关键词： 猪带绦虫   45W-4B   TSO18   疫苗   免疫保护效果  

摘要： 囊虫病(Cysticercosis)是由猪带绦虫(Taenia solium)的幼虫猪囊尾蚴寄生于人或猪等中间宿主丽引起的人畜共患寄生虫病,在中国大部分地区尤其在少数民族地区是一个重要的公共卫生问题,对人的健康危害很大。不仅如此,囊虫病的广泛存在还造成畜牧业的重大经济损失,极大影响了我国畜产品在国际市场上的竞争力,因而是公认的社会经济病之一。猪囊尾蚴病的免疫预防之所以一直困扰着兽医工作者,主要原因是抗原来源非常有限。羊绦虫45W重组基因工程疫苗的研制成功,为猪囊尾蚴重组基因工程疫苗的研制提供了典范。为了探索猪带绦虫45W-4B和TSO18重组抗原对猪囊尾蚴感染的免疫保护效果,获得具有良好免疫保护作用的重组抗原,用做猪囊虫病的免疫预防,我们进行了本项研究。 收集成熟的猪带绦虫虫卵,经孵化和激活后,提取六钩蚴总RNA,设计特异性引物RT-PCR扩增45W-4B和TSO18基因,测序证实扩增产物与国外克隆的猪带绦虫45W-4B和TSOL18的同源性分别为99.5%和99.6%,说明TSO18和45W-4B在不同虫株间相对保守。用蛋白质专家系统对TSO18和45W-4B进行结构预测,发现它们都有分泌信号序列、FnⅢ结构域以及糖基化、磷酸化位点。根据预测结果PCR扩增截去45W-4B基因的N端信号肽和C端疏水氨基酸序列,获得45W-4BX。将TSO18和45W-4BX经限制性内切酶处理后与相同处理的表达载体pGEX-4T-1连接,转化BL感受态细胞,酶切及PCR扩增鉴定获得两基因的重组表达菌株。经测序证明阅读框完全正确,用IPTG诱导表达,产物进行SDS—PAGE分析,发现在合适的诱导温度和IPTG浓度下,分别获得了高效表达且以可溶性形式存在的45W-4BX和以包涵体形式存在的TSO18重组蛋白。Westernblot分析表明无论是感染初期的猪囊尾蚴血清还是人囊虫阳性血清均可被两种重组蛋白所识别。 分别用纯化的GST、TSO18、45W-4BX重组蛋白和猪囊尾蚴粗提物为抗原,以206为佐剂制成疫苗免疫猪,用25000枚猪带绦虫虫卵攻击感染,ELISA测定不同时间各组的抗体水平,同时用MTT法分析免疫和感染后猪外周血淋巴细胞增殖情况。结果表明,免疫后15d抗体水平开始上升,在感染后30d左右达到峰值,且至少在免疫后90d内保持阳性水平。猪免疫后外周血淋巴细胞略有增殖,而在感染后10d迅速升高,21d时基本降至未免疫对照组的水平。感染后90d剖检猪,计数各组的囊尾蚴感染数,结果发现TS018和45W-4BX单独免疫组的减虫率分别达95%和94%,与猪囊尾蚴粗抗原免疫组(减虫率为92%)的保护效果相当。而TSO18+4BX+IL4免疫组的减虫率为99.7%,完全保护率达80%,保护效果明显优于粗抗原对照组。在补体参与下,TSO18和45W-4BX抗体对六钩蚴的杀伤作用大大增强,六钩蚴的存活率分别从90%和85%下降到55%和70%。TSO18在补体存在下杀伤六钩蚴的作用与未加补体对照间存在显著差异(P=0.024<0.05)。囊尾蚴抗体水平的测定表明,虫体负荷与抗体水平间不存在相关性。重组抗原的稳定性分析发现,TSO18保存3个月后免疫猪减虫率降低了51%,保存两个月后含量检测发现1/3的蛋白已经降解,表明TSO18

