关键词： 基因工程   抗体   基因重组  

摘要： 近年来在生物学领域最引人注目的进展之一就是抗体工程的建立,人们已经可以将编码抗体的基因进行重组、改造,并实现了体内和体外的表达,从而使抗体得到更为广泛的应用.本文就这方面的研究作一综述.

关键词： PE40   pET21a(+)   免疫毒素   基因工程抗体   表达载体   乳腺癌   免疫治疗  

摘要： 目的:通过基因工程重组技术,利用已合成的抗乳腺癌单链抗体基因ScFv,及自绿脓杆菌基因组扩增的其外毒素基因PE40,采用重叠延伸基因拼接法(gene splicing by overlap extension)使二者连接.并利用扩增时导入的两端酶切位点,采取酶切使之克隆入表达载体pET21a(+).构建好的免疫毒素表达载体为以后的高效表达、纯化及细胞毒实验打下了基础.可望为乳腺癌及其他肿瘤的临床治疗提供一种新的选择.方法:1、PCR扩增:设计引物扩增ScFv时在其5'端加入EcoRI酶切位点,扩增PE40时在其3'端也加入EcoRI位点,在自绿脓杆菌基因组DNA中扩增PE40时采用了改良套式PCR法;2、基因片段的连接:扩增ScFv的3'引物与扩增PE40的5'引物二者有一段序列完全相同,因此使用重叠延伸基因拼接法使二者连接;3、融合基因导入载体:融合基因与载体pET21a(+)均以EcoRI酶切,形成粘性末端,因而可以顺利导入;4、重组体的筛选及序列分析:碱裂解法提取质粒进行酶切鉴定,以确定载体中有无插入序列及插入的方向.5、序列分析:正在进行中.结论:1、构建抗人乳腺癌免疫毒素表达系统获得成功;2、在PCR扩增原核基因PE40时,由于引物与模板G、C含量较高,加入变性剂DMSO使PCR成功的可能性大大增加,我们在实验中使用改良套式PCR亦获得成功;3、采用重叠延伸基因拼接法连接两段基因序列,是进行基因拼接表达的理想方法,在两段基因接头处无需加入任何与模板不相关的碱基现时使两段任意来源的基因片段直接相连,也不需要加入任何酶切位点.进行扩增的时候,计算好退火温度,使用高保真的Taq酶往往能达到满意的扩增效果.

关键词： Alzheimer病(AD)   β-淀粉样肽(Aβ)   HBcAg   重组质粒   原核表达   基因工程疫苗   抗原性   免疫原性  

摘要： 为了探索生产工艺简单、成本低廉且具有较强抗原性和免疫原性的新型AD疫苗,该课题拟进行以下研究:①采用可增强外源性表位抗原性和免疫原性的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)作为载体,通过基因工程技术,将Aβ<,1-42>基因融合于HBcAg的氨基端和其中间的主要免疫优势区(MIR),构建表达载体,在大肠杆菌中进行原核表达,制备AD基因工程疫苗(Aβ和HBcAg的融合蛋白);②通过免疫学方法检测该疫苗的抗原性和免疫原性;③在人神经母细胞瘤细胞系中,观察免疫血清对Aβ肽毒性的抑制作用.该课题的研究将为阿尔茨海默病基因工程疫苗的动物实验和临床研究打下基础.结论:1 将Aβ<,1-42>的基因融合于HBcAg的氨基端和中间MIR区,构建了重组克隆载体和原核表达载体.2 首次在大肠杆菌中表达了Aβ与HBcAg融合基因,制备了AD基因工程疫苗.3 HBcAg MIR区融合蛋白的Aβ抗原性和免疫原性显著高于氨基端融合,说明MIR区是Aβ<,1-42>的理想融合部位.4 用制备的AD疫苗免疫BALB/c小鼠,其免疫血清可抑制Aβ<,1-42>肽对SK-N-SH细胞的毒性作用,从细胞水平证明了AD基因工程疫苗的有效性,为其应用于动物模型和临床试验打下了基础.

