关键词： 猪瘟疫苗   接触性传染病   灭活苗   弱毒苗   基因工程疫苗   防治  

摘要： 猪瘟是猪的一种高度接触性传染病 ,由于其造成巨大的经济损失 ,故而为清除本病作了很多工作。猪瘟疫苗的接种是控制猪瘟的重要手段。猪瘟疫苗包括灭活苗、弱毒苗及基因工程疫苗。猪瘟兔化弱毒苗因其优良的免疫原性是目前猪瘟防治应用最为广泛的疫苗之一。基因工程疫苗是目前猪瘟疫苗研究的热点领域 ,其包括亚单位疫苗、合成肽苗、活载体苗、核酸疫苗等。值得一提的是猪瘟病毒标记疫苗研究近年来发展迅速 ,目前已出现商品化的亚单位标记疫苗 ,可使猪瘟疫苗接种和自然感染区别更为简单、快捷。

关键词： 人乳头瘤病毒   基因工程   疫苗   L1基因   宫颈癌   基础实验  

摘要： 人乳头瘤病毒(HPV)16型感染与宫颈癌的发生、发展密切相关,故研制HPW16型基因工程疫苗对预防HPV感染、控制宫颈癌的发生有重要意义。本研究构建HPV16 L1基因工程菌并进行了基础实验研究。首先采用PCR技术从3例宫颈癌组织中扩增和克隆了HPV16L1基因片段并进行测序。进而构建了pPIC3.5～HPV16L1真核表达工程菌、pQE31～HPV16L1和pGEX4T-HPV16LI原核表达工程菌及杆状病毒-昆虫细胞表达系统。经SDS-PAGE、Westem blot和电镜等手段证明了工程菌表达HPV16 L1蛋白的分子特性和免疫原性,而且,重组菌表达的HPV16 L1可以形成类病毒颗粒(VLP)。经免疫BALB/C小鼠可获得高效价特异血清,证实重组HPV16 L1蛋白具有良好的免疫原性。为进一步研制临床应用疫苗及血清学诊断试剂提供了实验基础。

关键词： 转化方法   再生体系   油菜   目的基因  

摘要： 近 2 0年 ,油菜的遗传转化体系得到了深入的研究 ,用于转化的目的基因也呈多样化。油菜已经建立了子叶、下胚轴、原生质体及小孢子培养的再生体系。目前用于油菜基因转化的方法主要有根癌农杆菌介导法 ,基因枪法 ,PEG法等。

关键词： 鹦鹉热衣原体   重组疫苗   主要外膜蛋白   肉鸡   基因工程疫苗   免疫效果  

摘要： 利用鹦鹉热衣原体重组主要外膜蛋白 (MOMP)在大肠杆菌中的表达产物 ,纯化后与白油佐剂乳化成疫苗。对 3批疫苗物理性状、无菌试验、安全试验、最小保护剂量、效力检验、免疫期、保存期和田间试验等各项技术指标进行了测定。重组MOMP疫苗为乳白色油包水型疫苗 ,黏度为 8s·0 4mL-1;细菌培养阴性 ;10d肉鸡分别以5 0和 10 0 μg注射免疫后 ,观察 14d ,免疫鸡群除一过性发蔫外 ,临床采食、饮水 ,注射部位剖检无异常变化 ;以 2 5 ,5 0 ,10 0和 2 0 0 μg分别免疫肉鸡后 ,30d龄攻毒 ,发现 5 0 μg免疫组可以抵抗病原的攻击 ;选择每只 5 0 μg免疫肉鸡 ,分别在 4 0 ,5 0和 6 0d攻毒 ,其保护率分别为 94 % ,95 %和 84 %。疫苗 2～ 8℃可储存 2 4 0d ,室温 ( 2 1～ 2 5℃ )、37℃不要超过 30d ;利用本疫苗免疫肉鸡 4 0 0 0 0只 ,保护率达 93% ,对照组为 85 %。本疫苗安全性高、保护率高、无副作用 ,能有效控制鹦鹉热衣原体的侵害。