关键词： 口蹄疫病毒   基因组   序列分析   3ABC   酵母表达   重组鸡痘病毒   重组核酸疫苗   免疫应答  

摘要： 采用半巢式RT-PCR方法,克隆了FMDV O/NY00株的部分5’UTR、L 基因、P2 和P3 区。发现在其基因组假结区中存在4 个保守的假结结构,而Cathay 拓扑型毒株在相应区域仅有3 个假结,推测这是一个区分ME-SA 拓扑型的PanAsia 株和Cathay 拓扑型毒株的遗传标记。O/NY00 株的IRES、L和3A 基因与O/TAW/97、O/AKESU/58 和O1/Kauf/66 株的同源性较低,而与O/SKR/2000 株的同源性较高。O/NY00 株的3A 基因没有缺失。研究结果为阐明FMDV 致病机理,开发新型疫苗和诊断试剂奠定了基础。 利用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统,对FMDV 3ABC 基因截短体进行了表达。表达的目的蛋白以二聚体形式存在,能分泌到上清中,占上清可溶蛋白的14%。Western Blot 检测证实其可被抗3ABCt多抗识别。 将FMD 重组鸡痘病毒(vUTAL3CP1、vUTA2-OAT)和重组DNA疫苗(pVIRIL18P1、pVRI-OAT)以不同组合方式免疫豚鼠、猪和牛,然后对其诱导的体液和细胞免疫水平进行了检测。结果表明,4 种基因工程疫苗均能诱导免疫动物产生特异性的体液及细胞免疫应答,并具有较好的强毒攻击保护作用。其中以vUTAL3CP1 两次免疫,pVRI-OAT/vUTA2-OAT 联合免疫效果最佳。该结果为进一步的大动物攻毒保护试验奠定了基础。

关键词： 发行制度改革   农村金融改革   无线增值服务   高温超导电缆   基因工程疫苗   美元   本位币   新等位基因   风险基金   创业基金   华友世纪   国际标准组织   人类白细胞抗原   创业投资基金   农村信用社改革   IPO   帕金森氏症   资讯  

关键词： 基因工程疫苗   基因枪   免疫应答   疫苗生产   禽腺病毒   核心自主知识产权   融合蛋白   蛋白质   类病毒颗粒   生物可降解材料   结直肠癌   二期临床试验   随机盲法对照临床试验   益绿素  

摘要： 2005-A-135我国首个基因工程戊型肝炎疫苗进入临床试验我国首个拥有核心自主知识产权的基因工程疫苗——戊型肝炎疫苗.目前正式获准进入一期、二期临床试验,该疫苗有望成为世界上继乙肝疫苗之后的第二个基因工程病毒疫苗。一期试验是将疫苗注入人体内,观察是否有不良的反应,二期继续扩大样本观察安全性,并观察注射戊肝疫苗的人是否能产生抗体。一、二期临床试验大概需要一年时间。如果顺利通过的话,科研人员将进入三期保护性试验,观察疫苗在更大使用人群中对疾病的实际预防效果。戊肝疫苗有望在2006年底上市。从该疫苗保护性抗原表位的发现、类病毒颗粒的获得,到最终疫苗生产工艺的建立等一系列最关键的发现和技术均由项目组自主完成,从而使该疫苗成为我国拥有核心自主知识产权和高度垄断性的源头创新性生物药物。目前,该疫苗已经在美国、欧盟、日本、韩国、印度等国家和地区申请了发明专利。

