关键词： 玉米出口   海南   进口大豆   豆粕价格   皖南土鸡   禽流感病毒   流感病毒群   养殖协会   鸡肉   禽肉   基因工程疫苗   玉米价格   畜牧业   牧业   苏丹红染料   广东温氏集团   饲料厂   加工厂   畜禽产品   信使   消息   新闻  

关键词： 甲型肝炎病毒   人源基因工程抗体   植物表达系统   植物悬浮细胞培养   酵母细胞表达系统  

摘要： 甲型肝炎病毒(以下简称甲肝病毒或HAV)属于小RNA病毒科肝炎病毒属，是甲型肝炎的致病因子，主要通过被污染的水和食物经粪口途径传播，人群普遍易感，每年甲型肝炎占我国急性病毒性肝炎的首位，是严重危害人民健康的疾病。甲肝病毒感染后虽不易引起慢性感染，但会给国家和个人造成巨大的经济损失，如1988年的上海甲肝大流行。 甲肝病毒是没有包膜的病毒颗粒，含有一个单股正链RNA，抗原结构保守。虽有不同的基因型，但只有一种血清型。目前有疫苗可以预防甲肝病毒的感染，但并没有纳入计划免疫，并且对甲肝病毒先期暴露后的感染无预防作用；而高效价人源免疫球蛋白作为一种被动免疫手段，在一旦有流行症状时使用，是一种有效的应急措施。但人源制品来源困难并且可能有病原微生物的污染，动物抗体因异种蛋白不宜应用。随着分子生物学和免疫学的发展，我们已经成功地从噬菌体抗体库中筛选获得了中和性人源抗甲肝病毒基因工程抗体基因，并分别在杆状病毒和CHO细胞表达系统中进行了IgG抗体的表达。 植物表达系统与大肠杆菌***，酵母细胞，杆状病毒以及CHO细胞表达系统相比，具有许多优点：植物表达系统因其本身是自然界的一部分，参与自然界中的各种循环，可以大规模生产，成本低廉；有成熟的大量收获和加工植物及植物产品的现成技术，同时可最大程度地降低有可能影响人类健康的病原微生物或有毒物质的污染；具有真核基因表达调控及转录翻译加工的成套系统；另外某些植物可直接食用，可用于生产口服疫苗或药品从而降低了纯化的费用；外源蛋白在植物中表达后一般比较稳定，方便了产品的储藏和运输等等。目前已有多种形式的抗体在植物中进行了表达，包括scFv，Fab，IgG，IgA抗体等。 为建立新的抗体高效表达系统，完善抗体工程平台，为新型基因工程抗体药品的生产和制备提供实验基础，也为探索用植物中生产的抗体来纯化相应的抗原以及体外诊断的应用等打下基础，我们在植物中表达了多种形式的人源中和性抗甲肝病毒基因工程抗体，并对其生物学功能进行了比较分析。本论文主要由以下内容组成： 1在大肠杆菌***中表达人源中和性抗甲肝病毒scFv抗体，并对其生物学特性进行鉴定。利用一株已筛选出的中和性人源抗甲肝病毒HAFc16IgG抗体基因经过PCR扩增和克隆，构建VH-linker-VL型单链抗体(scFvHA16)并在大肠杆菌中表达，经鉴定，表达抗体具有很好的与甲肝病毒抗原的结合活性。 2因为在植物中表达抗体耗时较长，我们首先在Pichiapastoris酵母中表达人源中和性抗甲肝病毒scFv-Fc融合抗体，并对其生物学特性进行鉴定。将上述的scFvHA16抗体基因克隆入含有人源Fc片段的酵母细胞表达载体pPiCZαFc中，得到融合抗体表达质粒pPiscFv-FcHA16，并在Pichiapastoris酵母中进行分泌表达，对表达产物进行了纯化。WesternBlot显示表达的蛋白带为具有不同糖基化形式的同源二聚体，ELISA以及体外中和实验表明表达的融合抗体仍保持了很好的生物学活性，与相应的CHO细胞中表达的CHOIgGHA16抗体相比，没有明显的区别。 3用双子叶植物种子储存蛋白特异性启动子Pfas构建了中和性人源抗甲肝病毒scFv-Fc融合抗体表达质粒patag6pfasscFv-FcHA16，同时还构建了另一株人源抗大肠杆菌麦芽糖结合蛋白MBP的融合抗体表达质粒pata6pfasscFv-FcMBP作为对照(此两个表达质粒均含有内质网定位信号KDEL)，并分别转化了拟楠芥植株。对拟楠芥转基因植株种子中表达蛋白的SDS-PAGE及WesternBlot分析表明，种子中表达的patag6pfasscFv-FcHA16融合抗体大部分降解了，分析表明这种降解是发生在植株体内而不是发生在抗体提取过程中；另一株对照抗体pata6pfasscFv-FcMBP则得到了很好的表达，表达蛋白占拟楠芥植株种子中可溶性蛋白的15％左右。本结果说明植物中抗体表达量与抗体本身的序列密切相关。 4用花椰菜嵌纹病毒35SRNA基因启动子P35S(此启动子为组成性启动子，理论上在植株的任何器官都能表达)构建了中和性人源抗甲肝病毒scFv-Fc融合抗体表达质粒P35SscFv-FcHA16+KDEL及P35SscFv-FcHA16-KDEL，并分别转化了生长中的拟楠芥植株及拟楠芥悬浮培养细胞(来源于拟楠芥植株的叶子)。对拟楠芥悬浮培养细胞中表达蛋白的分析表明，P35SscFv-FcHA16+KDEL质粒得到了很好的表达，表达蛋白占细胞中可溶性蛋白的1％以上；而P35SscFv-FcHA16-KDEL质粒表达的蛋白则大部分降解了。对拟楠芥悬浮培养细胞中表达的P35SscFv-FcHA16+KDEL融合抗体进