关键词： 瑟氏泰勒虫   基因工程疫苗   缓释剂   综合防治  

摘要： 瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)病是由泰勒科、泰勒属(Theileria)的瑟氏泰勒虫寄生于牛体内的一种血液原虫病。目前该病主要以药物防治为主，但常用药物在体内有效浓度维持时间短，因此，本试验首先复制牛瑟氏泰勒虫病的实验动物模型，然后用其进行了贝尼尔缓释剂、Butalex缓释剂和瑟氏泰勒虫P33基因工程疫苗对牛瑟氏泰勒虫病的防治研究。试验结果表明，hsp-p33 only、hsp-p33 adjuvant和T．s merozoite均显示出较好的保护力，试验动物没有出现临床症状，通过血液检查，试验动物的PCV、RBC等血液指标均在正常范围内。该三种疫苗对牛瑟氏泰勒虫的保护期在50天左右，其中Hsp-p33 adjuvant和T．s merozoite的保护效果较好，而hsp-p33 only稍差。药物组中，Butalex对感染瑟氏泰勒虫的牛的预防效果比贝尼尔好。

关键词： 戊型肝炎病毒   粘膜免疫   佐剂   MF59   疫苗  

摘要： 本研究采用高效廉价的原核表达系统表达了戊型肝炎病毒结构区基因(HEVORF2)编码蛋白,并对其抗原特异性和免疫原性进行了鉴定,然后应用新型人用疫苗佐剂MF59样佐剂将其配制成试验性疫苗,通过粘膜免疫途径免疫实验小鼠,研究其产生粘膜免疫和体液免疫的效果,对新型戊型肝炎病毒基因工程疫苗的研制进行探索.本研究以HEV ORF2基因自身甲硫氨酸作为起始氨基酸高效表达HEVORF2重组蛋白,首次应用新型佐剂MF59配制戊型肝炎病毒基因工程粘膜免疫疫苗,并对MF59进行了改进,使之成为更为经济实用的MF59样佐剂.经小鼠动物实验证实,MF59样佐剂可以增强重组亚单位蛋白抗原的免疫原性,经粘膜免疫途径可引起较好的粘膜免疫反应,这将为新型戊型肝炎基因工程疫苗的研制提供一条新的思路.