关键词： 囊虫病   疫苗侯选基因TSOL18   毕赤酵母诱导表达   免疫效果  

摘要： 囊虫病（Cysticercosis）是由猪带绦虫（Taenia solium）的幼虫—猪囊尾蚴（Cysticercus cellulosae）感染猪或人而引起的人畜共患寄生虫病。是联合国卫生组织列为需要根除的六大疾病之一。目前,研制有效的猪囊虫疫苗来控制和消除流行于世界各地的囊虫病是世界各国普遍关注的焦点。 本研究从孵化并激活的猪带绦虫六钩蚴中提取总RNA,利用RT-PCR技术在国内首次克隆了猪带绦虫六钩蚴疫苗侯选基因TSOL18基因。选用近年来发展最快和最具潜能的真核表达系统-毕赤酵母,构建了重组表达载体pPIC9K-TSOL18,电转化毕赤酵母菌种GS115,并用G418抗性梯度筛选法,获得多拷贝重组菌株。对重组菌株用甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明,诱导表达的培养上清中表达出大小为12ku和16ku具有反应活性的重组蛋白。用糖苷内切酶H（Endo-H）对TSOL18蛋白分析后表明,目的蛋白进行了适度的糖基化修饰。通过对发酵条件如pH、温度和溶氧水平等的调整,重组毕赤酵母在5L发酵罐高细胞密度发酵中表达量达2.54g/L,用薄层扫描分析,目的蛋白约占培养上清蛋白总量的80%以上。 在猪带绦虫疫苗研究中,首次应用具有天然蛋白特性的真核表达产物进行动物保护试验。将TSOL18重组抗原与206佐剂结合,制成猪囊虫基因工程疫苗,对猪作了两批免疫试验。试验一中,重组抗原在用206作为佐剂的基础上,分别加上细胞因子（IL-4和IFN-γ）和CpG DNA作为免疫增强剂免疫仔猪,在免疫后15 d攻虫感染。在实验二中,加大了重组抗原TSOL18的免疫剂量,且选择在抗体水平较高时攻虫感染。结果显示,试验各组抗体水平在免疫后15d就呈强阳性,40d达到峰值,而且可保持抗体阳性达150d左右。从免疫保护效果来看,试验一中,TSOL18+206佐剂组减虫率仅为70%,远远低于粗制抗原组;而在试验二中,TSOL18+206佐剂组减虫率高达94%,高于粗制抗原组（89%）。这表明用毕赤酵母表达的猪带绦虫六钩蚴重组抗原疫苗具有广阔的推广应用前景,有望成为预防猪囊虫病的一种新型生物制剂。 用pcDNA3.1/IFN-γ重组质粒作为猪囊虫重组抗原免疫增强剂,抗体检测结果没有明显升高,但免疫猪后淋巴细胞增殖非常明显,并明显增强了疫苗的保护效果,该组免疫猪减虫率高达91%,与粗制抗原免疫组相同。而用pcDNA3.1/IL-4和pUC18/CpG作为免疫增强剂,虽然明显增强了疫苗的抗体水平,但免疫猪淋巴细胞增殖不太明显,且对免疫保护作用也没有明显的增强作用,两组减虫率分别为68.7%和67%,远远低于粗制抗原免疫组。说明IFN-γ对猪带绦虫六钩蚴TSOL18重组抗原具有疫苗增强效应,这为以后选择猪囊虫疫苗的免疫增强剂提供了理论依据。

关键词： 饲料厂   畜牧处   加工厂   进口鱼粉   基因工程疫苗   奶业发展   喹乙醇   兽医卫生监督检验所   兽药残留   禽流感病毒   流感病毒群   农业科技创新体系   仔猪配合饲料   中国农业大学   脱脂鱼粉   海南省农业厅   四川省   养猪企业   兽药管理条例   沙门氏菌  

关键词： 精子蛋白SP22   基因工程表达   镍离子亲和层析   抗体   分布与定位  

摘要： 1997年,klinefelter GR报道硝基咪唑类及其衍生物影响大鼠的生育力。进一步分析发现这类化学物质使得大鼠精子表面的一种蛋白脱落,导致精子活力不足。klinefelter GR将之命名为精子蛋白SP22(sperm protein 22)。SP22是广泛表达的蛋白,在各组织中均有表达。在不同物种中均存在同源蛋白,且同源性极高。与人的致癌基因DJ1,转录因子RS同源性均在90%以上。与大鼠精子基因CAP1为同一基因。SP22的广谱表达,及在各物种中的极高同源性说明SP22是由一持家基因编码,对生命活动至关重要,所以在长期进化中其序列得以高度保守。 SP22蛋白具有多种功能。SP22抗体在大鼠体内外均能在卵子透明带水平上阻断精子与卵子的结合。推测SP22直接参与顶体反应。蛋白结构研究显示SP22是一种酶,它能酶解卵子透明带帮助精子穿入卵子。SP22与致癌因子DJ1的极高同源性也说明SP22是种酶。存在于脑中的DJ1参与抗氧化机制。DJ1可与脑中具有氧化性的代谢产物结合并分解。DJ1的突变使得脑中的氧化物过多积累便导致疾病的发生。DJ1的一个氨基酸突变可直接引起早年型帕金森的发生。SP22与转录因子RS极其相似,存在于核内外。在有丝分裂时部分SP22转入核内。但它不具有核内定位序列,由其它核内蛋白带入。在核内间接结合于核酸核蛋白RBS上。SP22可能是一个调节因子而并不是转录因子,参与细胞增殖过程。它与ras因子结合时具有强致癌活性,能导致大鼠NIH3T3细胞癌变。 近年来对SP22研究渐深入,但仅限于以动物实验阶段,针对人睾丸中SP22及在男性生殖系统中的分布定位分析国内外未见相关报道。因此本实验研究以人睾丸组织中的SP22基因为研究对象,通过RT—PCR进行cDNA克隆,导入克隆T载体进行DNA测序。所测得序列与大鼠及相关同源性基因进行比较分析。所得基因正是人源SP22基因,进一步证明SP22在进化过程中具有高度保守性。将大量扩增所获得的人睾丸SP22基因亚克隆到表达载体pET-28(a)、pHIL-S1中,导入基因工程菌大肠杆菌BL21、毕赤氏酵母GS115进行体外表达。分别在重组大肠杆菌包涵体沉淀,重组酵母菌培养液上清中检测出所表达的外源蛋白。将表达出的蛋白进行纯化。原核与真核表达的重组蛋白N端都带有6个组氨酸的His-tag(+),通过镍离子亲和层析纯化。再对所得蛋白进行鉴定分析。比较分析

