关键词： 乙型脑炎病毒   伪狂犬病病毒   基因克隆   重组病毒载体疫苗  

摘要： 乙型脑炎病毒和伪狂犬病病毒是引起母猪繁殖障碍的主要病因之一，给养猪业造成了巨大的经济损失，同时乙型脑炎是一种人畜共患病，猪是乙型脑炎病毒的主要扩增宿主，因此控制猪的乙型脑炎具有十分重要的意义。而预防和控制这两种传染病最有效的措施就是免疫接种。目前尚无商品化的猪用乙型脑炎疫苗，主要采用人用的两种乙型脑炎疫苗，而这些常规疫苗都存在一定的缺点。鉴于此，本研究从乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株中扩增了其主要免疫原性基因PrM、PrM-E和NS1，构建了三株表达猪乙型脑炎病毒主要免疫原性基因的重组伪狂犬病病毒，即TK／gG／PrM、TK／gG／PrM-E和TK／gG／PrM-E-NS1，在此基础上研制了猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗，并进行了动物试验。主要研究工作和结果如下： 1．乙型脑炎病毒PrM-E基因的克隆、测序与序列分析 根据已报道的乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列，设计了一对引物，以RT-PCR方法扩增了其主要免疫原性基因PrM-E，并克隆至pMD18-T载体中，命名为pTPrM-E，序列测定结果表明，与已报道的SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株核苷酸序列比较，PrM的同源性均为100％，与SA14-14-2疫苗株比较，E基因发生了4个核苷酸的改变，即2181a-g，2317a-g，2441a-t，2443g-a，其中2317a-g为回复突变，共导致了3个氨基酸的改变，即E402 T-A，E447 D-G(为回复突变)和E489 G-D，而E488为无义突变，但未发生与毒力相关位点的突变。 2．乙型脑炎病毒主要免疫原性基因重组伪狂犬病病毒的构建 采用3对引物(各引入一个酶切位点)分别从pTPrM-E和pTNS1扩增PrM、PrM-E和NS1基因，双酶切后分别将PrM、PrM-E和PrM-E-NS1基因定向插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体PgG-uni中，分别得到三个重组转移载体，命名为PgG-PrM、PgG-PrM-E、PgG-PrM-E-NS1。将重组转移载体用KpnI线性化后分别与经EcoRI酶切消化的PRV Ea TK／gG／LacZ突变株基因组DNA共转染PK-15细胞，形成病变的转染物经空斑筛选纯化，PCR扩增和Southern印迹等鉴定，获得了三株纯化的重组病毒，分别命名为TK／gG／PrM、TK／gG／PrM-E和TK／gG／PrM-E-NS1。重组病毒在IBRS-2、PK-15和CEF细胞上增殖滴度依次降低，Western印迹表明JEV PrM、E和NS1基因在重组病毒中均获得了表达。表达的蛋白质大小分别为19KD、53KD和46KD。重组病毒与载体病毒在IBRS-2细胞上的增殖比较试验表明外源基因的插入不影响重组伪狂犬病病毒在细胞上的增殖滴度。 3．三株重组伪狂犬病病毒的免疫原性研究 利用已构建的三株重组病毒在鸡胚成纤维细胞上培养增殖后制备成冻干的猪乙 华中农业大学博十学位论文 型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗。动物实验表明,其对小鼠和猪是安全的,而 且免疫的Balb/c小鼠和断奶仔猪均产生了针对PRV和JEV的特异性免疫应答。重组 病毒TK,/gG’用rM一E+和TK一G护rM一E一Nsl+产生的JEV抗体和特异性cTL活性基本 一致,均略低于JEv弱毒疫苗株,而TK一/gG护rM+产生的特异性免疫应答稍差些。 统计分析表明所有重组病毒产生的CTL活性与阴性对照相比,差异极显著(P< 0.01)。 三株重组病毒和载体病毒免疫猪在首免后8周所产生的PRV抗体水平差异不显著 印>0 .05)。结果表明重组病毒TK’/gG一用rM一E+和TK一/gG护rM一E一NSI+可以作为预防猪 乙型脑炎和伪狂犬病的二价基因工程疫苗。 关键词:乙型脑炎病毒:伪狂犬病病毒;基因克隆;重组病毒载体疫苗