关键词： 角蛋白   抗角蛋白自身抗体   噬菌体Fab   噬菌体ScFv   抗角蛋白抗体全长IgG   亲和力   反转录PCR  

摘要： 研究表明，人体内存在的天然抗角蛋白自身抗体(anti-keratin auto antibody，AK auto Abs)存在于人和多种动物体内，构成了免疫系统的基本组成部分，参与免疫自稳态的调节。在一些病理情况下(如银屑病、接触性皮炎等)，AK auto Abs的存在有利于限制病情进展，促进损伤修复，对机体具有保护作用。本室发现AK auto Abs主动介入某些皮肤病的病理生理过程，无论是来自皮损或者正常人血清的AK auto Abs都以剂量依赖的方式抑制角质形成细胞的增殖和分化;输注含高滴度AK auto Abs的人血丙种球蛋白，在部分银屑病患者收到了较好的效果，从血清中提取的AK auto Abs在动物实验中也初步显示了有希望的治疗应用前景，但由于血液制品的来源和安全性问题而限制了AK auto Abs的临床应用。 噬菌体展示技术的出现为不经免疫制备人源性抗角蛋白抗体提供了可能。国内外已经从噬菌体抗体库中成功地制备了多种单克隆抗体，本实验室从半合成的噬菌体抗体库中成功地筛选到抗角蛋白的噬菌体抗体Fab和ScFv，并初步得到可溶性表达的抗角蛋白单克隆抗体Fab，其具有较高的特异性和亲和力，为抗角蛋白NAA的应用及进一步研究提供了良好的手段。研 第四军医大学博士学位论文 究发现，这些抗体片段具有抑制培养的角质形成细胞增殖的作用，从噬菌体 抗体库中筛选出来的抗体分子在很多情况下可满足应用的需要，但由于没有 Fc段而不具备抗体的某些生物学功能，如激活补体、ADCC(抗体依赖性细 胞介导的细胞毒作用)以及免疫调节等。在某些情况下，尤其用于体内治疗 时，需要使用完整的抗体分子。亲和力是抗体的重要参数，在体内只有亲和 力高的抗体才能发挥有效的生物学作用。在生物技术领域，亲和力高的抗体 有着明显较高的使用价值，因此，对于从噬菌体抗体库筛选出的抗体，只有 及时评价抗体的亲和力，才能选择出性能优良的抗体。为此我们选择亲和力 最高的Fab或scFv克隆，克隆抗体的可变区基因，构建真核表达载体，脂 质体Lipofeetamine2000转染二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷的CHO细胞， 在MTx加压条件下，表达抗人角蛋白全长IgG抗体，并检测抗体的生物学 活性。 本室己经从半合成噬菌体抗体库筛选出7株抗角蛋白ScFv和4株抗角 蛋白Fab。通过ELISA检测抗体活性及特异性，并进行了研怂stem blot分析。 筛选亲和力最高的抗体克隆尤其重要，而目前通常采用硫氰酸胺法或生物传 感器来测定抗体的相对亲和力，一由于噬菌体ScFv切除基因m后不能自连， 因此不能表达出抗体片段，也无法预知抗体的活性，不能应用生物传感器测 定抗体的亲和力。因此我们利用曾经筛选到的4株抗角蛋白噬菌体Fab抗体 片段，通过内切酶NFhel切除载体上的基因111，IPTG诱导表达可溶性抗体 Fab片段，应用镍亲和层析柱纯化抗体，生物传感器测定抗体亲和力，选择 亲和力最高的克隆。亲和力最高的克隆质粒送上海生物工程公司测序，根据 测序结果和前导序列设计扩增抗体轻、重链可变区(VK和VH)基因以及连 接前导序列的引物。经过PCR扩增带有前导序列的轻、重链可变区基因(LK 和LH)。经Xbal和BamHI酶切LK，分别插入同样酶切的载体pWD和pWSD3， 构建带有LK的载体pWD、和pWSD3K;经Xhol和Hind 111酶切LH，分别插 入同样酶切的载体pWDK和pWSD3K，构建带有目的基因轻、重链抗体可变区 基因的真核表达载体pWD出和pwSD3妞。分别进行酶切、PcR和测序鉴定 正确:经LipofectamineZo00转染CHo(dhfr一)细胞，72小时后检测抗体的瞬 时表达;在氨甲喋吟伽TX)加压筛选条件下，亚克隆化筛选稳定表达的细胞 第四军医大学博士学位论文 系，Rl’- pCR检测抗体在mRNA水平的表达，ELISA检测抗人角蛋白全长IgG 抗体的表达，W七stem blot分析抗体识别角蛋白的相对分子质量;收集表达的 上清液，作用于培养的鳞癌细胞，MTT检测表达的全长IgG抗体对细胞增 殖的影响。 本实验发现，7株人抗角蛋白噬菌体SeFVHAKSS、HAKS 19、HAKS 21、 HAKS 24、HAKS 28、HAKS 31和HAKS 41能特异性识别人角蛋白，而与 转铁蛋白、胰蛋白酶、人工gG、TRP一1等抗原无交叉结合反应，其识别角蛋 白的相对分子质量约在56 000一57 000之间，包括角蛋白K5和K6;DNA测 序表明HAKSS、19和21的VL属人19入链第二亚群，HAKS 24和28的VL 属人Ig入链第一亚群，HAKS31和41的vL属人IgK链第三亚群;HAKSS 的重链可变区基因(vH)属人IgG第一亚群，噬菌体

关键词： 动物传染病   基因工程疫苗   分子鉴别   兽医工作者   重大课题   疫苗接种   控制   方法   养殖业   制约   责任   预防   健康  

摘要： 动物传染病是制约全球养殖业健康发展的主要因素,因而有效地预防、控制和最终消灭动物传染病是当前兽医工作者面临的重大课题和所应肩负的责任.疫苗接种尽管不是控制动物传染病发生和流行的唯一方法,但却是目前公认最有效、最实用的方法.