关键词： 大商所   林牧   饲料工厂   专业学组   禽流感病毒   流感病毒群   期货合约   渔业经济学   科研基地   国家实验室认可   兽药管理   畜禽养殖   基因工程疫苗   行业动态  

关键词： 溶藻弧菌   抗独特型抗体   单链抗体   单克隆抗体   基因工程疫苗  

摘要： 鱼病已成为水产养殖业发展的主要障碍,制约着水产养殖业的发展。鱼病的现有防治方法多使用各种化学药物、抗生素和减毒、灭活疫苗。抗生素的长期使用易使鱼类产生耐药性,而且抗生素的残留会通过食物链对人类造成危害。而现有的传统疫苗的安全性难以掌握。灭活疫苗由于使用物理、化学的方法灭活,在制备过程中抗原活性有可能受到破坏,并且残留的细菌内毒素及其它杂质可能会使鱼体出现炎症而死亡。减毒疫苗保留的部分毒性会影响周围环境的生物。国内外水产科技工作者正积极寻求防治效果好,安全性高,不产生抗药性,无药物残留,而且不会造成环境污染的防治鱼病方法。 国外已有新型疫苗出现,如核酸疫苗,合成肽疫苗及抗独特型抗体疫苗等,但这些新型疫苗在安全性、廉价性等方面各有优势也各有缺陷,由于各种原因目前还停留在实验室阶段而未能大量用于养殖渔业。目前对于抗独特型抗体疫苗作为新一代疫苗日益受到重视。针对

关键词： 基因工程疫苗   诊断技术  

摘要： 最近20年,畜禽基因工程疫苗及动物疫病诊断技术的开发随着基因工程技术的发展取得了显著的进展。伪狂犬病毒基因缺失疫苗及其相应的鉴别诊断技术,成功地应用于猪伪狂犬病根除计划,表明基因工程标记疫苗将具有广阔的应用前景。本文将针对畜禽基因工程疫苗及诊断技术的研究开发和产业化现状及发展前景作一概述。