关键词： HIV-1   人源基因工程抗体   噬菌体展示技术   链置换  

摘要： 目前，HIV-1感染的预防和控制对人类来说仍然是一个未解的难题。HIV-1为单链RNA病毒，属于逆转录病毒科(Retroviridae)，慢病毒亚科(Lentivirus)。该病毒为圆形或椭圆形，直径约90～140nm，外层为类脂包膜，表面有锯齿样突起，内有圆柱状核心，病毒的包膜是糖蛋白gp160(由gp120和gp41组成)，为该病毒的结构蛋白，其中gp120为外膜蛋白，gp41为跨膜蛋白(trans-membrane protein)。gp120与CD4结合后相互作用，引起gp120发生一系列构象变化，进而形成高亲和力的CCR5／CXCR4结合位点，协助HIV-1进入宿主细胞。结构蛋白还包括p24核心蛋白和p18基质蛋白。目前的许多研究表明，针对该病毒的中和表位主要存在于gp160。 本课题运用噬菌体抗体库技术，以期获得人源抗HIV-1 gp160基因工程抗体。首先采集无症状、HIV-1抗体滴度高的HIV-1感染者全血，分离淋巴细胞后提取总RNA，反转录为cDNA第一链，然后利用一组人源抗体IgG1 Fab段基因的引物对抗体的轻链和重链Fd段基因进行PCR扩增，再将扩增后的轻链、重链基因先后克隆到pComb3X载体，转化XL1-Blue，在辅助噬菌体的辅助作用下，构建了噬菌体抗体库，库容为8×10，最后用预包被gp160的ELISA板对噬菌体抗体库进行筛选，经过三轮“吸附—洗脱—富集”的筛选过程，将获得的克隆进行诱导表达，表达产物经ELISA检测，结果获得11株抗HIV-1 Fab克隆。 在pComb3X载体中，轻链和重链Fd基因的信号肽分别为ompA和pelB，以这两个信号肽为模板，分别设计了轻链和重链的测序引物，对所获得的11株阳性克隆的轻链和重链基因进行了测序。运用EMBL EBI数据库提供的ClustalW对所获得的轻链基因序列和重链基因序列进行了同源性比较，结果获得了10条轻链基因(κ、λ链各5条)，8条重链基因;通过与HIV序列数据库中的基因

关键词： 江苏   育成   白菜   西瓜新品种   蚕豆   鉴定   云南   香石竹   上海   南瓜   花卉   胶囊   生态肥   动物  

关键词： 动物免疫学   促长   基因工程疫苗   高科技成果   促生长作用   研制开发   推广应用   生长抑素   国际领先   动物生长   设计   江苏   技术   湖南   国家  

摘要： 由我国著名动物免疫学家杜念兴教授设计,经过10多年的努力,研制开发的用于促进动物生长的新型生长抑素基因工程疫苗(又名激生1号)问世.该技术属国家863高科技成果,处于国际领先水平,在江苏、湖南等省推广应用10多万头动物表明,这种疫苗对动物具有明显的促生长作用.

关键词： 日本血吸虫   模拟肽   亚克隆   联合免疫   免疫保护  

摘要： 目的:为寻找有价值的日本血吸虫(Sj)疫苗候选分子和诊断抗原,该课题从模拟表位肽的筛选、基因筛选、亚克隆与表达及免疫保护性等方面进行了研究;为了加强DNA疫苗的免疫保护效果,作者采用联合免疫方案进行免疫,并对其免疫保护机制进行了初步探讨.结论:1采用噬菌体随机肽库技术可获得模拟日本血吸虫雌虫抗原表位的短肽分子,这些短肽分子能诱导一定程度的保护性免疫;2 SjFE1基因编码的抗原分子有可能参与胞浆和胞核内的重要信号转导过程,其保护免疫效果有待进一步研究;3 Sj-Ts1基因亚克隆至pGEX-5X-3载体后可在大肠杆菌中高效表达,表达产物能诱导小鼠产生一定程度的抗Sj保护性免疫力;4 SjMf1重组DNA疫苗及重组蛋白疫苗均可诱导小鼠产生一定的免疫保护作用,两者联合免疫保护效果优于单一疫苗.SjMf1重组DNA疫苗主要诱导Th1'型细胞免疫应答,重组蛋白疫苗主要诱导Th2型体液免疫应答,联合免疫在增进细胞免疫的同时也伴有体液免疫的加强.