关键词： HER2/neu   CD16   双特异性抗体   克隆   表达  

摘要： 双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)是增强以抗体为基础的肿瘤免疫治 疗效果的发展方向之一。BsAb含有两种特异性抗原结合位点，能在肿瘤细胞和免 疫效应细胞之间架起桥梁，触发细胞毒反应，产生导向性的杀伤肿瘤效应功能。 本研究采用基因工程方法构建了抗HER2／neu×抗CD16 BsAb，并对其抗原结合特 性及杀伤HER2／neu过表达肿瘤细胞功能进行了初步研究。本研究分四个部分。 1 抗人CD16单克隆抗体可变区基因的克隆、表达及免疫学特性分析 采用5’-RACE(rapid amplification of cDNA end，RACE)克隆策略，从分泌抗 人CD16单抗的杂交瘤细胞B88-9获得了抗人CD16单抗的重、轻链可变区(VH、 VL)及前导肽序列。采用重叠延伸拼接法，通过PCR将VH、VL和Linker Peptide (连接肽)序列在基因水平上拼接，直接合成scFv基因;scFv与人IgG1 Fc区基 因片段插入载体pCI-neo构建了scFv-Fc融合蛋白表达载体并在CHO细胞中进行 了表达。通过G418筛选获得稳定高表达克隆。更换无血清培养基培养，经重组蛋 白A亲和层析柱纯化scFv-Fc融合蛋白。采用人外周血单个核细胞(PBMC)进行 双色荧光流式细胞分析，结果表明抗CD16 scFv-Fc能够与表达CD16的CD56+ NK 细胞特异结合。 2 抗人HER2／neu scFv-Fc融合蛋白的表达及免疫学特性分析 为检测抗人HER2／neu单抗VH、VL融合构建的scFv的免疫学特性，将scFv 基因与人IgG1 Fc区基因片段插入载体pCI-neo构建了scFv-Fc融合蛋白表达载体 并在CHO细胞中进行了表达。通过G418筛选获得稳定高表达克隆。更换无血清 培养基培养，经重组蛋白A亲和层析柱纯化scFv-Fc融合蛋白。融合蛋白与乳腺 癌细胞SK-BR-3裂解液共孵育可特异性地沉淀出185 kD HER2／neu蛋白;流式细 胞分析表明融合蛋白识别HER2／neu蛋白的胞外段;ELISA测定融合蛋白对细胞表 面抗原HER2／neu的亲和常数为1． 33×10-9mol／L。 3“杵臼结构”修饰CH3结构域构建抗HER2／neu×抗CD16双特异性抗体 采用基因工程技术修饰人IgG1 Fc区CH3结构域，将一个CH3结构域的407 位大分子酪氨酸(Y)突变为小分子苏氨酸(T)，形成“臼状结构”突变体，在该 突变体的N端融合了抗CD16 scFv;将另一个CH3结构域的366位T突变为Y形 成“杵状结构”突变体，在该突变体的N端融合了抗HER2／neu scFv。用含有两个 突变体的载体共转染CHO／dhfr细胞，有限稀释法克隆化培养，采用G418和MTX 博士学位论文 中文摘要 进行加压筛选。ELISA检测各克隆BsAb表达水平，筛选到一个高表达克隆F7， 表达量达到13.4林岁ml。通过逐步降低培养基中的血清浓度，实现了F7克隆的无 血清悬浮培养。采用重组蛋白A进行亲和层析纯化，获得了BsAb纯化蛋白。流 式细胞分析结果显示BsAb能够与HERZ/neu和CD16分子特异结合。体外实验结 果表明，与治疗性单抗HereePtin⑧相比，BsAb能够更加有效介导PBMc对 HERZ/n eu过表达肿瘤细胞的杀伤，P<0.001。 4三价双特异性抗体的设计及构建 采用人IgGI重链第一恒定区(CHI)和K链恒定区(CL)结构域作为异二聚 化结构域，设计并建立了三价BsAb构建方法。在三价BsAb中，设计与效应细胞 以单价结合，体内应用可以避免或减轻全身性效应细胞活化引起的副反应;设计 与靶细胞以双价结合，其对靶细胞具有更高的亲和力，增强了导向功能，用于体 内治疗时将更快地定位于肿瘤部位。以抗HERZ/n eux抗CD 16 BsAb为例，构建了 三价BSAb并在原核系统中进行了表达。

