关键词： 基因工程菌   人乙型肝炎病毒   核糖核酸酶H基因   优化表达   抗体   单克隆   分离和提纯   HBV-RNAseH区重组蛋白   小鼠  

摘要： 目的:利用基因工程技术,分别构建含HBV/RNAse H1及H2基因的原核表达载体pGSTag,并转化到大肠杆菌,诱导表达出目的蛋白后,用原核表达产物作为抗原,制备单克隆抗体,并对抗单克隆抗体血清型进行初步分析鉴定,为临床应用奠定基础。 方法:本研究采用摇瓶发酵,将重组质粒pGSTag/HBV/RNAseH1及H2分别转化BL21(DE3)codon plus(?)-RP、HB101、BL21(DE3)PlysS、G1727、DH5α、BL21大肠杆菌。同时用不同的培养基(LB、SOB、SOC、TB、2YT、M9)、不同的初始菌浓度(即OD为0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2)、不同的诱导时间(2.0h,4.0h,6.0h)、初始pH(6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5)以及不同的IPTG诱导浓度(0.1,0.3,0.6,1.0,2.0,3.0mmol/L),分别表达重组蛋白,并将重组菌与空白菌作生长曲线对比,收集菌体,初步纯化,菌液(0.5ml)经离心洗涤后,进行SDS-PAGE分析,并用FR-200紫外可见分析装置、复日smart view 2001生物电泳图象分析系统分析pGSTag/HBV-RNAseH1及H2蛋白表达量,同时进行Westerblot印迹分析。并以

关键词： 嵌合基因   病毒样颗粒   人乳头瘤病毒   沙眼衣原体   尖锐湿洗   基因克隆   基因工程疫苗  

摘要： 目的：1.利用人乳头瘤病毒(HPV)主要结构蛋白L1能自组装形成病毒样颗粒(VLPs)，并可作为抗原释放载体的特点，构建HPV/CT-MOMP249-268 CTL细胞表位的嵌合基因，并在真核表达系统昆虫细胞内表达该嵌合蛋白，为进一步研究其血清学、免疫原性以及制备HPV/CT嵌合疫苗奠定了基础。2.预测并筛选沙眼衣原体(CT)主要外膜蛋白(MOMP)T、B细胞表位，构建CT-MOMP多表位的嵌合基因，并在原核表达系统大肠杆菌内表达该多表位基因的嵌合蛋白，为研究CT亚单位疫苗打下了基础，并为进一步以HPV L1为载体，研究HPV/CT多表位嵌合疫苗作准备。 结论：1.成功地在真核细胞表达系统中表达了嵌合蛋白HPV6bL1/CT-MOMP249-268，并形成病毒样颗粒。2.成功构建了重组原核表达质粒pET32a(+)/CT-MOMP165。3.在原核细胞表达系统内表达了CT-MOMP多表位嵌合蛋白。4.重组嵌合蛋白在昆虫细胞和大肠杆菌中的表达为HPV/CT嵌合基因工程疫苗的研制提供了理论基础和实验依据。

关键词： 力达霉素   调节基因   sgcR3   抗Ⅳ型胶原酶   单链抗体   scFv  

摘要： 本课题利用同源双交换的方法将力达霉素辅基蛋白与抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv的融合基因取代力达霉素生物合成基因簇中的辅基蛋白基因(cagA)，为了保持两个基因编码的蛋白质的生物活性，在两个基因之间用编码GGGGS五肽的DNA序列连接。成功地构建了融合Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv的力达霉素工程菌株，并且利用PCR的方法对工程菌株进行了验证。抑菌活性实验显示其发酵产物有一定的抑菌活性，SDS-PAGE结果显示工程菌株不再产生辅基蛋白。初步结果表明重组菌株可产生与抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv融合的力达霉素。