关键词： 双价单链抗体   大肠癌   ND-1  

摘要： 前言 大肠癌是发病率很高的恶性肿瘤之一，在我国已居第四位，并且死亡率呈逐年上升趋势，探讨有效的诊断和治疗手段是大肠癌研究的重要课题。用单克隆抗体作为载体的大肠癌导向诊断和治疗已经取得了一定进展，但是完整单抗由于分子量较大，致使穿透组织的能力较差，并且绝大多数为鼠源性，对人有较大的免疫源性，因而在肿瘤的显像和治疗中一直未能得到满意的结果。利用基因工程技术改造而获得的小分子抗体，如Fab和scFv等，由于分子量小(Mr25000～30000Da)，可提高穿透组织的能力和血浆清除率，具有良好的诊断价值，但因其只有一个抗原结合位点，其亲和活性明显低于亲本单抗，同时，这种小分子抗体的分子量过小，在体内及靶组织中的滞留时间短，丰度低，因而极大限制了其在肿瘤治疗中的应用。近年来，人们用scFv为构件所构建出来的基因工程双价抗体分子，如minibody，diabody等，因具有双结合位点，使抗体亲和活性大大提高，其分子量适中(55～80kDa)，既保证了抗体在体内组织的穿透能力，又大大改善了scFv在体内清除过快的缺点，在肿瘤的显像和治疗方面显示出良好的前景。 ND-1是宋今丹教授于1983年以人大肠癌细胞系CCL-187为免疫原制备的鼠抗人大肠癌单克隆抗体，已进行的近千例临床病理检测显示，该单抗对高中分化大肠癌组织具有特异结合活性，并优于目前广泛采用的美国商业产品抗CEA单抗。利用ND-1的可变区基因构建的ND-1scFv已经在大肠杆菌中获得功能性表达，实验证实ND-1scFv具有与亲本单抗ND-1相同的结合活性，在荷瘤裸鼠的体内实验中，ND-1scFv亦显示出快速的显像能力和清除速度。然而，和其他scFv类似，ND-1scFv由于分子量小，结合能力单一，在注入裸鼠体内的初期就在肾脏积累并排除，使大部分剂量清除过快，无法在肿瘤部位充分发挥作用，从而限制了其在大肠癌的放免显像和治疗中的作用。 为了提高ND-1scFv在大肠癌的放免显像和治疗中的作用，克服因分子量过小，亲和能力相对较低导致的清除过快的缺点，本研究首次利用基因工 程方法构建ND一1的双价单链抗体ND一lsc(Fv):，该抗体是通过柔性短肤， 即4个甘氨酸和1个丝氨酸(Gly4Ser)，以共价键将两个scFv片段连接形 成，从而使抗体分子在获得双结合能力的同时也增加了分子量，这样既有利 于提高抗体的亲和活性又能改善其在体内清除过快的缺点。ND一lsc(Fv)2 的构建为进一步的体内荷瘤裸鼠实验及大肠癌临床放免显像和治疗提供了 实验依据。 实验材料与方法 利用ND一lseFv表达质粒pET一sa(+)ND一lseFv为模板，通过PCR扩 增scFv基因，在扩增过程中通过引物Pl、P2引人编码Gly4Ser的Unker序 列及用于将其插人到表达载体pET一8a(+)ND一1 scFv的scFv基因下游所 须的酶切位点Sall和凡ndm，PCR产物连接克隆载体pMD18一T形成质粒 pMD18一T unker一ND一1 scFv并转化大肠杆菌，测序鉴定单菌落。从经鉴定的 单菌落提取质粒，将提取的质粒与pET一sa(+)ND一1 scFv经s公FHindln双 酶切、连接形成由编码Gly4 Ser的Unker序列连接的两段scFv基因的串联 序列，即pET一sa(+)ND一1 se(Fv):，将其转化大肠杆菌BUI，调整lpTG浓 度、时间及温度等诱导条件，通过SDS一PAGE确定最佳诱导条件，以最佳诱 导条件大量诱导表达ND一lsc(Fv):，菌体裂解收集包涵体，经变性溶解，Ni- NTA resin亲和层吸柱纯化，复性，纯化后的ND一 lsc(Fv):进行SDS一PAGE电 泳测定其分子量及纯度分析，间接免疫荧光显微法检测其与培养中人大肠 癌细胞系CCL一187细胞的亲和活性。非竞争EUSA法检测并比较ND- lseFv，ND一lse(Fv):及ND一IM汕之间的亲和活性。 实验结果 利用ND一lseFv表达质粒pET一sa(+)ND一lseFv为模板，以引物PI、P2 进行PCR，产物经琼脂糖电泳显示为750bP左右，与s