关键词： 前列腺素D合成酶   男性生殖   单克隆抗体   可变区   基因克隆   基因工程抗体   单链抗体   原核表达系统   人—鼠嵌合抗体   真核表达系统   酶联免疫吸附试验  

摘要： Lipocalin型前列腺素D合成酶(Lipocalin-type Prostagladin D Synthase,L-PGDS)亦称β-trace蛋白,是机体组织屏障的主要成分,属Lipocal in家族。L-PGDS主要分布于哺乳动物的中枢神经系统和雄性生殖器官,并分泌至脑脊液、血清、精液、尿液、羊水等体液中。L-PGDS是一种双功能蛋白,除催化PGD产生外,亦可结合和运输亲脂/疏水分子。该蛋白具有广泛的生理学作用,它不仅与睡眠诱导、体温调节、感受伤害、气味应答等有关,亦是一种生育相关蛋白,可能参与精子的发生和成熟。研究表明,L-PGDS与许多疾病密切相关,如L-PGDS不同程度地表达于卵巢癌、乳腺癌等组织,病毒性脑膜炎、脑脊膜瘤、椎管狭窄、脑栓塞等病人的CSF中L-PGDS明显升高。 为了建立L-PGDS的免疫学检测方法并探讨其在男性生殖系统中的具体功能、代谢过程、作用机制以及与男性不育的关系等,本实验室以毕赤氏酵母表达了人睾丸L-PGDS抗原,成功制备了兔抗人L-PGDS多克隆抗体和鼠抗人L-PGDS单克隆抗体。兔源多抗实际上是多种抗体的混合物,具有不均一性,无论是对抗体分子结构与功能的研究还是临床应用都受到很大限制;而特异性鼠单抗具有异源性,应用于人体研究会引发人抗鼠抗体的毒性反应,并使抗体在体内消除加快等。因此,应用于临床的理想抗体应是人源的,但人一人杂交瘤技术目前尚未突破,且还存在人-人杂交瘤体外传代不稳定、抗体亲合力低及产量不高等问题。目前解决此问题的较好办法之一是研制基因工程抗体,代替鼠源单抗应用于临床。本研究试利用基因工程技术,构建和表达目前研究较多也较成熟的单链抗体、人—鼠嵌合抗体,为L-PGDS的功能性研究以及临床相关疾病的诊断、治疗奠定基础。 本研究第一部分首先采用RT-PCR技术,以一组自前导序列的简并引物,从1株稳定分泌抗人L-PGDS单抗的鼠杂交瘤细胞中扩增出抗体的轻链可变区基因2个、重链可变区基因1个:然后分别克隆至pGEM-T载体,并测序。测序结果表明,其中1个V k为鼠骨髓瘤细胞系中固有的无功能基因:另一V k和VH经KabatIg比对分析,与其同源性较高的序列均为鼠免疫球蛋白可变区基因,且碱基序列符合鼠抗体可变区特征。 本研究第二部分利用一柔性连接短肽[(Gly)Set],SOE PCR法将上述重、