关键词： 动物基因工程疫苗   美国   美利坚合众国   北美洲   企业   企业管理  

关键词： 空肠弯曲菌   PEB1   原核表达   疫苗  

摘要： 第一部分 peb1A基因表达载体的构建及相应蛋白的表达 目的 ：以基因工程技术构建编码空肠弯曲菌（CJ）粘附蛋白（periplasmic solute-binding protein，PEB1）编码基因peb1A的原核重组表达质粒，并获取目的蛋白，为进一步研究其生物学特性和制备CJ亚单位疫苗奠定基础。 方法：（1）表达质粒的构建及鉴定：以含有BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位点的同一对引物行PCR反应以获取七个血清株空肠弯曲菌的peb1A基因片段，测序比较其同源性。小量提取质粒pET32a（+）和pQE30，选择与GBS最为相关的Pen19 CJ 标准株PCR产物为目的片段，同时对目的片段和pET32a（+）、pQE30行双酶切反应;酶切产物纯化后连接，转染入大肠杆菌JM109，兰白斑和氨苄青霉素抗性平板筛选阳性菌落，重组质粒经双酶切和PCR反应鉴定后测序，分别命名为pET32a（+）-peb1A和pQE30-peb1A;（2）原核表达重组质粒在大肠杆菌中的表达及纯化:将重组质粒pET32a（+）-peb1A转化入大肠杆菌BL21（DE3），pQE30-peb1A转化入SG13009（pREP4）,IPTG诱导表达目的蛋白，超声破碎菌体，取上清用 Ni-NTA 树脂亲合层析纯化，SDS-PAGE ＜WP=5＞ 鉴定;（3）融合蛋白鉴定：用CJ Pen19全菌抗原全身免疫雄性新西兰白兔，初次免疫后2、4、6、8、10周分别取血清观察特异性抗体滴度变化，用CJ Pen19粗提蛋白及纯化目的蛋白分别包被酶标板，ELISA法检测特异性抗体滴度，免疫印迹法鉴定抗体特异性。 结果： （1）成功构建peb1A的表达质粒pET32a（+）-peb1A和pQE30-peb1A：PCR反应显示七种不同血清株CJ均在约780bp位置出现单一条带，测序表明多株间具高度同源性。双酶切和以重组质粒为模板的PCR反应鉴定，证明peb1A片段插入原核表达质粒pET32a（+）和pQE30中，测序表明插入位置正确;（2）重组质粒pET32a（+）-peb1A在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达出TrxA/PEB1融合蛋白，并通过亲和层析获取高纯度蛋白;而pQE30-peb1A却未表达相应的蛋白。（3）证实TrxA/PEB1融合蛋白有高度特异的免疫原活性： CJ Pen19全菌抗原免疫后4周在雄性新西兰兔诱发高滴度特异性抗体，可同时与Pen19菌体粗提蛋白和TrxA/PEB1蛋白发生特异性结合。免疫印迹法检测表明该抗体能与PEB1融合蛋白，但不与空质粒表达蛋白结合。 结论 ：（1）运用基因工程技术,成功构建空肠弯曲菌peb1A的融合表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白TrxA/PEB1;（2）所用表达质粒pET32a（+），获取的目的蛋白表达量大，有望用于今后基因工程技术中获取大量CJ粘附蛋白;（3）TrxA/PEB1基因表达蛋白具有与野生菌株相同抗原活性;（4）常见的7个CJ血清株均有大小相同的peb1A基因片段，测序证实不同血清型CJ peb1A基因间序列同源性高达94%- 96%，充分显示该基因序列的保守性;（4）PEB1融合蛋白作为CJ的亚单位侯选基因工程疫苗不仅可行，而且有良好应用前景。 【关键词】 空肠弯曲菌,PEB1,原核表达,疫苗