关键词： 抗Ⅳ型胶原酶   单域抗体   力达霉素   基因工程   融合蛋白   抗肿瘤活性  

摘要： 肿瘤靶向性治疗药物的成功发展在某种程度上依赖于治疗药物的位点特异性输送和被输送药物的生物活性。单抗一直被用来给予其他无选择性的细胞毒药物诸如毒素、放射性核素的选择能力。但是单抗的大分子使其在实际应用中受到诸多限制。来源于小鼠的单克隆抗体3G11具有特异性结合Ⅳ型胶原酶的特性，以其为基础构建导向药物取得了较好的疗效。为了获得更加小型化的抗体片段和肿瘤靶向性免疫治疗药物，本研究分别构建了抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11的单链抗体及单域抗体与力达霉素的基因工程融合蛋白，并分别对它们的活性进行了系列研究。 一、抗Ⅳ型胶原酶单链抗体3G11-scFv在大肠杆菌中的表达、纯化及活性研究 Ⅳ型胶原酶是肿瘤细胞发生侵袭与转移的重要分子基础，也是抗癌药物的新靶点。本研究首先通过PCR扩增得到单链抗体基因，将其克隆入质粒pET-30(+)中，构建重组表达质粒pET-scFv。经酶切鉴定和序列测定后，将pET-scFv转化入大肠杆菌BL21star(DE3)中，进行诱导表达。经定位分析和Western-blot鉴定，表达产物存在于大肠杆菌不可溶性包涵体中，表达量占全菌总蛋白的30％。在变性条件下对包涵体蛋白进行纯化，并经分步透析复性后，每升发酵液可得到约30mg纯度达95％以上的可溶性活性3G11-scFv蛋白。抗原ELISA结果表明，3G11-scFv对抗原Ⅳ型胶原酶的免疫反应呈阳性，抗体亲和常数为6×10M。3G11-scFv还能与肿瘤细胞特异性结合，对KB、H22、Bel-7402和C26等肿瘤细胞均呈阳性免疫反应。在明胶酶谱实验中，单链抗体3G11-scFv表现出对肿瘤细胞分泌的Ⅳ型胶原酶活性强烈的抑制作用，能够使人纤维肉瘤HT-1080细胞和人结肠癌HT-29细胞分泌的Ⅳ型胶原酶负染条带明显减弱，且呈浓度依赖性，而无关抗体抗力达霉素单抗F9则无此作用。Transwell小室模型试验表明，3G11-scFv在体外能明显抑制肿瘤细胞的侵袭，抑制程度与浓度呈依赖关系。此外，3G11-scFv静脉注射对小鼠移植性肝癌22有中度抑制作用。

关键词： 基因工程   抗体   表面展示技术  

摘要： 基因工程抗体(genetically engineered antibodies，GEAb)是按人工设计所重新组装的新型抗体分子，它既保留或增加了天然抗体的特异性和生物学活性，又去除或减少了无关结构，降低或基本消除抗体的免疫原性，使抗体人源化，并改善抗体的药物动力学，具有生产简单，价格低廉，

关键词： 肿瘤   血管内皮   血管内皮生长因子受体   单克隆抗体   单链抗体   微型双功能抗体  

摘要： 肿瘤的侵袭转移是肿瘤治疗失败的主要原因，也是目前肿瘤治疗所面临的主要困难和挑战。70年代以来，人们对肿瘤的发生、增殖、浸润和转移机制的认识有了质的飞跃，研究证实恶性肿瘤的增殖、侵袭和转移与肿瘤诱导的新生血管生成(angiogenesis)密切相关。从抑制肿瘤的血管生成、切断肿瘤细胞的营养供应和转移途径等方面开展的抗肿瘤血管新生治疗已成为近年肿瘤生物治疗中一个十分引人注目的领域，寻找高效的肿瘤血管生成抑制剂已成为当务之急。 KDR(Kinase insert domain-containing receptor，VEGFR一2)作为血管内皮细胞生长因子主要受体之一，在介导VEGF的内皮细胞增殖、迁移、分化、微管形成、血管通透性增加等一系列生物活性中发挥重要作用。从而VEGF／KDR信号传导途径被认为在肿瘤相关的血管新生过程中起到关键作用。通过制备KDR酪氨酸激酶受体抑制剂，阻断VEGF／KDR的相互作用，可以抑制肿瘤相关血管新生，最终达到抑制肿瘤生长、转移的目的。 KDR属酪氨酸蛋白激酶第Ⅲ亚型，在其7个免疫球蛋白样的胞外区中，区域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是配体结合所必需的。其中区域Ⅱ和区域Ⅲ对与VEGF的相互作用提供较大贡献。缺失区域Ⅲ会引起KDR与VEGF结合的亲和力下降1000倍，因此说明区域Ⅲ尽管未必直接参与结合配体，但在VEGF／KDR相互作用中发挥关键作用。 在本研究中，我们直接针对在VEGF／KDR相互作用中发挥关键作用的KDR胞外Ⅲ区，制备单克隆抗体，旨在通过筛选，制备具有抑制活性的抗KDR中和抗体，通过阻断VEGF／KDR的相互作用，达到抑制肿瘤血管新生，抑制肿瘤生长、转移的目的。 我们首先从人脐静脉内皮细胞中克隆到KDR胞外Ⅲ区基因，通过酶切、连接，将其插入含有碱性磷酸酶(phoA)启动子和引导肽stⅡ的分泌型表达载体pAYZ，在大肠杆菌16C9中获得了高效分泌可溶性表达。采用三角瓶摇瓶培养，表