关键词： 猪2型圆环病毒   ORF2基因   表达   ELISA方法   重组伪狂犬病病毒   二价基因工程疫苗:免疫原性  

摘要： 猪2型圆环病毒（PCV2）是近年来新发现的动物病毒之一,该病毒与猪的多种疾病综合征有关,特别是仔猪断奶后多系统衰竭综合征,该病最早于1991年在加拿大西部发现,其临床症状主要表现为进行性消瘦、呼吸道症状、发热、苍白及黄疸等,病原学及血清学调查表明,该病在许多国家都广泛存在,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。为了了解PCV2在我国的流行现状以及研制安全、高效的疫苗用于PCV2感染的防制,本研究对PCV2 ELISA诊断方法及PCV2-PRV二价基因工程疫苗进行了研究,主要研究内容如下: ***2 ORF2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 采用PCR方法从包含PCV2全基因组的重组质粒pT-PCV中扩增PCV2 ORF2基因的完整编码区,将其克隆到pMD18-T载体后,构建了重组质粒pTORF2,经序列测定证实,该基因未发生任何碱基突变。已有报道证实ORF2蛋白N端41 aa是其在细胞内的核定位信号,为了克服全长ORF2基因在大肠杆菌中表达时表达量低或不表达的缺陷,我们采用酶切方法截去了ORF2基因5’-端的部分核定位序列,并对截短后的ORF2片断进行了表达。具体方法是用BalI和SalI双酶切pTORF2,回收含ORF2基因的小片段,并将其插入pGEX-KG原核表达载体的SmaI和SalI位点之间,构建原核表达质粒pGEX-ORF2,将该质粒转化*** BL21,经IPTG诱导后GST-ORF2融合蛋白得到了表达,大小与预期结果相符,且表达蛋白可与PCV2标准阳性血清反应,具有免疫学活性。 ***2 ELISA诊断方法的建立及应用 SDS-PAGE分析表明,GST-ORF2融合蛋白在细菌裂解液的上清及沉淀中均存在,但主要位于裂解液的上清中,因此我们采用两种方法分别对沉淀和上清中的融合蛋白进行了提取。对于沉淀中的包涵体,我们选用十二烷基肌氨酸钠（SKL）对包涵体进行溶解,并通过TE（pH8.0）透析复性获得有活性的融合蛋白。对于上清中的可溶性蛋白,我们采用谷胱苷肽琼脂糖凝胶进行纯化,结果表明用该方法提取的融合蛋白纯度很高,但获得量较低。 为了确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数,我们对GST-ORF2可溶性蛋白和包涵体蛋白分别进行了方阵滴定,结果表明可溶性蛋白与标准阴、阳性血清的非特异性反应较低,更适宜用作诊断抗原。但考虑到包涵体蛋白提取费用低,且在对阴、阳性血清进行稍高倍数稀释时可以降低非特异性反应,从而达到与可溶性蛋白相当的诊断效果,因此我们选用GST-ORF2包涵体蛋白为ELISA方法的包被抗原。按照方阵滴定确定的抗原最佳包被浓度（1.23μg/mL）包被酶标板,建立PCV2 ELISA诊断方法,并对其进行了特异性、重复性和稳定性试验,结果表明该方法特异性、重复性良好,且在4℃可以保存至少12个月。与PCV2间接免疫荧光试剂盒的对比

关键词： 杆状病毒-昆虫细胞表达系统   人源化氨基末端脂多糖结合蛋白(NH-LBP)   脂多糖结合蛋白   基因工程抗体   单链抗体   核糖体展示   嗜甲醇毕赤酵母细胞   生物学活性  