关键词： 腺病毒   六邻体   重组质粒   克隆   表达   基因工程疫苗  

摘要： 目的:儿童呼吸道感染在临床病例中日益猖獗,腺病毒是重要病原体之一,除此之外,腺病毒还导致小儿肺炎,尤其是6个月至2岁的婴幼儿腺病毒肺炎最为严重,感染主要是以3、5、7型为主.华北、东北及西北于冬季都有过较大规模的流行,病情极为严重,住院病人病死率高达5％-25％.因此,对腺病毒进行特异性诊断和早期预防具有重要意义.六邻体是腺病毒主要的结构蛋白,能够刺激机体产生相应的抗体,抑制病毒体构象的改变,从而中和病毒体.六邻体的中和抗原决定簇主要存在于L1、L2区,其中L1有六个超变区,L2有一个超变区,每个超变区的基因序列已经明确,因此可以对该区进行克隆和表达,这对今后研制高效、无毒的腺病毒基因工程疫苗具有重要意义.方法:将腺病毒感染Hela细胞后提取病毒DNA,用PCR方法扩增六邻体L1、L2基因,将得到的基因片段定向克隆到克隆载体pUC19质粒中,对克隆的片段进行DNA测序鉴定.然后切下目的片段,连接到表达载体pQE31上,转化到感受态大肠杆菌DH5α中,经酶切鉴定后筛选正确重组质粒pQE31hexon,最后把它转化到M15菌中,转化菌株获得六邻体L1、L2基因功能.转化菌株经IPTG诱导后表达六邻体L1、L2蛋白,对所表达的蛋白用SDS-PAGE进行分析.应用单因素变量法对诱导表达的各个变量(诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度、初始菌浓度)进行优化,使蛋白质表达达到最大值.结果:从Hela细胞中提取得到完整的36kb的腺病毒核酸;PCR扩增得到1.4kb大小的六邻体L1、L2片段;酶切鉴定和核甘酸序列测定结果证明重组质粒的正确性和外源基因序列的可靠性;诱导表达产物经SDS-PAGE检测在相对分子量52kD处有特异的蛋白带.蛋白表达的最佳条件为温度37℃,初始菌浓度OD<,600>为0.5,IPTG终浓度为0.06mM,诱导时间为4小时.结论:该实验成功地克隆和表达了六邻体L1、L2基因,获得了基因工程重组的六邻体蛋白,为制备腺病毒基因工程疫苗奠定了基础.

关键词： 人巨细胞病素   人源基因工程抗体   噬菌体表面展示   重组杆状病毒系统表达   分泌型表达  

摘要： 目前关于抗HCMV基因工程抗体方面的研究资料甚少.美国Scripps研究所使用HIV-1型感染者的骨髓建立噬菌体抗体库,从中筛选出抗HCMV重组Fab抗体.日本Tokai大学医学院报道表明,从HCMV噬菌体抗体库存筛选出6株Fab抗体,有1株具有明显的抗HCMV Town株活性.在此基础上我们进行了以下工作:首先,进行了抗HCMV Fab噬菌体抗体库的构建.采集具有高滴度HCMV抗体的感染者外周血,分离淋巴细胞,然后进行总RNA的提取以及cDNA的合成,用一系列特异性的PCR引物,通过PCR扩增特异性轻链基因和重链Fd段基因,在对PCR产物鉴定和纯化后,用轻链混合物与噬菌粒pComb3构建轻链库,随机挑选克隆进行轻链插入率鉴定,在确保轻链库的质量后,将重链混合物克隆入轻链库中,构建Fab噬菌体抗体库,随机挑选克隆进行重链插入率鉴定.最后使用辅助噬菌体对Fab噬菌体抗体库进行包装,检测库容量,结果表时所构建的Fab噬菌体抗体库的容量为2×10<'6>,轻链插入率和重链插入率分别为100﹪和99﹪,足以满足筛库的需要.

