转染的SP2／0细胞，并持续MTX加压培养。通过ELISA从单克隆细胞 株中筛选高效表达的细胞株。表达产物利用 protein G亲合层析柱纯化后，进 行***电泳和Western七b检测，同时采用ELISA和免疫荧光法检测 其抗原结合特异性。 4．抗人肝癌基因工程嵌合Fab R体的构建及其在大肠杆菌中的分泌表达 利用 特异引物 PCR扩增人 IgG3的 CH和 C。基因，酶切后分别插入到表达载体 pComb3相应的酶切位点中，从而构建成人一鼠嵌合Fab抗体的通用表达载体 pComb3C。然后，将扩增的 MAb HAbls的 V。和 V。基因分别组装到通用表 达载体中，酶切去除gill片段后，直接连接成嵌合Fab抗体的分泌型表达载 体pComb3C／cFab。转化大肠杆菌XLI—Blue并诱导其表达，并通过ELISA 检测表达产物的定位。利用 protein G亲合层析柱纯化表达产物后，进行 SDS－PAGE电泳和 Western－blot检测，同时采用 ELISA和免疫荧光法检测表 达产物的特异性。 5．抗人肝癌基因工程嵌合Fah抗体的原核非融 复性 以pComb3／cFab 第4 页 第四军医大学博士学位论文 为模板，分别用相应的弓l物扩增嵌合 Fd及嵌合轻链基因，酶切后分别插入到 原核表达载体pET32a相应的酶切位点中，从而构建成嵌合Fd及嵌合轻链的 原核非融合表达载体pET32a／cFd和 pET32a／CL。转化人肠杆菌 JM

关键词： 基因工程疫苗   猪腹泻   K88K99   大肠杆菌   大肠埃希氏菌   埃希氏杆菌属   双价  

摘要： 中国农科院哈尔滨兽医研究所的科研人员利用现代基因工程技术手段,人工构建出非产肠毒素性且具有K88 K99两种保护性抗原的大肠杆菌菌株,通过接种于适宜培养基发酵高密度培养,成功试制出了新生猪腹泻大肠杆菌K88 K99双价基因工程疫苗。该疫苗于1990年荣获中国农科院科技进步一等

关键词： 科技企业孵化器   血液   单抗   科研人员   SARS   病人   解剖学   基因工程抗体   上海生命科学研究院  

摘要： 位于上海浦东张江高科技园区的上海单抗制药技术有限公司,作为中科院上海生命科学研究院的主要协作者,其科研人员对SARS攻关项目取得了第一阶段的关键性进展,即从SARS康复病人的血液中提取构建的基因工程抗体库已顺利建成。