摘要： 背景: 内毒素血症(endotoxemia)是临床创(烧)伤病人最常见的并发症之一。LPS是G细菌细胞壁外膜的主要成分,当细菌死亡时LPS释放入血,由肝细胞产生的LBP将其传递给靶细胞膜上的CD14(mCD14)或血液循环中的可溶性CD14(sCD14),三者形成LPS/LBP/CD14三联复合体,再经过TLR4-MD2-MYD88跨膜受体识别复合物向靶细胞内传递信号,促使胞浆内的NF-κB易位至胞核,导致一系列转录因子的活化,进而释放大量炎性介质和细胞因子,诱发全身炎症反应综合征(SystematicInflammatory Response Syndrome,SIRS)、多器官功能不全综合征(Multiple OrganDysfunction Syndrome,MODS)。在生理状态下循环血液中只有5—10μg/ml的LBP,在内毒素血症时LBP的浓度可以增高10倍左右,低浓度的LBP可将LPS与CD14的结合放大3-4个数量级。经定点突变以及LBP衍生肽的竞争性抑制研究,提示LBP结合LPS的位点定位于LBP氨基末端部分的第91-100位氨基酸残基。因此推测阻断LBP与LPS的结合有可能中断或减弱LPS活化靶细胞的效应,能够阻断这种保留与LPS结合序列的截断型人氨基末端LBP(NH-Lipopolysaccharide bmdmg protein,NH-LBP)的抗体对全长LBP可能具有同样的阻断效应。 目前针对拮抗LBP的研究如动物源性的单克隆抗体,小分子多肽等还处于实验室阶段,研究结果显示动物源性的抗体存在以下局限性:制备工艺复杂,难以大量生产;杂交瘤细胞的稳定性较差;容易产生人抗鼠抗体(HAMA);难以制备融合蛋白等。全长抗体由于分子量较大,在组织内的渗透性较差,从血液循环中清除速度慢。近年来随着分子生物学和分子免疫学的迅速发展出现了基因工程抗体,使人们得以对动物源性的单克隆抗体进行改造,构建人鼠嵌合抗体或全人源化抗体,而且抗体的形式也多样化如scFv,dsFv,双功能抗体,Fab’,Fab’和miniantibody等。基因工程抗体既可从杂交瘤细胞中制备,也可从未经免疫的脾淋巴细胞或人外周血单核细胞中产生:可

关键词： 肠出血性大肠杆菌(EHEC) O157:H7   小鼠感染模型   紧密粘附素   志贺毒素ⅡB 亚单位   肠出血性大肠杆菌溶血素   疫苗  

摘要： O157:H7 大肠杆菌是肠出血性大肠杆菌(EHEC)的一个主要血清型,感染该菌可使人患腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagic colitis,HC),也可引发溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome , HUS) 及血栓形成性血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP)等严重并发症,严重者可导致死亡。EHEC O157 的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性和抗生素治疗可加剧病情的危险性等特点,已经成为全球性的公共卫生问题。目前EHEC O157:H7 的全基因组测序已经完成,然而目前对其感染仍缺乏有效的防治方法,研究证明抗菌药物可促使菌体破坏,释放志贺毒素增加,从而使并发HUS 的危险性增加。因此,寻找有效的针对性防治方法如疫苗对防治O157:H7 的感染有着极其重大的意义。人类同病原微生物长期斗争的历史表明,疫苗是预防和抑制传染病的有力武器。由于O157 的暴发流行和治疗上的困难,疫苗研究就显得尤其紧迫。 为了评估疫苗的保护效果,建立一个与人类病变相似的动物模型极为重要。对于O157 菌,其易感动物为牛、羊、猪等大型哺乳动物,不适合实验室应用;而小型实验动物如大鼠、小鼠等都不是O157 菌的天然易感动物,须降低其对O157 的抵抗力或增强O157 对其的致病力,才有可能建立相应的动物模型。 目前已公认的与EHEC 致病性有关的致病基因主要有eae 基因、stx 基因、溶血素hly 基因还有III 型分泌蛋白EspA、B、D 等。紧密粘附素(Intimin)介导细菌与肠上皮细胞的紧密粘附,是O157 最主要的定植因子,尤其是它的约C 端1/3 部分(Intimin-C)为胞外功能区,与相应受体结合,且具有良好的免疫原性和免疫保护性,是理想的疫苗备选抗原之一。 EHEC O157可以产生两种志贺毒素,志贺毒素Ⅰ(Stx1)和志贺毒素Ⅱ(Stx2)。其中Stx2为分泌型表达,由1个A亚单位和5个B亚单位组成,A亚单位具有细胞内毒性,能与28S rRNA作用从而抑制蛋白质合成,是大肠杆菌O157:H7引起临床表现的病理基础;B亚单位具有细胞结合特性,能与具有特定受体(Gb3)的细胞结合,从而引导A亚单位发挥作用。多数O157:H7细菌产生Stx2,与溶血性尿毒综合征(HUS)及血栓形