关键词： 乙肝病毒   人源基因工程抗体   噬菌体展示技术   昆虫-杆状病毒表达系统   中和抗体  

摘要： 该研究利用噬菌体抗体闸技术,以获得人源化抗乙肝表面抗原的抗体.采集乙肝疫苗加强免疫后产生高滴度表面抗体的健康人的外周血,分离淋巴细胞,提取细胞总mRNA,反转录cDNA以人源抗体IgG1Fab段基因的引物扩增抗体轻重链基因.将轻重链基因构建到pCOM3质粒中,电转化XL-1菌,构建噬菌体抗体库.用纯化的HBsAg对原始抗体库进行了筛查,经过三到四轮"吸附-洗脱-富集"的过程后,将获得的克隆进行原核表达.表达产物进行ELISA检测,结果获得50个抗乙肝表面抗原的Fab抗体克隆,进一步对这50个克隆测序比较,证实它们序列相同,轻链类型为k型.

关键词： 噬菌体展示   Fab抗体   腺病毒伴随病毒   CD34  

摘要： 由于具有自身修复和分化潜能,以及相对的易于分离纯化,不需要在基因治疗的同时辅以药物,造血干细胞和祖细胞是理想的基因治疗的场所,已被广泛的用于遗传病、自身免疫性疾病的基因治疗等.CD34抗原是一个分子量为105-120kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白,是造血干细胞和祖细胞的表面标志.重组腺病毒伴随病毒2型(AAV2)载体被证实为一种很有效的基因转移至造血干细胞和祖细胞的载体,具有非致病性、位点特异整合性和高效持续表达等优点.但重组AAV载体进入CD34+细胞和表达外源基因的能力存在很大的个体差异,不同个体的CD34+细胞表达的AAV受体可能具有差异,因此寻找稳定高效转移基因的方法显得非常重要和必要.重组双特异性抗体可以增强基因转移能力,该课题的目的是分别获得针对抗AAV2和抗CD34的单克隆抗体,为基于抗AAV2和抗CD34的基因工程双特异性抗体的构建,研究解决AAV2基因治疗中基因靶向递呈的生物技术问题,提高重组腺病毒伴随病毒载体进入CD34+细胞的能力奠定基础.该研究利用噬菌体抗体库技术,筛选得到了人源的抗腺病毒伴随病毒2型(AAV2)的Fab段抗体,并获得了其基因工程全抗体.同时,我们从my10杂交瘤细胞中筛选获得了抗CD34的抗体及其表达.