关键词： 基因工程抗体   Fab产业化   高密度发酵   生产工艺  

摘要： 目的： 1．在摇瓶水平上对可影响大肠杆菌生长及外源蛋白表达的因素进行多因素分析，明确这些影响因素对菌体生长及表达的影响程度。 2．在BioFlo110型发酵罐中摸索高密度发酵方法，确定合理的发酵路线;3．探索具有可放大的、非特异性纯化目的抗体片段的工艺路线。 方法： 1．通过预实验及文献回顾，确定出需实验考察的可能影响大肠杆菌生长及外源蛋白表达的8个因素。采用Plackett-Burman多因素两水平分析法和Box-Behnken响应面分析法对这8个因素进行多因素交互作用的实验设计，随后按照设计要求在摇瓶水平上进行实验;2．在BioFlo110型发酵罐中考察不同的补料模式可能实现的发酵水平及蛋白表达水平。考察3种补料模式：恒速补料、指数补料及溶氧反馈控制补料。 3．在纯化路线设计方面，先以经过Ni敖合层析的抗体为“标准品”，摸索阳离子交换柱和疏水层析柱的纯化条件;随后按照自行设计的组合层析策略，将获得的菌体冻融上清经预处理后按照弱阳离子CM柱、疏水phenyl柱及凝胶过滤S200柱的顺序依次纯化;最后将得到的抗体以非竞争性ELISA法测定与乙肝表面抗原的亲和活性。 结果： 1．在对影响基因工程重组菌Fab／pBAD／gⅢ TOP10生长特性的多因素分析中，对可能影响菌体生长的8因素两水平分析后重要性排列的结果依次为：发酵起始pH、微量元素、体系载液量的水平、培养初期体系葡萄糖浓度、摇床转速、发酵过程的温度控制、培 养体系中乙酸水平、以及诱导剂对生长过程的影响。其中，控制 培养体系的pH值及微量元素的含量对生长影响最重要。对可能 影响重组菌表达特性的3因素多水平分析的结果表明:诱导剂作 用的浓度、诱导时间以及两者的交互作用对目的抗体表达的影响 最重要。 考察恒速补料、指数补料及溶氧反馈控制补料3种补料方式对发 酵及表达效果的结果表明:从获得的菌量来看，以溶氧反馈控制 补料模式获得的菌体量最高，可达OD55.8左右(相当于湿菌重 128岁L)，发酵的时间最长，达10个小时，获得的抗体产量最高， 达到125m叭(发酵液)水平。但是从产率来看，恒速补料的单 位菌体产率可达1.23m留g，单位时间内的产率为13.48m留g。结 合考虑发酵过程中的氧耗成本及补料成本进行综合分析，很难从 单一指标断定哪种补料模式为最佳。从我们实验室的发酵罐的硬 件配置来看，最优的选择似乎是恒速补料，尽管该模式的总体产 量较低，但是其单位菌体产率及单位时间的产率较高，同时操作 最简单而消耗的成本又最小。 在纯化路线的设计中，我们以经过Ni2+敖合层析纯化的Fab为替 代标准品，先后确定了CM柱及HIC柱的纯化条件，证实了采用 CM柱及HIC柱的可行性。随后将预处理后的冻融上清顺次过 CM层析柱、HIC柱及GF柱纯化，比较理想地获得了目的抗体。- 在随后的重复实验中，我们测定了各个色谱柱的纯化效率，对于 以替代标准品直接过柱而言，CM柱及GF柱的目的抗体纯化效 率可以达到90%左右，而HIC柱则接近80%，整体效率约65% 左右。抗原结合活性测定方面，我们采用的是非竞争性EUSA法， 计算出Fab亲和常数在107一1护M一，水平，比完整抗体anti一HBsAg IgG亲和常数(108一1护M一‘)小约1一2个数量级，表明该Fab抗原 结合能力较强，在经过3个层析柱的纯化后仍可以保持较好的抗 原结合活性。 结论: 我们在摇瓶水平上确定了能够影响宿主菌生长的最重要因素为培养 一3一 体系的pH值及微量元素的含量，可影响宿主菌表达目的抗体的重要因 ，素为诱导剂作用的浓度、诱导时间以及两者的交互作用;在发酵罐发酵 水平上，比较了不同的补料发酵模式可以实现的工程菌高密度发酵及高 效表达的水平，从我们实验室的发酵罐的硬件配置来看厂，最优的选择是 恒速补料，尽管该模式的总体产量较低，但是其单位菌体产率及单位时 间的产率较高，同时操作最简单而消耗的成本又最小;在纯化工艺探索 方面，完成了以组合层析策略(弱阳离子CM、疏水柱phenyl以及凝胶 过滤5200)纯化目标抗体路线的构建。实验结果表明，采用我们构建的 发酵方法及纯化路线，获得的抗体产量及成本均比较满意，且活性良好。 我们的实验从实验室水平向工业生产过渡的角度，完成了 anti一HBsAg Fab/P BAD/gl n TOPlo原核表达体系的大规模培养及目的抗 体批量纯化工艺路线的构建，为基因工程抗体的表达和纯化从实验室水 平向工业化生产的过渡奠定了基础。