关键词： 禽流感病毒   基因工程抗体   Fab  

摘要： 禽流感(avian influenza)是由A型流感病毒引起的一种禽类感染或疾病综合症。禽流感病毒属正粘病毒科(Orthomyxoviridae),为单股负链RNA病毒。甲型流感病毒除感染人外,还可感染猪、马、海洋哺乳动物和禽类。此病毒极易在禽鸟间散播,除可引起家禽大量死亡外,也可引起感染人的死亡。因此,禽流感病毒是一种危害禽类和人类健康的重要病原微生物。 对鸡源抗禽流感病毒抗体的研究不仅对疾病的预防和治疗有一定的作用,而且对进一步研究病毒在体内的致病机制提供了有利的工具。 我们首次运用噬菌体抗体库技术构建鸡源抗禽流感病毒Fab噬菌体抗体库。首先,我们从免疫鸡中提取外周血和脾脏,分离淋巴细胞,提取细胞总RNA,以其为模板,采用Oligo-dT引物逆转录合成cDNA,用一组鸡IgG Fab特异性引物,通过PCR方法扩增出一组抗体轻链基因和重链Fd片段基因。将抗体轻链基因克隆入pComb3噬菌粒载体,转化大肠杆菌XLI-Blue构建了库容量为2.5×10的轻链基因抗体库,轻链基因的克隆效率约为50%。进一步将抗体重链Fd基因克隆入轻链抗体库中,转化大肠杆菌,构建了库容量为1×10的鸡源抗禽流感病毒Fab抗体库。经鉴定,抗体轻、重链基因的克隆效率为40%。经辅助噬菌体感染,得到噬菌体滴度1×10CFU/ml的鸡源噬菌体抗体库。用固相化AIVAg,对所构建的噬菌体抗体库进行了五轮的富集,第五轮洗脱下的噬菌体较第一轮增加了100倍,含有抗体轻链基因和重链Fd基因的克隆,也由富集前的15%增至65%。挑取几个阳性克隆进行测序,获得的序列与GeneBank相应的鸡IgG基因序列具有较高的同源性。 鸡源抗禽流感病毒Fab噬菌体抗体库的构建成功为抗禽流感病毒特异性抗体的筛选及构建鸡源抗禽流感病毒全抗体库打下了良好的基础,并为进一步研制用于禽流感治疗和抗禽流感病毒单抗制剂奠定了基础,同时也为研究禽流感病毒的体内致病机制提供了条件。

关键词： 基因工程疫苗   头孢噻呋钠   用药指南   鸡传染性法氏囊病   鸡传染性腔上囊炎   兽用新生物制品   进口兽药   兽药管理条例   泰妙菌素   支原净   合成肽疫苗   氯前列醇钠   猪口蹄疫  