关键词： 银屑病   基因工程   人抗角蛋白抗体   Fab   角蛋白17   角质形成细胞  

摘要： 银屑病是一种严重危害我国人民身心健康的慢性反复发作性皮肤病。在我国总患病人数估计有近500万，而且近年发病率还有逐渐上升的趋势。然而，在银屑病的治疗方面目前国内外尚缺少既有效、又安全的药物。因此，研制开发治疗银屑病的高效、特异、副作用小的药物是皮肤科领域的当务之急，也是世界范围内的热点之一。 表皮角质形成细胞过度增生、多种细胞因子和免疫表型的异常分泌和表达是银屑病主要的病理学改变。无论是利用表皮吸附、角蛋白阻断等间接对比法还是利用纯化的抗角蛋白自身抗体(anti-keratin auto antibody,AK auto Ab)，亦或使用抗角蛋白单克隆抗体，其可以以剂量依赖的方式抑制角质形成细胞的增殖代谢，提示AK auto Ab对角质形成细胞过度增殖性疾病有抑制作用;AK auto Ab还可以抑制角质形成细胞产生IL-6、IL-8，进而抑制这些免疫炎症介质介导的炎症反应;通过建立银屑病动物模型，观察自正常人血清中纯化的AK auto Ab对银屑病的治疗作用，结果表明AK auto Ab可以促进动物模型银屑病样皮炎的康复;在临床上，给银屑病患者 补充富含该抗体的免疫球蛋白能够明显改善病情。因此提示抗角蛋白抗体 在银屑病的治疗方面具有良好的研究和应用前景。 从正常人血清中纯化AK auto Ah或者用杂交瘤技术制备鼠抗角蛋白单 克隆抗体存在着应用上的困难。从血清纯化抗体受到血液来源的限制，而 且还潜在有安全方面的问题;而鼠单抗则属于异种蛋白，其异源性问题极 大地限制了在临床治疗上的应用。因此，利用基因工程的方法制备人源性 抗角蛋白抗体，能够有效地克服血液制品的局限性，是理想的升级换代产 品。有鉴于此，我们己自半合成噬菌体抗体库中筛选、克隆了一株人源性 抗角蛋白抗体FK3，并成功得到可溶性表达的 Fab段。本研究通过免疫组 织化学和免疫印迹等方法，观察FK3在人体不同组织和细胞内的反应定 位，明确该抗体所识别的角蛋白，并在体外细胞培养实验中初步探讨该抗 体对角质形成细胞增生代谢等方面的作用，为研制开发人抗角蛋白抗体的 基因工程产品奠定坚实的基础。 首先，将FK315原核表达，通过ELISA试验证实所获得的Fab段与角蛋 白具有较高的结合活性和特异性。 其次，应用该抗体对正常人皮肤、正常人其它不同部位的组织以及银 屑病、皮肤鳞癌、基底细胞癌、脂溢性角化病和恶性黑素瘤皮损进行免疫 组织化学染色，观察该抗体在上述组织中的反应定位。结果发现，该抗体 与正常人皮肤表皮不结合，在正常人其他组织中可与食管、支气管及肝脏 等上皮组织发生反应;在银屑病，FK3与表皮全层结合，其中基底细胞 层为强阳性反应;鳞癌和基底细胞癌的癌细胞胞浆均呈阳性反应，脂溢性 角化病的皮损细胞亦呈明显的阳性反应，黑素瘤肿瘤细胞反应阴性，而瘤组 织周围的表皮为阳性。各切片中所见毛囊均呈阳性反应，真皮呈阴性，其 它皮肤附属器未见阳性反应。阴性对照及空白对照未见染色。 再次，应用免疫印迹的方法获得该抗体所结合的角蛋白条带的图片， —— 发现FK3与鼠抗人细胞角蛋白 17MCAb所识别的角蛋白条带相同，通过凝 胶分析软件得到的图表数据证实其所识别的角蛋白相对分子质量为46 000。通过ELISA竞争抑制试验的方法发现鼠抗人细胞角蛋白17MCAb与 FK3之间具有明显的竟争抑制作用，进一步证实了 FK3是抗角蛋白 17（keratin 17，K17）的抗体。 最后，将该抗体作用于培养的人角质形成细胞，在不同浓度和不同的 作用时间应用酶免疫法细胞化学染色、免疫荧光细胞染色法及共聚集显微 镜观察该抗体在角质形成细胞内的反应定位。并应用MTT的方法观察该抗体 对角质形成细胞的增殖活性的影响。结果发现角质形成细胞的胞浆呈明显 的阳性反应，而胞核呈阴性反应，说明基因工程人抗角蛋白抗体FK3能 够进入培养状态下的角质形成细胞的胞浆，而没有进入细胞核，共聚集显 微镜的扫描进一步证明了这一点。MTT实验证实该抗体能明显抑制角质形成 细胞的增殖，而对黑素细胞的增殖没有明显影响。 K17分布于生长期毛囊及一些非角化上皮，正常人表皮并不表达K17， 只有在银屑病皮损区表皮才表达KI7，所以KI7被称为银屑病相关性细胞角 蛋白。在银屑病皮损区，激活的T细胞产生一系列细胞因子，这些细胞回子 与角质形成细胞表面相应受体结合后，可能引起角质形成细胞内角蛋白表 达模式的改变。其中IFN－Y与K17表达的关系己明确，IFN－Y可激活信号传 导及转录激活因子 STATI（signal transducers and activators of transcription），多个STATI结合到K17基因增强子，诱导表皮角质形成细 胞表达K17。其