关键词： 口蹄疫病毒   伪狂犬病病毒   猪细小病毒   重组伪狂犬病病毒   基因工程疫苗  

摘要： 口蹄疫、猪细小病毒病与伪狂犬病是危害全球养猪业的三种重要传染病,分别由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)、猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引起。当前猪细小病毒病和伪狂犬病等猪繁殖障碍性传染病在我国很多猪场流行,造成大量死胎、流产及猪生产能力下降,危害严重。口蹄疫则是人畜共患的急性、烈性传染病,由于其传染性极强,而传统灭活疫苗在生产使用过程中有灭活不彻底导致病毒逃逸工厂而发生口蹄疫的风险,因此口蹄疫基因工程疫苗的研究受到高度重视。 伪狂犬病病毒具有不感染人、基因组容量大、重组病毒遗传稳定等特点,适合改造成表达外源基因的活病毒表达载体,以伪狂犬病病毒基因缺失株为表达载体构建基因工程疫苗,将其它病原的保护性抗原基因插入PRV基因缺失疫苗株中,就可构建成二价或多价基因工程疫苗,从而在猪场疫病免疫中起到一针防多病的作用。 1.口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗的研究 将口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因共同插入到重组载体pIECMV中,构建重组伪狂犬病病毒转移载体pIEP1-2A-3C。采用脂质体介导法将pIEP1-2A-3C与伪狂犬病病毒基因缺失标志疫苗株PRV TK/gE/LacZ基因组共转染,构建了表达口蹄疫病毒P1-2A和3C基因的重组伪狂犬病病毒TK/gE/P1-2A-3C,并用空斑筛选与PCR鉴定的方法纯化重组病毒。进行Western blot鉴定和测定重组病毒在不同细胞上的增殖滴度,结果表明重组病毒构建正确且外源基因获得有效表达,其增殖滴度与亲本株相比差异不明显。遗传稳定性和安全性检测表明重组病毒稳定性、安全性良好,重组病毒免疫BALB/c小鼠后用ELISA检测血清中FMDV抗体,并测定FMDV中和抗体效价,结果表明重组病毒可诱导小鼠产生明显的免疫反应,从而为伪狂犬病与口蹄疫二价基因工程疫苗的研制应用打下基础。 2.口蹄疫—猪细小—伪狂犬病三价基因工程疫苗的研究 将口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1-2A基因和猪细小病毒VP2基因共同插入到重组载体pIECMV中,构建重组伪狂犬病病毒转移载体pIEPI-2A-VP2,经PCR和酶切鉴定证实质粒构建正确且两个表达框为反向插入。采用脂质体介导法将pIEP1-2A-VP2与伪狂犬病病毒基因缺失标志疫苗株PRV TK/gE/LacZ基因组共转染,构建了共表达口蹄疫病毒P1-2A基因和细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病病毒PRV TK/gE/P1-2A-VP2,并

关键词： 茶树   育种   基因工程   应用现状   高新技术   发展前景   新发展   基本概念   领域  

摘要： 基因工程是新发展起来的一门高新技术,已在各个领域得到了应用。本文介绍了基因工程的基 本概念,综述了在茶树育种中的应用现状及发展前景。

关键词： 基因工程疫苗   家畜   寄生虫   养殖条件   囊虫   药物残留   集约化养殖   研究进展   疟原虫   弓形虫  

摘要： 随着集约化养殖业的发展,寄生虫病在畜禽密集养殖条件下显示的危害日趋严重。各种抗寄生虫药物预防虽然带来可观的经济效益,但是药物残留带来的食品与环境问题促使人们将眼光集中于疫苗的研发上面。近年来寄生虫基因工程疫苗的发展亦日益广泛,本文主要对囊虫及绦虫病疫苗、疟原虫疫苗、利氏曼原虫疫苗、隐孢子虫疫苗、弓形虫疫苗和巴贝氏虫疫苗等研究进展作一综述。

关键词： HbsAg   Fab段   表达   复性  

摘要： 1 材料和方法 1.1 表达质粒的构建从含有人源性抗HBsAg抗体Fab段基因的噬菌体[1]中扩增出重链Fd片段,上游引物5'gcggaattcatatggtt(G)aaactgctg(C) gaa(G) cagtctg'cggaattcattaa(T)g(C)ag(A)gtc(T)ttgtcacag(A)gac(T)ttt(G)gg t(C)t(C)caactttc3';从上述噬菌体中扩增出轻链基因,上游引物5'gcggaattcatatggaa(G)ctg(C) gtt(G) atgact(C)cagtctccagacacc3'和下游引物5'cggaattcattaacat(C)tca(T)cc t(C)ct gttgaa gctcttc3'.