关键词： 肌肉抑制素   疫苗   多克隆抗体   乙肝核心抗原   骨骼肌   出生重   甲状腺素  

摘要： 肌肉抑制素（Myostatin,MSTN）特异性表达于肌肉组织,属于TGF-β超家族,是调控肌肉生长和发育的最重要的负调控因子,并同多种疾病有关。为获得MSTN蛋白,制备多克隆抗体,深入了解MSTN基因的调控机理,将MSTN基因片段克隆入组氨酸标签融合的表达载体pET-30a-c（+）中,IPTG诱导,利用金属螯合亲和层析（MCAC）进行纯化,薄层扫描及Bradford法检测纯化蛋白的纯度与含量;免疫家兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting印迹检测抗体特异性。经表达形式分析证明,融合蛋白大部分为包涵体,薄层扫描分析表明纯化蛋白纯度可达90%以上,Bradford法检测蛋白浓度约5mg/ml。抗血清效价可达1:250000以上,Westernblotting印迹检测证明抗体特异性良好。结论:经诱导表达及纯化制备出纯度较高的MSTN蛋白产物,并获得高效价特异性良好的多克隆抗体。 MSTN由骨骼肌表达进入血液以后,以自分泌或旁分泌的方式作用于骨骼肌,抑制骨骼肌的发育,而阻断MSTN作用途径可以显著增强肌肉发育。为探讨利用重组MSTN蛋白阻断体内MSTN作用途径,增强肌肉发育的可能性,本研究在体外成功表达并纯化了MSTN蛋白的基础上,将纯化后的MSTN蛋白同佐剂充分混合后,免疫雌性昆明白小鼠。第三次加强免疫后第三天同雄鼠合笼。研究结果表明,免疫后对照组和实验组母鼠体重差异不显著;在妊娠后期,两组之间体重出现差异,而分娩后,这种差异消失。仔鼠出生重在两处理组中差异极显著,实验组仔鼠出生重较对照组增加25.8%左右,但在生长阶段,两组间体重差异有逐渐减少的趋势。结论:应用重组MSTN蛋白免疫母鼠可以显著提高初生仔鼠体重。 应用重组MSTN蛋白免疫小鼠可以诱导体内免疫反应,但由于MSTN在高等动物中高度保守,而且MSTN分子量较小,因而其抗原性也相应较弱。而乙肝核心抗原是重要的载体蛋白,具有很强的免疫原性,能以T细胞依赖和T细胞非依赖作用方式产生免疫反应,并显著增强其融合蛋白的抗原性。为进一步增强MSTN的抗原性,提高疫苗的免疫效果,本研究利用PCR方法获得了MSTN羧端片段,并将其分别与乙肝核心抗原的氨端、羧端或中间融合,构建了三个重组融合表达克隆:pET-30a-c（+）-SM/HBcAg（N）、pET-30a-c（+）-SM/HBcAg（C）和pE7-30a-c（+）-SM/HBcAg（M）,并经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21中实现了表达。利用金属螯合亲和层析（MCAC）进行纯化。本实验结果为进一步探讨MSTN同HBcAg的最佳融合位点,增强MSTN的免役原性奠定了基础。 MSTN对骨骼肌的分化具有重要作用,包括雄激素等多种物质可通过调节MSTN的表达而影响肌肉的发育。而甲状腺素对骨骼肌的发育也具有重要作用,为此,有必要阐明甲状腺素同MSTN的关系,为进一步提高疫苗的作用效果奠定基础。本研究以雄性成年Wistar大鼠为研究对象,探讨了不同甲状腺素水平对大鼠骨骼肌中肌肉抑制素表达的影响。方法:连续14日腹腔注射L-甲状腺素（20mg/100g体重）,制备高甲大鼠模型;以0.04%甲巯咪矬连续饲喂14日,制备低甲大鼠模型;以相同数量大鼠正常饲养,作为对照组。药物处理完毕后,分别以荧光定量实时PCR和Western blotting为检测方法,检测大鼠骨骼肌中肌肉抑制素在mRNA和蛋白水平表达的变化。结果表明:在高甲状态下,大鼠骨骼肌中肌肉抑制素在mRNA和蛋白水平的表达均有显著升高;而在低甲状态下其mRNA表达水平和蛋白表达水平也有所增高,但同高甲组相比增高程度稍低。

关键词： 猪瘟病毒   囊膜糖蛋白E2   A/D抗原区   间接ELISA   基因工程疫苗  

摘要： 利用反转录PCR(RT-PCR)技术扩增出猪瘟病毒石门株(CSFV Shimen strain)囊膜糖蛋白E2全基因,再以E2基因为模板扩增其中适于在***中表达且抗原性较好的基因片段(E2蛋白A/D抗原区基因序列),将扩增的两片段依次插入原核表达载体pET-32a(+)中,构建成重组质粒pET-E2和pET-2E2,将两质粒转化受体菌BL21(DE3),对转化重组菌用IPTG进行诱导表达并对诱导表达条件进行了优化,使目的蛋白得到高效表达。 应用His-bind树脂层析柱纯化重组2E2蛋白,纯化产物经SDS-PAGE电泳鉴定其纯化效果,并用Western-blot检验其特异性。在此基础上,利用重组2E2蛋白作包被抗原,优化反应条件后,建立了检测抗猪瘟病毒血清抗体的重组2E2蛋白—ELISA方法,应用该方法和间接血凝检测试剂盒对收集的120份血清进行检测,结果显示,间接ELISA方法与间接血凝检测方法相比具有更好的表现力。 本研究以猪IgG基因为模板,设计了一对引物,并应用PCR方法扩增出其中重链恒定区部分基因序列。将其克隆入pET-2E2中,构建成pET-2E2-scIgG重组质粒并对其进行诱导表达。取经纯化过的E2,2E2和2E2-scIgG重组蛋白分别免疫小白鼠,结果表明,三种蛋白均可刺激机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答,2E2-scIgG蛋白的免疫效果明显优于另两种蛋白,并且在所选的抗原区域可能存在一个或多个T细胞表位。

关键词： 禽类传染病  

关键词： 乳制品   感官质量   评鉴   奶制品   食品   产品出口企业   外向型企业   基因工程疫苗   热点聚焦  

关键词： 乙型脑炎病毒   伪狂犬病病毒   克隆   表达   E基因   NS1基因   重组病毒  

摘要： 乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)和伪狂犬病(Pseudorabies)均是危害养猪业的重大疫病,主要引起种猪繁殖障碍,给养猪业造成了巨大的经济损失。同时乙型脑炎还是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一,对人类危害巨大。猪是乙型脑炎病毒的主要扩增宿主和传染源,因此控制猪的乙型脑炎不仅对养猪业而且对人类健康都具有十分重要的意义。目前免疫接种仍是预防和控制这两种传染病最有效的措施,而现有乙型脑炎疫苗,无论是灭活疫苗还是弱毒活疫苗都存在一定的缺陷。鉴于此,本研究从乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株中扩增了其主要免疫原性基因E和E-NS1;实现了E基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中的高效表达;构建了表达乙型脑炎病毒主要免疫原性基因E或NS1的重组伪狂犬病病毒,并对所构建的重组伪狂犬病病毒的生物学特性、安全性及免疫原进行了研究。其具体研究内容包括: 1.乙型脑炎病毒E和E-NS1基因的克隆与序列分析 根据已报道的乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列,设计了2对引物,采用一步法RT-PCR扩增了其主要免疫原性基因E和E-NS1,并进行了克隆与序列测定。结果发现,与已报道的SA14-14-2疫苗株核苷酸序列比较,E基因的同源性为100%,E-NS1基因片段发生了3个核苷酸的改变,即1596 g-a、2639 t-c、2817 g-a,并导致了2个氨基酸的改变,即E207 G-R,NS114 G-S,而2639 t-c为无义突变。 2.E基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中的高效表达 将E基因RT-PCR产物克隆到pBlusecriptⅡSK(+)载体中,然后分别亚克隆到原核表达载体PGEX-KG和真核表达载体pcDNA3.1+中,筛选重组质粒,分别命名为pKG-E和pcDNA3.1E。pKG-E转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后获得高效表达,表达的融合蛋白分子量为83KD,主要以包涵体形式存在,Western blot分析证实表达产物具有良好的生物学活性。pcDNA3.1E采用脂质体法转染BHK-21细胞,48小时后收集转染的细胞处理后,进行SDS-PAGE电泳,经Western blot分析,在53KD处出现特异性反应带,而对照未出现特异性反应带,证实E基因在哺乳动物细胞中获得表达。 3.表达乙型脑炎病毒E或NSl蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建 设计1对引物从质粒pTNSl上扩增NSl基因,双酶切后将NSl基因定向插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体pgG-Uni中,得到重组转移载体pgG-NSl:用BamHl和EcoRI酶切pSK-E,回收E基因后与经相同酶切的载体pgG-Uni相连,得到重组转移载体pgG-E。将重组转移载体用KpnI线性化后分别与经EcoRI酶切消化的PRV Ea TK/gG/LacZ突变株基因组DNA共转染PK-15细胞,经空斑筛选纯化、PCR、Southern印迹、Western blot等鉴定,获得了2株纯化的重组病毒,分别命名为TK/gG/NS1和TK/gG/E。重组病毒部分生物学特性研究表明:本研究构建的2株重组病毒遗传稳定性良好:外源基因的插入不影响伪狂犬病病毒在细胞